CN103525802A - 一种肺炎克雷伯菌的固定化小球的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种肺炎克雷伯菌固定化小球的制备方法，包括：（1）制备肺炎克雷伯菌的菌悬液；（2）制备固定化载体混合水溶液；（3）将上述菌悬液和固定化载体混合水溶液混合后搅拌均匀后，-5～5℃下用注射器滴加到不断搅拌的CaCl2溶液中，形成2-3mm的固定化小球，固化交联5～6h后用生理盐水冲洗4～5次，即得肺炎克雷伯菌固定化小球。本发明的制备方法简单，得到的肺炎克雷伯菌固定化小球可用于氨氮废水处理。

Description

一种肺炎克雷伯菌的固定化小球的制备方法
技术领域
本发明属于微生物固定化技术领域，特别涉及一种肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）的固定化小球制备方法。
背景技术
随着近些年水体富营养化现象的加剧，脱氮成为废水处理研究中的重要课题。在废水生物处理系统中，主要是利用微生物的硝化-反硝化作用来去除废水中氨氮对环境的污染，其中硝化作用是由亚硝酸菌和硝酸菌来共同完成，首先亚硝化菌将氨氮转化为亚硝态氮，然后硝酸细菌将亚硝态氮转化为硝态氮，完成整个硝化过程。在此过程中，氨氮的去除是废水处理中的重要一环，因此亚硝酸细菌的硝化作用是脱氮过程中决定后续反应速率的进行，控制着硝化作用的整个过程。
微生物固定化技术直接从固定化酶技术衍生而来，为完善和提高游离微生物体系性能而发展起来的。它是通过一定的技术手段将菌体固定在载体上，避免菌体流失，以提高菌体的去除效率为目的的一种处理方式。固定化微生物的制备方式一般可以分为共价结合法、交联法、吸附法和包埋法。目前，在有关固定化硝化细菌处理废水的研究中，一般采用聚乙烯醇(PVA)和海藻酸钠(SA)作为固定化载体材料，而采用聚乙二醇(PEG)和海藻酸钠(SA)作为固定化载体材料却鲜少报道。聚乙二醇无毒、无刺激性，具有良好的水溶性，并与许多有机物组份有良好的相溶性。在化妆品、制药、化纤、橡胶、塑料、造纸金属加工及食品加工等行业中均有着广泛的应用。海藻酸钠是一种天然多糖，具有药物制剂辅料所需的稳定性、溶解性、粘性和安全性。将二者混合后作为固定化复合载体材料，有利于提高固定化小球的含水率以及支架孔径。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种肺炎克雷伯菌的固定化小球的制备方法，该方法通过用肺炎克雷伯菌制备菌悬液、以聚乙二醇和海藻酸钠作为复合载体，制备了肺炎克雷伯菌固定化小球，该固定化小球可用于氨氮废水处理。
本发明的一种肺炎克雷伯菌固定化小球的制备方法，包括：
（1）菌悬液制备
将肺炎克雷伯菌接种于液体富集培养基中，摇床培养后得到对数生长期的菌体，离心后，弃去上清液，将菌体用生理盐水洗涤，反复离心4～5次，用生理盐水稀释后得到菌悬液；
（2）复合载体的制备
将聚乙二醇和海藻酸钠加入去离子水中，高温灭菌后使其完全溶解后，冷却到28～32℃，得到固定化载体混合水溶液，作为复合载体；
（3）肺炎克雷伯菌固定化小球的制备
将上述菌悬液和固定化载体混合水溶液混合后搅拌均匀后，-5～5℃下用注射器滴加到不断搅拌CaCl2溶液中，形成2-3mm的固定化小球，固化交联5～6h后用生理盐水冲洗4～5次，即得肺炎克雷伯菌固定小球，4℃低温保存备用。
步骤（1）中所述的摇床培养的温度为30℃，时间为24h。
步骤（1）中所述的离心为于7000r/min离心15min。
步骤（2）中所述的聚乙二醇、海藻酸钠和去离子水的用量比为6g：4g：100mL。
步骤（2）中所述的高温灭菌具体操作为于121℃，105～110kPa灭菌20min。
步骤（3）中所述的菌悬液与固定化载体混合水溶液的体积比为1:1。
步骤（3）所得到的肺炎克雷伯菌固定化小球的粒径范围为2～3mm。
步骤（3）所得到的肺炎克雷伯菌固定化小球应用于氨氮废水处理。
本发明中，聚乙二醇和海藻酸钠作为复合包埋材料固定化肺炎克雷伯菌，以CaCl2溶液作为交联剂，生理盐水作为表面处理剂来制备肺炎克雷伯菌固定化小球。
本发明的肺炎克雷伯菌固定化小球可用于氨氮废水处理，处理条件是固定化小球在30℃，转速150r/min摇床中，投入氨氮模拟废水中培养7d，每隔24h取样测定氨氮含量,经过7d的降解，氨氮含量由最初的10mg/L降解到1.55mg/L，去除率为84.5%。
本发明中所述的肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）已于2013年9月13日保藏至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC NO.8182。
有益效果：
本发明的制备方法简单，得到的肺炎克雷伯菌固定化小球可用于氨氮废水处理。
附图说明
图1是含肺炎克雷伯菌的复合载体固定化小球外型照片；
图2是含肺炎克雷伯菌的复合载体固定化小球的表面在3000倍下的电镜照片；
图3是含肺炎克雷伯菌的复合载体固定化小球的断面在100倍下的电镜照片。
图4是含肺炎克雷伯菌的复合载体固定化小球的断面在500倍下的电镜照片。
图5固定化小球处理氨氮的效果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
菌株的分离鉴定
从上海松江污水处理厂的活性污泥中，通过初筛及复筛得到一株亚硝化菌。通过16SrDNA序列测定和分析比较，该菌株与肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）的同源率达98%，确定该菌株为肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）。
肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）16S rDNA序列如下：
GATGGGGGGCAGTCTACACATGCAAGTCGAGCGGTAGCACAGAGAGCTTGCTCTCGGGTGACGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTAGCTAATACCGCATAATGTCGCAAGACCAAAGTGGGGGACCTTCGGGCCTCATGCCATCAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTAGTAGGTGGGGTAACGGCTCACCTAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTCAGCGGGGAGGAAGGCGGTGAGGTTAATAACCTTGTCGATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTCTGTCAAGTCGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTCGAAACTGGCAGGCTAGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACAAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCGATTTGGAGGTTGTGCCCTTGAGGCGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAATCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGTCTTGACATCCACAGAACTTACCAGAGATGCATTGGTGCCTTCGGGAACTGTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGGGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCACCTTATCTTTTGTTGGCCAGCGGTTCCGGCGGGACTTCAAAGGAACTGCCAGTGATAACTTGGAGAGGTGGGGGATGACGTCCAGGTCATCATGGCCTTACGAACAAGGCTACCCCGTGCTACATGCCCATATACAAAGGAGAAGTTGCATCCAAAGTGGTAAGCGCCCTCCCGAAGGTTAAGCTACCTACTTCTTTTGCAACCCACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGTAGCATTCTGATCTACGATTACTAGCGATTCCGACTTCATGGAGTCGAGTTGCAGACTCCAATCCGGACTACGACATACTTTATGAGGTCCGCTTGCTCTCGCGAGGTCGCTTCTCTTTGTATATGCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCTGGTCGTAAGGGCCATGATGACTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCAGTTTATCACTGGCAGTCTCCTTTGAGTTCCCGGCCGAACCGCTGGCAACAAAGGATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATTTCACAACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTCTCACAGTTCCCGAAGGCACCAAAGCATCTCTGCTAAGTTCTGTGGATGTCAAGACCAGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCATCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCATTTGAGTTTTAACCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGTCGATTTAACGCGTTAGCTCCGGAAGCCACGCCTCAAGGGCACAACCTCCAAATCGACATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCACCTGAGCGTCAGTCTTTGTCCAGGGGGCCGCCTTCGCCACCGGTATTCCTCCAGATCTCTACGCATTTCACCGCTACACCTGGAATTCTACCCCCCTCTACAAGACTCTAGCCTGCCAGTTTCGAATGCAGTTCCCAGGTTGAGCCCGGGGATTTCACATCCGACTTGACAGACCGCCTGCGTGCGCTTTACGCCCAGTAATTCCGATTAACGCTTGCACCCTCCGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGGAGTTAGCCAGGTGCTTCTTCTGCGGGTAACGTCAATCGACGAGGTTATTAACCTCATCGCCTTCTCCCCGCTGAAGTGCTTTACAGCCCGGAGCTTCTTCACACACGGCGGCATTGCTTGCATCAGCTGCGCCCATGGTGCAATATCCCCACTGCCTGCCTCCGTAGGAGTCTGGACGGTTTTCAGTCAGTGTGGCTGGTCCATCCTCTCCGAAACCGAGCCTT
实施例2
肺炎克雷伯菌固定化小球的制备
挑取肺炎克雷伯菌菌落，接种于通用富集培养基中，30℃培养24h后得到对数生长期的菌体，7000r/min离心15min，弃去上清液，将菌体用生理盐水洗涤，再次离心，得到菌悬液。
称取6g聚乙二醇和4g海藻酸钠加入100mL去离子水中，于120℃、105-110kPa灭菌20min至完全溶解。制得聚乙二醇和海藻酸钠的水溶液，冷却到30℃左右，作为复合载体。
量取体积比为1:1的上述菌悬液和复合载体溶液混合均匀，用注射器注射到CaCl2溶液中成球，冰浴，固化交联5-6小时后用生理盐水冲洗4-5次，4℃低温保存备用。
实施例3
固定化小球的活化
将低温保存的固定化小球用生理盐水洗涤4-5次，然后浸泡在生理盐水中，曝气10h已活化固定化小球，经活化后的固定化小球可用于氨氮废水处理。
实施例4
处理氨氮废水
肺炎克雷伯菌固定小球（实施例2制备）投加到氨氮废水中，在30℃、转速150r/min的摇床中培养7d，每隔24h取样测定氨氮含量，氨氮初始浓度为10mg/L，经过7天的处理，氨氮的浓度为1.55mg/L，去除率为84.5%。
Figure IDA0000401582740000011
Figure IDA0000401582740000021
Figure IDA0000401582740000041

Claims (8)

1.一种肺炎克雷伯菌固定化小球的制备方法，包括：
（1）将肺炎克雷伯菌接种于液体富集培养基中，摇床培养后得到对数生长期的菌体，离心后，弃去上清液，将菌体用生理盐水洗涤，反复离心4～5次，用生理盐水稀释后得到菌悬液；
（2）将聚乙二醇和海藻酸钠加入去离子水中，高温灭菌后使其完全溶解后，冷却到28～32℃，得到固定化载体混合水溶液；
（3）将上述菌悬液和固定化载体混合水溶液混合后搅拌均匀后，-5～5℃下用注射器滴加到不断搅拌的CaCl2溶液中，形成2-3mm的固定化小球，固化交联5～6h后用生理盐水冲洗4～5次，即得肺炎克雷伯菌固定化小球。
2.根据权利要求1所述的一种肺炎克雷伯菌固定化小球的制备方法，其特征在于：步骤（1）中所述的摇床培养的温度为30℃，时间为24h。
3.根据权利要求1所述的一种肺炎克雷伯菌固定化小球的制备方法，其特征在于：步骤（1）中所述的离心为于7000r/min离心15min。
4.根据权利要求1所述的一种肺炎克雷伯菌固定化小球的制备方法，其特征在于：步骤（2）中所述的聚乙二醇、海藻酸钠和去离子水的用量比为6g：4g：100mL。
5.根据权利要求1所述的一种肺炎克雷伯菌固定化小球的制备方法，其特征在于：步骤（2）中所述的高温灭菌具体操作为于121℃，105～110kPa灭菌20min。
6.根据权利要求1所述的一种肺炎克雷伯菌固定化小球的制备方法，其特征在于：步骤（3）中所述的菌悬液与固定化载体混合水溶液的体积比为1:1。
7.根据权利要求1所述的一种肺炎克雷伯菌固定化小球的制备方法，其特征在于：步骤（3）所得到的肺炎克雷伯菌固定化小球的粒径范围为2～3mm。
8.根据权利要求1所述的一种肺炎克雷伯菌固定化小球的制备方法，其特征在于：步骤（3）所得到的肺炎克雷伯菌固定化小球应用于氨氮废水处理。
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