CN113528501B

CN113528501B - 单细胞微凝胶的制备方法

Info

Publication number: CN113528501B
Application number: CN202110816764.8A
Authority: CN
Inventors: 孔湉湉; 张姗姗; 刘洲; 杜伟翔; 庄艳逢
Original assignee: Shenzhen University
Current assignee: Shenzhen University
Priority date: 2021-07-20
Filing date: 2021-07-20
Publication date: 2023-06-06
Anticipated expiration: 2041-07-20
Also published as: CN113528501A

Abstract

本发明涉及一种单细胞微凝胶的制备方法。该单细胞微凝胶的制备方法包括以下步骤：对交联剂进行处理，以使交联剂带正电荷，制备带有正电荷的交联剂，交联剂选自碳酸钙纳米颗粒及碳酸钡纳米颗粒中的至少一种；将带有正电荷的交联剂与细胞混合，制备吸附有交联剂的细胞；及将吸附有交联剂的细胞与海藻酸盐溶液混合反应，制备单细胞微凝胶。上述单细胞微凝胶的制备方法简捷且成本低。

Description

单细胞微凝胶的制备方法

技术领域

本发明涉及生物材料技术领域，特别是涉及一种单细胞微凝胶的制备方法。

背景技术

单细胞微凝胶(single-cell-laden microgels)是指仅包含一个被水凝胶基质包裹的细胞。单细胞微凝胶的凝胶层具有如下特点：(1)包裹于细胞外的凝胶层是一种生物半透膜，既可实现免疫隔离、防止大分子免疫物质和免疫细胞攻击，又允许代谢产物、小分子营养物及细胞活性物质自由出入微囊，这使得单细胞微凝胶在细胞治疗方面具有巨大优势。(2)凝胶层能够提供细胞生长所需要的三维结构以及生物兼容性良好的细胞基质(如水凝胶)等条件。相较于传统的二维单层细胞培养，三维细胞培养能更好地模拟体内条件，能更紧密地模仿复杂的细胞组织间相互作用以及在体内的微环境，为细胞的最佳生长、分化提供了一个合适的微环境，并有在体外创造组织样结构的能力。通过维持单个细胞的正常三维形状，有助于细胞与相邻细胞间形成复杂的相互作用和信号接收及发送，为不同类型的细胞培养创造一个更自然的生长环境。(3)凝胶层的存在使得单细胞微凝胶可以实现单细胞的分析，由于只包裹了一个细胞，可以进行精确的控制和分析，由细胞群体到单细胞的分析，排除细胞之间差异带来分析误差。另外，包裹单细胞的微凝胶还可以对细胞分泌物进行精确的测量，对单细胞的研究以及对细胞分泌物的应用具有巨大的意义。(4)单细胞微凝胶具有更高的表面体积比，在药物筛选上可以大大的提高药物筛选的效率和通量。

因此，单细胞微凝胶有望在药理学筛选、再生医学和基础生物学研究等生命科学应用中发挥作用。例如，可以利用单细胞微凝胶技术增强对血压的抵抗力，提高生存时间；可以利用凝胶层隔绝免疫抑制机制，防止免疫排斥反应的发生；并且，单细胞微凝胶具有足够小的尺寸，可以降低阻塞风险；另外，在单细胞的膜上修饰特殊物质，如抗原抗体，还可以进行靶向治疗。

目前，单细胞微凝胶主要利用微流控技术来制备，微流控技术虽然可以实现精确的单细胞包裹，但微流控技术中的所采用的微流控芯片是由精密的微阀、微泵以及几十微米的微管道加工组装而成，并且每片微流控芯片仅适合少量特定的细胞和特定场合使用，制造成本和使用成本高。

发明内容

基于此，有必要提供一种成本较低的单细胞微凝胶的制备方法。

一种单细胞微凝胶的制备方法，包括以下步骤：

对交联剂进行处理，以使所述交联剂带正电荷，制备带有正电荷的交联剂，所述交联剂选自碳酸钙纳米颗粒及碳酸钡纳米颗粒中的至少一种；

将所述带有正电荷的交联剂与细胞混合，制备吸附有交联剂的细胞；及

将所述吸附有交联剂的细胞与海藻酸盐溶液混合反应，制备单细胞微凝胶。

基于细胞表面带负电荷，能吸附带正电荷的物质，上述单细胞微凝胶的制备方法通过先对能与海藻酸盐进行阳离子交换而使其形成凝胶的交联剂进行处理，使得该交联剂带正电荷，从而带正电荷的交联剂与细胞混合后能吸附到细胞表面上，形成吸附有交联剂的细胞，然后将该细胞与海藻酸盐溶液的混合，使得交联剂中的阳离子与海藻酸盐中的阳离子发生离子交换而形成包裹于细胞表面的凝胶。上述单细胞微凝胶的制备方法不依赖于微流控技术，不用微流控芯片，且采用的原料均是容易获取且价格便宜的材料，成本较低。此外，上述单细胞微凝胶的制备方法操作简便，且对于被包裹的细胞的类型也没有特别限制，通用性好。

在其中一个实施例中，所述海藻酸盐为海藻酸钠；及/或，所述海藻酸盐溶液中海藻酸盐的质量浓度1为％～3％；

及/或，所述带有正电荷的交联剂在水中的电位为6mV～30mV。

在其中一个实施例中，所述制备带有正电荷的交联剂的步骤包括：

将所述交联剂、聚阳离子化合物和水混合，制备悬浮液；及

将所述悬浮液固液分离，弃液体，制备带有正电荷的交联剂。

在其中一个实施例中，所述制备悬浮液的步骤包括：

将所述聚阳离子化合物与水超声混合，制备聚阳离子溶液；及

将所述交联剂加入到所述聚阳离子溶液中并超声混合，制备悬浮液。

在其中一个实施例中，所述聚阳离子化合物选自聚乙烯亚胺、聚赖氨酸、羧甲基壳聚糖、壳聚糖季铵盐和聚赖氨酸盐酸盐中的至少一种。

在其中一个实施例中，所述交联剂的物质的量、所述聚阳离子化合物的质量和所述水的体积之比为(0.0329mmol～0.0989mmol)：(0.6mg～2.2mg)：1mL。

在其中一个实施例中，所述交联剂的物质的量与吸附所述交联剂之前的细胞的密度之比为(0.0329mmol～0.0989mmol)：(1～2.25)×10⁶个/mL。

在其中一个实施例中，在将所述带有正电荷的交联剂与细胞混合的步骤中，所述细胞为第一荧光标记物标记的细胞；所述海藻酸盐溶液中含有第二荧光标记物标记的海藻酸盐，所述第二荧光标记物与所述第一荧光标记物发出的荧光不同。

在其中一个实施例中，所述制备吸附有交联剂的细胞的步骤包括：

将所述带有正电荷的交联剂与细胞混合均匀，制备混合物；

将所述混合物静置后加入培养基培养，以使所述混合物中的所述细胞贴壁生长；及

在所述细胞贴壁之后弃培养液，并消化贴壁后的细胞，制备所述吸附有交联剂的细胞。

在其中一个实施例中，在所述将所述吸附有交联剂的细胞与海藻酸盐溶液混合反应的步骤中，混合反应的时间为30分钟～40分钟。

附图说明

图1为一实施方式的单细胞微凝胶的制备方法的流程示意图；

图2为实施例1中未包裹凝胶的细胞的电镜图；

图3～图8为实施例中制备的单细胞凝胶；

图9～图11为实施例2中制得的单细胞微凝胶；

图12～图14为实施例3中制得的单细胞微凝胶；

图15～图17为实施例4中制得的单细胞微凝胶；

图18～图20为实施例5中制得的单细胞微凝胶；

图21～图23为实施例6中制得的单细胞微凝胶；

图24～图27为实施例12中制得的单细胞微凝胶；

图28～图30为实施例17中制得的单细胞微凝胶。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使本发明公开内容更加透彻全面。

此外，术语“第一”、“第二”等仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

请参阅图1，本申请一实施方式提供了一种单细胞微凝胶的制备方法，该制备方法包括步骤S100、步骤S200和步骤S300。

步骤S100：对交联剂进行处理，以使交联剂带正电荷，制备带有正电荷的交联剂。

细胞表面带负电荷，可以吸附带正电荷的物质。通过将交联剂进行处理，使得交联剂带上正电荷，进而在带有正电荷的交联剂与细胞混合后，由于静电吸引的作用，细胞表面吸附上交联剂。具体地，交联剂选自碳酸钙纳米颗粒及碳酸钡纳米颗粒中的至少一种。碳酸钙纳和碳酸钡均微溶于水，在与海藻酸盐的离子交换过程中，可以电离出二价阳离子与海藻酸盐的阳离子进行交换，从而在细胞表面形成凝胶而包裹细胞。可选地，交联剂的中位粒径为15nm～30nm。进一步地，交联剂的中位粒径为15nm～20nm。可以理解的是，碳酸钙纳米颗粒和碳酸钡纳米颗粒的形状不限。

在一些实施例中，制备带有正电荷的交联剂的步骤包括：将交联剂、聚阳离子化合物和水混合，制备悬浮液；及将悬浮液离心，弃上清，制备带有正电荷的交联剂。可选地，聚阳离子化合物选自聚乙烯亚胺(PEI)、聚赖氨酸(PLL)、羧甲基壳聚糖、壳聚糖季铵盐和聚赖氨酸盐酸盐中的至少一种。可选地，聚阳离子化合物的重均分子量为8000～20000。进一步地，聚乙烯亚胺的重均分子量为10000。聚赖氨酸的分子量为70000～150000。羧甲基壳聚糖的重均分子量为8000～10000。壳聚糖季铵盐的重均分子量为8000～10000。聚赖氨酸盐酸盐的重均分子量为8000～10000。可以理解的是，聚阳离子化合物不限于上述，还可以是其他能让上述交联剂带上正电荷的物质。

可选地，交联剂的物质的量、聚阳离子化合物的质量和水的体积之比为(0.0329mmol～0.0989mmol)：(0.6mg～2.2mg)：1mL。进一步地，交联剂的物质的量、聚阳离子化合物的质量和水的体积之比为(0.0329mmol～0.0989mmol)：(0.6mg～1.8mg)：1mL。在一些具体示例中，交联剂的物质的量、聚阳离子化合物的质量和水的体积之比为(0.0329mmol、0.0659mmol或0.0989mmol)：(0.6mg、0.8mg、1mg、1.2mg、1.4mg、1.6mg或1.8mg)：1mL。进一步地，交联剂的物质的量、聚阳离子化合物的质量和水的体积之比为(0.0329mmol～0.0989mmol)：(0.6mg～1.2mg)：1mL。更进一步地，交联剂的物质的量、聚阳离子化合物的质量和水的体积之比为0.0989mmol：(0.6mg～1mg)：1mL。

在其中一个实施例中，交联剂为碳酸钙颗粒；交联剂的质量、聚阳离子化合物的质量和水的体积之比为(0.0033g～0.0099g)：(0.6mg～1.8mg)：1mL。在一些具体示例中，交联剂的质量、聚阳离子化合物的质量和水的体积之比为(0.0033g、0.0066g或0.0099g)：(0.6mg、0.8mg、1mg、1.2mg、1.4mg、1.6mg或1.8mg)：1mL。进一步地，交联剂的质量、聚阳离子化合物的质量和水的体积之比为(0.0033g～0.0099g)：(0.6mg～1.2mg)：1mL。更进一步地，交联剂的质量、聚阳离子化合物的质量和水的体积之比为0.0099g：(0.6mg～1mg)：1mL。

可选地，制备悬浮液的步骤包括：将聚阳离子化合物与水超声混合，制备聚阳离子溶液；及将交联剂加入到聚阳离子溶液中并超声混合，制备悬浮液。进一步地，在聚阳离子化合物与水超声混合的操作中，超声的时间为3分钟～5分钟；超声的频率为80kHz～90kHz。在将交联剂加入到聚阳离子溶液中并超声混合的操作中，超声的时间为15分钟～20分钟；超声的频率为90kHz。可以理解的是，在一些实施例中，也可以将聚阳离子化合物和交联剂一起与水超声混合，制备悬浮液。

聚阳离子化合物溶于水，交联剂微溶于水。在将聚阳离子化合物、水和交联剂混合之后会形成悬浮液。因此，在制得的悬浮液的基础上，进行固液分离，可得到带有正电荷的交联剂。另外，通过固液分离，还可以去掉多余的聚阳离子化合物，避免多余的聚阳离子化合物影响细胞生长。可选地，固液分离的方式为离心。具体地，将悬浮液离心，弃上清，制备带有正电荷的交联剂。可选地，将悬浮液离心的离心力为650g～1200g；离心的时间为1分钟～2分钟。当然，固液分离的方式不限于离心，还可以是其他方式。

可选地，带有正电荷的交联剂在水中的电位为6mV～30mV。在一个具体地的实施例中，带有正电荷的交联剂在水中的电位为6.2mV、6.4mV、9.6mV、9.7mV、10.2mV、13.4mV、13.7mV、14.1mV、15.4mV、17.3mV、18.6mV、19mV、20.2mV或21.9mV。进一步地，带有正电荷的交联剂在水中的电位为10mV～22mV。此时，单细胞凝胶的包裹率可以达到50％以上。更进一步地，带有正电荷的交联剂在水中的电位为18mV～22mV。此时，单细胞的包裹率可以达到80％以上。

步骤S200：将带有正电荷的交联剂与细胞混合，制备吸附有交联剂的细胞。

为保证细胞存活，细胞以细胞悬浮液的形式与带有正电荷的交联剂混合。具体地，将缓冲液或培养基与细胞混合制成细胞悬浮液。可选地，缓冲液选自PBS缓冲液和HEPES缓冲液中的一种。培养基为DMEM(RPMI1640、MEM等)和10％胎牛血清(FBS)混合制得的完全培养基。当然，缓冲液和培养基的种类不限于上述，还可以根据具体被包裹的细胞的种类进行选择。

可选地，交联剂的物质的质量与细胞的密度之比为(0.0329mmol～0.0989mmol)：(1～2.25)×10⁶个/mL。进一步地，交联剂的质量与细胞的密度之比为0.0989mmol：2.25×10⁶个/mL。

在一些实施例中，将带有正电荷的交联剂与细胞混合制备吸附有交联剂的细胞的步骤包括：将细胞悬浮液加入含有带有正电荷的交联剂的容器(例如离心管)中，吹打均匀(例如，吹打8～20次以上)，以使细胞吸附带正电荷的交联剂，制备吸附有交联剂的细胞。可选地，在将细胞与带有正电荷的交联剂混合均匀后，将含有细胞和戴正电荷的交联剂的混合液静置8分钟～15分钟，以使细胞充分吸附带正电荷的交联剂。

在其中一个实施例中，制备吸附有交联剂的细胞的步骤包括：将带有正电荷的交联剂与细胞混合均匀，制备混合物；将混合物静置后加入培养基培养，以使混合物中的细胞贴壁生长；及在细胞贴壁之后弃培养液，并消化贴壁后的细胞，制备吸附有交联剂的细胞。通过将细胞贴壁培养，以去除未被细胞吸附的交联剂，防止过多的交联剂后续与海藻酸钠形成未包裹细胞的凝胶。可选地，贴壁培养的时间为4小时～8小时。在一些具体的实施例中，贴壁培养的时间为6小时、6.5小时、7小时、7.5小时或8小时。当然，在其他实施例中，贴壁的时间不限于上述，还可以根据具体的细胞进行调整。进一步地，消化贴壁后的细胞之前还包括采用缓冲液清洗细胞的步骤。可选地，消化之后收集细胞的离心力为280g～450g；离心的时间为3分钟～5分钟。当然，在其他实施例中，还可以采用其他方式将吸附有交联剂的细胞与其他物质分离。

步骤S300：将吸附有交联剂的细胞与海藻酸盐溶液混合反应，制备单细胞微凝胶。

通过，将吸附有交联剂的细胞与海藻酸盐溶液混合反应，使得交联剂中的钙离子和/或钡离子与海藻酸盐中的阳离子发生离子交换，从而在细胞的表面形成凝胶将细胞包裹。

可选地，海藻酸盐为海藻酸钠。海藻酸盐溶液中海藻酸盐的质量浓度为1％～3％。海藻酸钠的浓度再增加会使溶液变得很粘稠，不易于细胞在其中的均匀分布。进一步地，海藻酸盐溶液中海藻酸盐的质量浓度为1％～2％。更进一步地，海藻酸盐溶液中海藻酸盐的质量浓度为1％～1.5％。可以理解的是，海藻酸盐不限于海藻酸钠，还可以是其他能与二价阳离子(钙离子和/或钡离子)发生离子交换而形成凝胶的其他海藻酸盐。

可选地，在将吸附有交联剂的细胞与海藻酸盐溶液混合反应的步骤中，混合反应的时间为20分钟～30分钟。

在一些实施例中，将带有正电荷的交联剂与细胞混合的步骤中，细胞为第一荧光标记物标记的细胞；在海藻酸盐溶液中含有第二荧光标记物标记的海藻酸盐，第二荧光标记物与第一荧光标记物发出的荧光不同，因此便于区分未被凝胶包裹的细胞和包裹有凝胶层的细胞，也便于得知上述单细胞凝胶的制备方法的制备效率。

可选地，海藻酸盐溶液中溶质为海藻酸钠和标记有第二荧光标记物的海藻酸钠。标记有第二荧光标记物的海藻酸钠作为染料，以便观察到凝胶的形成。进一步地，在海藻酸盐溶液中，标记有第二荧光标记物的海藻酸钠与无标记的海藻酸钠的质量之比为1：(4000～5000)。更进一步地，在海藻酸盐溶液中，标记有第二荧光标记物的海藻酸钠与无标记的海藻酸钠的质量之比为1：4000。

可选地，第一荧光标记物标记在细胞膜上。在一个具体的示例中，第一荧光标记物为红色标记探针(例如DID探针)；第二荧光标记物为异硫氰酸荧光素(FITC)。当然，第一荧光标记物和第二荧光标记物的组合不限于上述，还可以是其他组合，只要能将区分未包裹凝胶的细胞与凝胶包裹的细胞就可以。

当然，在一些实施例中，在吸附有交联剂的细胞与海藻酸盐溶液混合反应结束后，还包括以下步骤：向混合反应结束后的溶液中加入缓冲液以将单细胞微凝胶分散均匀；然后，离心收获单细胞微凝胶。可选地，收获单细胞微凝胶的离心力为400g～680g。

上述单细胞微凝胶的制备方法至少具有以下优点：

(1)成本低：原材料采用的是碳酸钙纳米颗粒及碳酸钡纳米颗粒中的至少一种、海藻酸盐和聚阳离子化合物，原材料易获取且价格便宜，并且上述单细胞微凝胶的制备方法不依懒于价格昂贵的微流控芯片，成本低。

(2)操作简便：上述单细胞微凝胶的制备方法通过固液混合和固液分离可实现单细胞微凝胶的制备，操作简便；并且，传统的采用微流控芯片制得的单细胞微凝胶不易收集、分离和处理，而上述单细胞微凝胶的制备方法制备单细胞微凝胶时，通过离心就可以实现收集、分离和处理。此外，上述单细胞微凝胶的制备方法还可以批量制作。

(3)通用性好：采用微流控芯片制备单细胞微凝胶时，一种微流控芯片往往对应的是一种类型的细胞。与采用流控芯片制备单细胞微凝胶相比，上述单细胞微凝胶的制备方法中的细胞类型没有特别限制，通用性好。

(4)采用上述单细胞微凝胶的制备方法制备的单细胞微凝胶的尺寸较小，凝胶层的厚度一般在1μm～2μm，利于后续生物医学领域的应用。

(5)包裹效率高：经验证，采用上述单细胞微凝胶的制备方法制备单细胞微凝胶时，包裹效率可以达到97％～99％，包裹效率高，并且不容易出现空包或多包的情况。

具体实施例

以下结合具体实施例进行详细说明。以下实施例如未特殊说明，则不包括除不可避免的杂质外的其他组分。实施例中采用试剂和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者生产厂家推荐的方法实现。

实施例1

(1)样品及试剂准备：

海藻酸钠溶液：将海藻酸钠、标记有FITC的海藻酸钠(FITC海藻酸钠)和水混合均匀，制备海藻酸钠溶液。在海藻酸钠溶液中，海藻酸钠的质量百分数为1％的海藻酸钠，FITC-海藻酸钠的质量百分数为0.05％，细胞为Hela细胞；

聚乙烯亚胺分散液：0.0008g聚乙烯亚胺(Aladdin E107079，重均分子量10000)与1mL去离子水在80kHz超声作用下分散3分钟，制备聚乙烯亚胺分散液；在聚乙烯亚胺分散液中，聚乙烯亚胺的浓度为0.8mg/mL；

称取0.0099g中位粒径为20nm的碳酸钙纳米颗粒备用；

细胞悬浮液：1mL细胞膜被红色探针(DID)标记的细胞悬液，细胞密度为1×10⁶个/mL；未包裹凝胶的细胞的电镜照片图2所示。

PBS缓冲液、完全培养基(DEME+10％FBS+1％双抗)和载玻片。

(2)将步骤(1)中称取的0.0099g中位粒径为20nm的碳酸钙纳米颗粒加入步骤(1)制备的聚乙烯亚胺分散液中90kHz超声十分钟，制得碳酸钙纳米颗粒分散液。

(3)将步骤(2)制得的碳酸钙纳米颗粒分散液在离心力为663g的条件下离心2分钟，弃上清，制得带有正电荷的碳酸钙纳米颗粒。利用zeta电位测量仪采用电泳法测得带有正电荷的碳酸钙纳米颗粒在水中的电位(zeta potential)为20.2mV。

(4)将步骤(1)制备的细胞悬浮液加入到步骤(3)的含有碳酸钙纳米颗粒的离心管中，充分吹打均匀(吹打8次，其中，吸溶液并吹出为一次)，使细胞充分带有正电荷的碳酸钙纳米颗粒充分混合，混合均匀后静置十分钟。

(5)在步骤(4)的静置结束后加入培养基培养8h小时，使得细胞贴壁。在细胞贴壁之后，倒掉多余培养液，并用PBS清洗3次，洗掉多余带正电荷的碳酸钙纳米颗粒；然后，用胰酶处理细胞，制备吸附有碳酸钙纳米颗粒的细胞悬液。

(6)将步骤(5)制得的细胞悬液吹打均匀后加入到步骤(1)中制得的海藻酸钠溶液中进行交联40分钟。然后，加入40mL PBS缓冲液进行轻微震荡搅拌，然后在离心力为424g的条件下离心5分钟，弃上清，制得单细胞微凝胶。

(7)将步骤(6)制得的单细胞凝胶在显微镜下观察，结果如图3～图8所示。图3为红色通道下的图像；图4为绿色通道下的图像；图5为合并通道下的图像；图6为明场下40倍镜图；图7为明场下20倍镜图；图8为扫描电镜图。

由图3～图8可知，本实施例的单细胞微凝胶制备成功，在细胞表面有凝胶，红绿通道下均有荧光。通过合并通道的荧光发现，单细胞微凝胶的包裹率高，包裹率约为100％。需要说明的是，本文中的包裹率是指包裹有凝胶的细胞在所有细胞中的占比。

实施例2

本实施例单细胞凝胶的制备方法与实施例1的单细胞凝胶的制备方法大致相同，其不同在于，在本实施例中，聚乙烯亚胺分散液中聚乙烯亚胺的浓度为0.6mg/mL，带有正电荷的碳酸钙纳米颗粒在水中的电位为14.1mV。

按照本实施例的制备方法制得的单细胞凝胶如图9～图11所示。图9为红色通道下的图像；图10为绿色通道下的图像；图11为合并通道下的图像。

由图9～图11可知，本实施例的单细胞微凝胶制备成功，在细胞表面有凝胶，红绿通道下均有荧光。通过合并通道的荧光发现，单细胞微凝胶的包裹率高，包裹率约为52.4％。

实施例3

本实施例单细胞凝胶的制备方法与实施例1的单细胞凝胶的制备方法大致相同，其不同在于，在本实施例中，聚乙烯亚胺分散液中聚乙烯亚胺的浓度为1mg/mL，带有正电荷的碳酸钙纳米颗粒在水中的电位为13.7mV。

按照本实施例的制备方法制得的单细胞凝胶如图12～图14所示。图12为红色通道下的图像；图13为绿色通道下的图像；图14为合并通道下的图像。

由图12～图14可知，本实施例的单细胞微凝胶制备成功，在细胞表面有凝胶，红绿通道下均有荧光。通过合并通道的荧光发现，单细胞微凝胶的包裹率高，包裹率约为55.5％。

实施例4

本实施例单细胞凝胶的制备方法与实施例1的单细胞凝胶的制备方法大致相同，其不同在于，在本实施例中，加入到聚乙烯亚胺分散液中的中位粒径为20nm的碳酸钙纳米颗粒的质量为0.0033g。

按照本实施例的制备方法制得的单细胞凝胶如图15～图17所示。图15为红色通道下的图像；图16为绿色通道下的图像；图17为合并通道下的图像。

由图15～图17可知，本实施例的单细胞微凝胶制备成功，在细胞表面有凝胶，红绿通道下均有荧光。通过合并通道的荧光发现，单细胞微凝胶的包裹率较实施例1有所降低，本实施例的包裹率约为35.4％。

实施例5

本实施例单细胞凝胶的制备方法与实施例1的单细胞凝胶的制备方法大致相同，其不同在于，在本实施例中，聚阳离子化合物为聚赖氨酸(Solarbio P2100)，并且在聚赖氨酸分散液中聚赖氨酸的浓度为0.8mg/mL，经聚赖氨酸处理后，带有正电荷的碳酸钙纳米颗粒在水中的电位为21.9mV。

按照本实施例的制备方法制得的单细胞凝胶如图18～图20所示。图18为红色通道下的图像；图19为绿色通道下的图像；图20为合并通道下的图像。

由图18～图20可知，本实施例的单细胞微凝胶制备成功，在细胞表面有凝胶，红绿通道下均有荧光。通过合并通道的荧光发现，单细胞微凝胶的包裹率高，包裹率约为97.5％。

实施例6

本实施例单细胞凝胶的制备方法与实施例1的单细胞凝胶的制备方法大致相同，其不同在于，在本实施例中，细胞未吸附纳米碳酸钙颗粒，而是直接将细胞与海藻酸钠混合。也即是：将细胞密度为1×10⁶个/mL的标记有红色探针的细胞悬浮液与海藻酸钠溶液混合后，静置40分钟，然后加入40mL PBS缓冲液进行轻微震荡搅拌，然后在离心力为424g的条件下离心5分钟，弃上清，制得单细胞微凝胶。

按照本实施例的制备方法制得的单细胞凝胶如图21～图23所示。图21为红色通道下的图像；图22为绿色通道下的图像；图23为明场下的图像。

由图21～图23可知，本实施例的单细胞微凝胶并没有制备成功，细胞表面无凝胶，绿通道下无荧光。

实施例7

本实施例单细胞凝胶的制备方法与实施例1的单细胞凝胶的制备方法大致相同，其不同在于，在本实施例中，聚乙烯亚胺分散液中聚乙烯亚胺的浓度为1.2mg/mL，带有正电荷的碳酸钙纳米颗粒在水中的电位为19mV。

实施例8

本实施例单细胞凝胶的制备方法与实施例1的单细胞凝胶的制备方法大致相同，其不同在于，在本实施例中，聚乙烯亚胺分散液中聚乙烯亚胺的浓度为1.4mg/mL，带有正电荷的碳酸钙纳米颗粒在水中的电位为17.3mV。

实施例9

本实施例单细胞凝胶的制备方法与实施例1的单细胞凝胶的制备方法大致相同，其不同在于，在本实施例中，聚乙烯亚胺分散液中聚乙烯亚胺的浓度为1.6mg/mL，带有正电荷的碳酸钙纳米颗粒在水中的电位为18.6mV。

实施例10

本实施例单细胞凝胶的制备方法与实施例1的单细胞凝胶的制备方法大致相同，其不同在于，在本实施例中，聚乙烯亚胺分散液中聚乙烯亚胺的浓度为1.8mg/mL，带有正电荷的碳酸钙纳米颗粒在水中的电位为15.4mV。

实施例11

本实施例单细胞凝胶的制备方法与实施例5的单细胞凝胶的制备方法大致相同，其不同在于，在本实施例中，聚赖氨酸分散液中聚赖氨酸的浓度为1mg/mL，带有正电荷的碳酸钙纳米颗粒在水中的电位为13.7mV。

实施例12

本实施例单细胞凝胶的制备方法与实施例1的单细胞凝胶的制备方法大致相同，其不同在于，在本实施例中，聚乙烯亚胺分散液中聚乙烯亚胺的浓度为2.2mg/mL，带有正电荷的碳酸钙纳米颗粒在水中的电位为6.4mV。

按照本实施例的制备方法制得的单细胞凝胶如图24～图27所示。图24为红色通道下的图像；图25为绿色通道下的图像；图26为合并通道下的图像；图27为明场下的图像。

经计算，本实施例的包裹率约为27.7％。

实施例13

本实施例单细胞凝胶的制备方法与实施例5的单细胞凝胶的制备方法大致相同，其不同在于，在本实施例中，聚赖氨酸分散液中聚赖氨酸的浓度为1.4mg/mL，带有正电荷的碳酸钙纳米颗粒在水中的电位为10.2mV。

实施例14

本实施例单细胞凝胶的制备方法与实施例5的单细胞凝胶的制备方法大致相同，其不同在于，在本实施例中，聚赖氨酸分散液中聚赖氨酸的浓度为1.6mg/mL，带有正电荷的碳酸钙纳米颗粒在水中的电位为9.6mV。

实施例15

本实施例单细胞凝胶的制备方法与实施例5的单细胞凝胶的制备方法大致相同，其不同在于，在本实施例中，聚赖氨酸分散液中聚赖氨酸的浓度为1.8mg/mL，带有正电荷的碳酸钙纳米颗粒在水中的电位为6.2mV。

实施例16

本实施例单细胞凝胶的制备方法与实施例5的单细胞凝胶的制备方法大致相同，其不同在于，在本实施例中，聚赖氨酸分散液中聚赖氨酸的浓度为0.6mg/mL，带有正电荷的碳酸钙纳米颗粒在水中的电位为13.4mV。

实施例17

本实施例单细胞凝胶的制备方法与实施例1的单细胞凝胶的制备方法大致相同，其不同在于，在本实施例中，本实施例省略了将碳酸钙与聚乙烯亚胺分散液混合的步骤，也即是本实施例的碳酸钙颗粒在不带正电荷的条件下与细胞混合。其中，利用zeta电位测量仪采用电泳法测得碳酸钙纳米颗粒在水中的电位为-22.3mV。

按照本实施例的制备方法制得的单细胞凝胶如图28～图30所示。图28为红色通道下的图像；图29为绿色通道下的图像；图30为合并通道下的图像。

由图可知，细胞嵌在海藻酸钠凝胶中，凝胶呈块状。经计算，本实施例的包裹率约为6.5％。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。应当理解的是，在本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或有限的试验得到的技术方案，均在本发明所附权利要求的保护范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。

Claims

1.一种单细胞微凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

将所述吸附有交联剂的细胞与海藻酸盐溶液混合反应，制备单细胞微凝胶；所述海藻酸盐溶液中海藻酸盐的质量浓度为1％～3％；

所述制备带有正电荷的交联剂的步骤包括：

将所述交联剂、聚阳离子化合物和水混合，制备悬浮液；及

将所述悬浮液固液分离，弃液体，制备带有正电荷的交联剂；所述带有正电荷的交联剂在水中的电位为6mV～30mV；

所述交联剂的物质的量与吸附所述交联剂之前的细胞的密度之比为(0.0329mmol～0.0989mmol)：(1～2.25)×10⁶个/mL。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述海藻酸盐为海藻酸钠。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述制备悬浮液的步骤包括：

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述聚阳离子化合物选自聚乙烯亚胺、聚赖氨酸、羧甲基壳聚糖、壳聚糖季铵盐和聚赖氨酸盐酸盐中的至少一种。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述交联剂的物质的量、所述聚阳离子化合物的质量和所述水的体积之比为(0.0329mmol～0.0989mmol)：(0.6mg～2.2mg)：1mL。

6.根据权利要求1～5中任一项所述的制备方法，其特征在于，在将所述带有正电荷的交联剂与细胞混合的步骤中，所述细胞为第一荧光标记物标记的细胞；所述海藻酸盐溶液中含有第二荧光标记物标记的海藻酸盐，所述第二荧光标记物与所述第一荧光标记物发出的荧光不同。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述制备吸附有交联剂的细胞的步骤包括：

将所述带有正电荷的交联剂与细胞混合均匀，制备混合物；

8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在所述将所述吸附有交联剂的细胞与海藻酸盐溶液混合反应的步骤中，混合反应的时间为30分钟～40分钟。

9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述带有正电荷的交联剂在水中的电位为18mV～22mV。

10.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述海藻酸盐溶液中海藻酸盐的质量浓度为1％～2％。