CN112522176A - 组合物、细胞微囊化试剂盒和微囊化的单细胞的制备方法 - Google Patents

组合物、细胞微囊化试剂盒和微囊化的单细胞的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种组合物、细胞微囊化试剂盒和微囊化的单细胞的制备方法。以质量份数计，该组合物包括0.8份～1.4份的海藻酸钠、0.1份～0.3份的黄原胶、0.2份～0.8份的果胶、3份～6份的甘油、0.1份～0.3份的表面活性剂及0.1份～0.2份的明胶。使用上述组合物可以使得电喷技术制得的微囊尺寸小，容易制备微囊化的单细胞。

Description

组合物、细胞微囊化试剂盒和微囊化的单细胞的制备方法
技术领域
本发明涉及生物材料技术领域，特别是涉及一种组合物、细胞微囊化试剂盒和微囊化的单细胞的制备方法。
背景技术
细胞培养技术指的是细胞在体外条件下的生长，在培养的过程中细胞不再形成组织(动物)。传统细胞培养为二维培养，即细胞沿着玻璃或塑料平面生长。由于二维培养不能充分真实模拟体内生长模式，细胞的增殖、分化、凋亡、基因和蛋白表达等过程往往会受到一定的影响。另外，由于培养基质硬度(玻璃或塑料培养皿)与细胞在体生长环境软硬度相差极大，二维培养还容易导致研究结果与细胞在体内实际生长的生物学行为发生极大的偏差。
随着科技的进步，近年来出现了能为细胞生长提供所需要的三维结构以及生物兼容性良好的细胞基质(如水凝胶)等条件的三维细胞培养。三维细胞培养主要是通过细胞微囊化实现。细胞微囊化是将目的细胞包裹于一种或几种生物相容性良好且具有半透膜特性的材料内，使目的细胞既可以实现免疫隔离、避免大分子免疫物质和免疫细胞的攻击，又可以允许代谢产物、小分子营养物及细胞活性物质自由出入微囊。相较于传统的二维单层细胞培养，三维细胞培养能更好地模拟体内条件，能更紧密地模仿复杂的细胞组织间相互作用以及在体内的微环境，通过允许单个细胞维持其正常的三维形状，有助于细胞与相邻细胞间形成复杂的相互作用和信号接收及发送，为不同类型的细胞培养创造一个更自然的生长环境。
目前，三维细胞培养中的细胞微囊化主要是依赖于基于微流控芯片的微液滴生成技术或电喷技术。微液滴生成技术可以实现精确的单细胞包裹，但微流控芯片需要精密的微阀、微泵的制作和组装以及几十微米的微管道的加工，每片芯片仅适合少量特定的细胞和特定场合，通用性差，制造成本和使用成本高。电喷技术相比于微流控芯片技术，具有设备搭建简单，操作快速方便，成本低等优点，然而，电喷技术制备的微囊尺寸大，容易出现多个细胞被包裹在一个微囊中的现象，难以实现单细胞包裹。
发明内容
基于此，有必要提供一种组合物，该组合物有助于基于电喷技术的细胞微囊化实现单细胞包裹。
一种组合物，用于制备包裹细胞的微囊，以质量份数计，包括0.8份～1.4份的海藻酸钠、0.1份～0.3份的黄原胶、0.2份～0.8份的果胶、3份～6份的甘油、0.1份～0.3份的表面活性剂及0.1份～0.2份的稳定剂，所述稳定剂为明胶。
上述组合物包括海藻酸钠、黄原胶、果胶、甘油、表面活性剂及稳定剂，通过海藻酸钠、黄原胶、果胶、甘油、表面活性剂及稳定剂的相互配合，可以使得利用电喷技术制得的微囊的尺寸更小，更容易实现单细胞包裹，且还可以使得制得的微囊化的细胞稳定，利于细胞生长。
在其中一个实施例中，以质量份数计，所述组合物包括0.8份～2份的海藻酸钠、0.1份～0.2份的黄原胶、0.2份～0.3份的果胶、3份～5份的甘油、0.1份～0.2份的表面活性剂及0.1份的稳定剂。
在其中一个实施例中，以质量份数计，所述组合物还包括91份～96份的基础培养基。
在其中一个实施例中，所述表面活性剂选自吐温-80、吐温-20及吐温-60中至少一种。
一种细胞微囊化试剂盒，包括第一试剂和第二试剂，所述第一试剂为上述的组合物，所述第二试剂的介电常数为3～5且在10℃～30℃下为液体。
在其中一个实施例中，所述第二试剂选自硅油、玉米油、豆油和蓖麻油中的至少一种。
在其中一个实施例中，所述细胞微囊化的试剂盒还包括固化剂，所述固化剂包括氯化钙和乙醇。
一种微囊化的单细胞的制备方法，包括以下步骤：
利用同轴电喷技术，将上述的细胞微囊化试剂盒中的第一试剂与细胞混合后作为内相液，将所述细胞微囊化试剂盒中的第二试剂作为外相液，制备微囊化的单细胞。
在其中一个实施例中，所述制备方法包括以下步骤：
将所述第一试剂与细胞混合，制备所述内相液；
将可溶性钙盐溶液与能够溶解所述外相液的试剂混合，制备接收液；及
将所述内相液泵入同轴双通道喷头的内通道中，将所述第二试剂泵入所述同轴双通道喷头的外通道中，并对所述外通道中的第二试剂施加电压，以使所述第二试剂和所述内相液在所述同轴双通道喷头的喷嘴处形成具有双相结构的液滴，并使所述液滴能滴入所述接收液中，其中，所述双相结构的液滴由外相和被所述外相完全包裹的内相组成，所述外相为第二试剂，所述内相为被所述第一试剂包裹着的细胞。
在其中一个实施例中，施加到所述第二试剂上的电压为8KV～10KV，所述第二试剂的流速为1mL/h～4mL/h，所述内相液的流速为0.5mL/h～5mL/h。
附图说明
图1为一实施方式的微囊化的单细胞的制备方法的示意图；
图2为实施例1的微囊化的单细胞的制备过程中的扫描电镜图；
图3为按照实施例1的方法制得的微囊化的细胞；
图4为按照实施例2的方法制得的微囊化的细胞；
图5为按照实施例3的方法制得的微囊化的细胞；
图6为按照实施例4的方法制得的微囊化的细胞；
图7为按照实施例5的方法制得的微囊化的细胞；
图8为按照实施例6的方法制得的微囊化的细胞；
图9为按照实施例7的方法制得的微囊化的细胞；
图10为按照实施例8的方法制得的微囊化的细胞；
图11为按照对比例1的方法制得的微囊化的细胞；
图12为按照对比例2的方法制得的微囊化的细胞；
图13为按照对比例3的方法制得的微囊化的细胞。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使本发明公开内容更加透彻全面。
需要说明的是，当使用术语“上”、“下”、“内”、“外”等指示方位或位置关系时，是为基于位置关系，仅为了便于描述，不能理解为对本申请的限制。此外，术语“第一”、“第二”等仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
本发明一实施方式提供了一种组合物，可以用于制备包裹细胞的微囊，以质量份数计，该组合物包括0.8份～1.4份的海藻酸钠、0.1份～0.3份的黄原胶、0.2份～0.8份的果胶、3份～6份的甘油、0.1份～0.3份的表面活性剂及0.1份～0.2份的稳定剂，稳定剂为明胶。
海藻酸钠作为包裹细胞的材料，与细胞的生物相容性好、细胞粘附好，利于细胞的长期培养。将海藻酸钠的质量份数设置为0.8份～1.4份，可以使得制得的微囊的尺寸不超过100μm。若海藻酸钠的质量份数过多或过少会使得制得的微囊容易包裹多个细胞，不适宜于包裹单个细胞。在一个可选地具体示例中，海藻酸钠的质量份数为0.8份、0.9份、1份、1.1份、1.2份或1.4份。进一步地，海藻酸钠的质量份数为0.8份～1.2份。当然，在一些实施例中，还可以对海藻酸钠进行改造，例如接枝短的氨基酸序列(RGD)，以便与细胞表面的受体结合，从而进一步提高细胞对微囊的粘附性。
黄原胶用于提高制得的微囊的稳定性。将黄原胶的质量份数设置为0.1份～0.3份，可以使得制得包裹着细胞的微囊更加稳定。在一个可选地具体示例中，黄原胶的质量份数为0.1份、0.15份、2份、2.5份或0.3份。进一步地，黄原胶的质量份数为0.2份～0.3份。
果胶可以大大降低制得的微囊的尺寸，但果胶的用量过多容易使得制备的微囊不稳定。因此，本实施方式将果胶的质量份数设置为0.2份～0.8份。在一个可选地具体示例中，果胶的质量份数为0.2份、0.3份、0.4份、0.5份、0.6份或0.8份。进一步地，果胶的质量份数为0.2份～0.3份。
甘油用于调节组合物的密度，使得细胞可以均匀的悬浮在上述组合物中。将甘油的质量份数设置为3份～6份。在一个可选地具体示例中，甘油的质量份数为3份、3.5份、4份、4.5份、5份或5.5份。进一步地，甘油的质量份数为3份～5份。
表面活性剂用于降低上述组合物形成的体系的表面张力，调节微囊的尺寸。可选地，表面活性剂选自吐温-80、吐温-20及吐温-60中的至少一种。当然，在其他实施例中，表面活性剂不限于上述，还可以是其他物质。
明胶用于提高制得的微囊的稳定性和强度。在一个可选地具体示例中，稳定剂的质量份数为0.1份、0.12份、0.15份、0.18份或2份。进一步地，稳定剂的质量份数为0.1份～0.12份。
在其中一个实施中，以质量份数计，组合物包括0.8份～1.2份的海藻酸钠、0.1份～0.2份的黄原胶、0.2份～0.5份的果胶、3份～5份的甘油、0.1份～0.3份的表面活性剂及0.1份～0.12份的稳定剂。
在另一个实施例中，以质量份数计，组合物包括0.8份～1.2份的海藻酸钠、0.1份～0.2份的黄原胶、0.2份～0.3份的果胶、3份～5份的甘油、0.1份～0.2份的表面活性剂及0.1份的稳定剂。
在一些实施例中，以质量份数计，组合物还包括91份～96份的基础培养基。基础培养基可以为细胞生长提供必要的营养，使得细胞能快速的适应微囊环境，利于细胞的成活。在一个可选地具体示例中，基础培养基为DMEM培养基。当然，基础培养基不限于上述，在其他实施例中，可以根据具体的细胞选择对应的基础培养基。当然，在一些实施例中，基础培养基可以用添加有促进细胞生长或促进细胞分泌蛋白的营养元素的营养培养基替代。
在其中一个实施例中，上述组合物包括0.8份～1.2份的海藻酸钠、0.1份～0.2份的黄原胶、0.2份～0.5份的果胶、3份～5份的甘油、0.1份～0.3份的表面活性剂、0.1份～0.12份的稳定剂和91份～96份的基础培养基。
在另一个实施例中，以质量份数计，上述组合物包括0.8份～1.2份的海藻酸钠、0.1份～0.2份的黄原胶、0.2份～0.3份的果胶、3份～5份的甘油、0.1份～0.2份的表面活性剂、0.1份的稳定剂和91份～95.7份的基础培养基。
在其中一个实施例中，上述组合物由0.8份～1.4份的海藻酸钠、0.1份～0.3份的黄原胶、0.2份～0.8份的果胶、3份～6份的甘油、0.1份～0.3份的表面活性剂及0.1份～0.2份的稳定剂组成。进一步地。上述组合物由0.8份～1.2份的海藻酸钠、0.1份～0.2份的黄原胶、0.2份～0.3份的果胶、3份～5份的甘油、0.1份～0.2份的表面活性剂和0.1份的稳定剂组成。
在其中一个实施例中，上述组合物由0.8份～1.4份的海藻酸钠、0.1份～0.3份的黄原胶、0.2份～0.8份的果胶、3份～6份的甘油、0.1份～0.3份的表面活性剂、0.1份～0.2份的稳定剂和91份～96份的基础培养基组成。进一步地。上述组合物由0.8份～1.2份的海藻酸钠、0.1份～0.2份的黄原胶、0.2份～0.3份的果胶、3份～5份的甘油、0.1份～0.2份的表面活性剂、0.1份的稳定剂和91份～95.7份的基础培养基组成。
上述组合物包括海藻酸钠、黄原胶、果胶、甘油、表面活性剂及稳定剂，通过海藻酸钠、黄原胶、果胶、甘油、表面活性剂及稳定剂的相互配合，可以使得利用电喷技术制得的微囊的尺寸小，容易实现单个细胞的微囊化，不容易出现一个微囊包裹多个细胞的现象。此外，使用上述组合物制得的微囊的结构稳定，强度高，利于细胞生长。
本发明一实施方式还提供了一种细胞微囊化试剂盒，包括第一试剂和第二试剂。第一试剂与细胞混合后用作双轴电喷的内相液，第二试剂用作双轴电喷的外相液。在使用时，将内相液和外相液泵入同轴双通道喷头的不同通道，并在同轴双通道喷头上施加电压，从而在同轴双通道喷头的喷嘴上形成的具有双相结构的液滴，该液滴的内相为被上述组合物包裹的细胞，外相为第二试剂，且液滴的外相将内相完全包裹。
具体地，第一试剂为上述组合物，第二试剂的介电常数为3～5且在10℃～30℃下为液体。第一试剂电导率的2ms/cm～4ms/cm且在10℃～30℃下为液体，可以使得内相受到的电场力小，可以被外相强行带走的量极少，从而实现单个细胞包裹。可选地，第二试剂选自硅油、玉米油、豆油和蓖麻油中的至少一种。当然，在其他实施例中，第二试剂不限于上述，还可以是其他介电常数为3～5且在10℃～30℃下为液体的物质。第二试剂的介电常数是指在第二试剂中将相反电荷分开的能力，它反映第二试剂的极性大小，介电常数借助电容测定仪，通过测定第二试剂的电容值求得，是个无因次的数值。
在一些实施例中，细胞微囊化试剂盒还包括固化剂，固化剂用于将在同轴双通道喷头的喷嘴上形成的液滴的外相溶解，并固化该液滴的内相。具体地，固化剂包括氯化钙和乙醇。乙醇用于将包裹在内相上的外相溶解；氯化钙用于固化上述组合物，通过氯化钙与乙醇的相互配合，可以使得液滴的外相被溶解而内相可以充分暴露在氯化钙溶液中，从而使得与氯化钙溶液直接接触的上述组合物被氯化钙固化而形成包裹细胞的微囊。可选地，氯化钙以氯化钙溶液的形式使用，乙醇以乙醇溶液的形式使用。在使用时，氯化钙溶液中氯化钙的质量百分含量为2％～8％，乙醇溶液中乙醇的浓度为75％，氯化钙溶液与乙醇溶液的体积比为(2.5～3.5)：1。当然，在其他一些实施例中，氯化钙还可以被其他含有二价阳离子的化合物替代，例如乳酸钙等；乙醇也可以被其他能够溶解第二试剂的物质替代。
在其中一个实施例中，第二试剂为蓖麻油，固定剂为氯化钙和乙醇。蓖麻油易溶解于酒精中且介电常数较高，流动性好。
上述细胞微囊化试剂盒中的第一试剂与第二试剂相互配合，容易使得单细胞的微囊化，且制得的微囊化的细胞稳定性好。
本发明一实施方式还提供了一种微囊化的单细胞的制备方法，该制备方法包括以下步骤：利用同轴电喷技术，将上述细胞微囊化试剂盒中的第一试剂与细胞混合后作为内相液，将上述细胞微囊化试剂盒中的第二试剂作为外相液，制备微囊化的单细胞。
进一步地，在利用同轴电喷技术制备微囊化的单细胞的操作中，施加到同轴双通道喷头的外通道上的电压为8KV～10KV，外相液的流速为1mL/h～4mL/h，内相液的流速为0.5mL/h～1.5mL/h。更进一步地，施加到同轴双通道喷头的外通道上的电压为9KV～9.2KV，外相液的流速为2mL/h～3mL/h，内相液的流速为0.5mL/h～1mL/h。
更具体地，利用同轴电喷技术制备微囊化的单细胞的方法包括步骤a～步骤c，具体地：
步骤a：将第一试剂与细胞混合，制备内相液。
具体地，将第一试剂的各组分混合均匀之后与细胞混合，制备内相液，其中，细胞在内相液中的终浓度为3×106个/mL～6×106个/mL。可选地，细胞在内相液中的终浓度为4×106个/mL。可以理解的是，细胞的类别没有特别的限制，例如可以是乳腺癌细胞，也可以是间充质干细胞，只要其尺寸不超过100μm以便微囊能够将其包裹即可。当然，若第一试剂的各组分已经预混，则直接将混合均匀的第一试剂与细胞混合即可。
步骤b：将可溶性钙盐溶液与能够溶解第二试剂的试剂混合，制备接收液。
具体地，将质量百分含量为2％～8％的氯化钙溶液与体积百分含量为75％的乙醇溶液按照体积比为(2.5～3.5)：1的比例混合，制备接收液。先配制质量百分含量为2％～8％的氯化钙溶液和体积百分含量为75％的乙醇溶液，然后将质量百分含量为2％～8％的氯化钙溶液和体积百分含量为75％的乙醇溶液按照体积比(2.5～3.5)：1的比例混合均匀，得到接收液。在一个可选地具体示例中，质量百分含量为2％～8％的氯化钙溶液和体积百分含量为75％的乙醇溶液的体积比为3：1。
当然，在制备接收液时，氯化钙溶液与乙醇溶液的体积比不限于(2.5～3.5)：1，还可以根据氯化钙溶液中氯化钙的浓度和乙醇溶液中乙醇(CH3CH2OH)的浓度进行调整，只要制得的接收液中氯化钙和乙醇(CH3CH2OH)的含量，与质量百分含量为2％～8％的氯化钙溶液和体积百分含量为75％的乙醇溶液按照上述比例混合之后得到的接收液中氯化钙和乙醇(CH3CH2OH)的含量相当即可。可以理解的是，步骤b可以省略，此时上述细胞微囊化试剂盒中的固定剂为可以直接使用的接收液。
步骤c：将内相液泵入同轴双通道喷头的内通道中，将第二试剂作为外相液泵入同轴双通道喷头的外通道中，并对外通道中的第二试剂施加电压，以使第二试剂和内相液在同轴双通道喷头的喷嘴处形成双相结构的液滴，并使液滴能滴入接收液中。双相结构的液滴由外相和被外相完全包裹的内相组成，其外相为第二试剂，其内相为被第一试剂包裹着的细胞。
请参阅图1，同轴双通道喷头包括套设的供内相液体流动的内通道和供外相液体流动的外通道。内通道和外通道均是两端开口的结构，内通道的一端开口用于进内相液，另一端开口用于出内相液；外通道的一端开口用于进第二试剂，另一端开口用于出第二试剂。在内通道和外通道均用于出液体的开口处，由内通道和外通道形成了同轴双通道喷头的喷嘴。在同轴电喷技术中，与同轴双通道喷头配套使用的还有接收装置和电源，接收装置安装在同轴双通道喷头的喷嘴的下方，接收装置承装有接收液，用于接收从同轴双通道喷头的喷嘴滴下的液滴。接收装置远离喷嘴的一面设置有金属电极。在本实施方式中，金属电极靠近接收液的一面到喷嘴的距离为6cm～8cm。电源的一端与同轴双通道喷头的外通道电连接，另一端与接收装置电连接。通过电源与同轴双通道喷头的外通道电连接可以实现对第二试剂的高电压处理。
第二试剂的介电常数为3～5，作为外相液；第一试剂的细胞生物相容性高、细胞粘附性好，与细胞混合后作为内相液，以高压静电法制备具有双相结构的液滴。具体地，对外相液加高压，在数千伏至数万伏高压电场作用下，外相液中的高分子的溶液或熔体表面产生电荷，并受电场力与表面张力的共同作用，在同轴双通道喷头的喷嘴处形成一个圆锥形，如果持续增加电压，带电的锥形液滴克服表面张力，逐渐拉长变细断裂成液滴，射向装有接收液的收集装置。在这一过程中，由于外相液具有一定的绝缘性，所以内相液所受到的电场力极小，在外相液滴形成时会强行带有极少量的内相液，因此也就形成了包含极少量内相液的液滴；而外相液会阻碍内相液固化成微囊，所以选择可以溶解外相液的接收液，例如含有钙离子的酒精水溶液，在外相液被接收液中的乙醇溶解之后，含有细胞的内相液被释放出来，从而与接收液中的二价阳离子(例如钙离子)反应以完成固化，进而实现了单细胞的包裹，也即得到微囊化的单细胞。此外，与传统的直接将细胞与包裹材料混合后加压电喷的微囊化技术相比，采用同轴电喷技术进行细胞微囊化还可以为固化提供缓冲时间，使得各个液滴在进入接收液中之后有足够的时间单独完成固化，即便是前一个液滴的内相未完全固化时后一个液滴落下，此时两液滴之间的内相也会因后一液滴的外相的存在而不会直接接触，不容易使得制得的微囊化的细胞相互粘连堆积。并且，按照上述方法制得的微囊的形状更趋于球形且表面光滑，更利于细胞生长。
具体地，将内相液泵入同轴双通道喷头的内通道中，将第二试剂作为外相液泵入同轴双通道喷头的外通道中，并维持内相液的流速为0.5mL/h～1.5mL/h，第二试剂的流速为1mL/h～4mL/h；对外通道中的第二试剂施加8KV～10KV电压，以使第二试剂和内相液在同轴双通道喷头的喷嘴处形成具有双相结构的液滴，并使液滴滴入接收液中。进一步地，施加到外通道中的第二试剂上的电压为9KV～9.2KV，第二试剂的流速为2mL/h～3mL/h，内相液的流速为0.5mL/h～1mL/h。同轴电喷的各参数在上述范围内时，能够稳定生成微囊化的单细胞。
当然，在将细胞微囊化结束之后，还包括将接收液中的微囊化的细胞与接收液分离的步骤。具体地，将含有微囊化的细胞的接收液进行离心，并用基础培养基清洗。可选地，以1500rpm～2500rpm离心20分钟～30分钟后，用DMEM培养液清洗2遍～3遍。
上述微囊化的单细胞的制备方法采用同轴电喷技术，运用上述组合物与细胞混合后作为内相液，上述细胞微囊化的试剂盒中的第二试剂作为外相液制备微囊化的单细胞，制得的微囊的直径较小，50μm左右，不超过100μm，容易实现单个细胞微囊化；并且制备的微囊化的单细胞的微囊相互独立，不容易出现多个微囊堆叠的现象。
具体实施例
以下结合具体实施例进行详细说明。以下实施例如未特殊说明，则不包括除不可避免的杂质外的其他组分。实施例中采用药物和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者生产厂家推荐的方法实现。
实施例1
(1)配制第一试剂：将第一试剂的各组分混合均匀，制得第一试剂。其中，以质量份数计，第一试剂的组成为：1.2份的海藻酸钠、0.2份的黄原胶、0.3份的果胶、5份的甘油、0.2份的吐温-80、0.1份的明胶和93份的DMEM培养基。
(2)配制接收液：将质量百分含量为5％的氯化钙水溶液与体积百分含量为75％酒精以3：1混合均匀，制得接收液。
(3)按照细胞浓度为4×106个/mL，将步骤(1)制得的第一试剂与宫颈癌细胞(Hela)混合均匀，制得内相液。
(4)将步骤(1)制得第一试剂泵入同轴双通道喷头的内通道中，将蓖麻油作为外相液泵入同轴双通道喷头的外通道中，并维持第一试剂的流速为1mL/h，第二试剂的流速为3mL/h；对外通道中的第二试剂施加9.1KV电压，以使第二试剂和第一试剂在同轴双通道喷头的喷嘴处形成具有双相结构的液滴，并使液滴滴入到接收液中(喷嘴到金属电极靠近接收液的一面的距离为7cm)，以使液滴在接收液中完成固化，形成微囊，经扫描电镜拍照，结果如图2所示。由图2可知，未包裹细胞的微囊的直径小于10μm。
(5)将步骤(3)制得的内相液泵入同轴双通道喷头的内通道中，将蓖麻油作为外相液泵入同轴双通道喷头的外通道中，并维持内相液的流速为1mL/h，第二试剂的流速为3mL/h；对外通道中的第二试剂施加9.1KV电压，以使第二试剂和内相液在同轴双通道喷头的喷嘴处形成具有双相结构的液滴，并使液滴滴入到接收液中(喷嘴到金属电极靠近接收液的一面的距离为7cm)，以使液滴在接收液中完成固化，形成微囊化的细胞。
(6)将步骤(5)得到的接收液在2000rpm进行离心20分钟得到微囊化的细胞，然后用DMEM培养基清洗微囊化的细胞3遍。
(7)观察步骤(6)清洗后的微囊化的细胞并拍照，结果如图3所示。由图3可知，按照实施例1的方法制得的微囊的直径为20μm～60μm，微囊大小均匀，微囊化细胞基本为一个微囊包裹一个细胞，即微囊化的单细胞制备成功。
实施例2
实施例2的制备微囊化的单细胞的方法大致与实施例1相同，其不同在于，实施例2的第一试剂的组成与实施例1的第一试剂的组成不同，以质量份数计，实施例2的第一试剂的组成为：0.8份的海藻酸钠、0.1份的黄原胶、0.2份的果胶、3份的甘油、0.1份的吐温-80、0.1份的明胶和95.7份的DMEM培养基。
按照实施例2的方法制得的微囊化细胞如图4所示。由图4可知，按照实施例2的方法制得的微囊的直径为20μm～60μm，微囊大小均匀，微囊化细胞基本为一个微囊包裹一个细胞，即微囊化的单细胞制备成功。
实施例3
实施例3的制备微囊化的单细胞的方法大致与实施例1相同，其不同在于，实施例3的第一试剂的组成与实施例1的第一试剂的组成不同，以质量份数计，实施例3的第一试剂的组成为：1.4份的海藻酸钠、0.3份的黄原胶、0.8份的果胶、6份的甘油、0.3份的吐温-80、0.2份的明胶和91份的DMEM培养基。
按照实施例3的方法制得的微囊化细胞如图5所示。由图5可知，按照实施例3的方法制得的微囊的直径为50μm～80μm，微囊化细胞多数为一个微囊包裹一个细胞，即微囊化的单细胞制备成功。
实施例4
实施例4的制备微囊化的单细胞的方法大致与实施例1相同，其不同在于，实施例4的第一试剂的组成与实施例1的第一试剂的组成不同，实施例4的第一试剂中不含果胶，即，以质量份数计，实施例4的第一试剂的组成为：1.2份的海藻酸钠、0.2份的黄原胶、5份的甘油、0.2份的吐温-80、0.1份的明胶和93.3份的DMEM培养基。
按照实施例4的方法制得的微囊化细胞如图6所示。由图6可知，按照实施例4的方法制得的微囊的直径约100μm，微囊大小均匀，微囊化细胞较少数为一个微囊包裹一个细胞。
实施例5
实施例5的制备微囊化的单细胞的方法大致与实施例4相同，其不同在于，实施例5的第一试剂的组成与实施例4的第一试剂的组成不同，实施例5的第一试剂还不含明胶和黄原胶，即，以质量份数计，实施例5的第一试剂的组成为：1.2份的海藻酸钠、5份的甘油、0.2份的吐温-80和93.6份的DMEM培养基。
按照实施例5的方法制得的微囊化细胞如图7所示。由图7可知，按照实施例5的方法制得的微囊的直径为100μm～300μm，微囊大小不均匀，微囊化细胞基本为一个微囊包裹多个细胞。
实施例6
实施例6的制备微囊化的单细胞的方法大致与实施例5相同，其不同在于，实施例6的第一试剂的组成与实施例5的第一试剂的组成不同，实施例6的第一试剂还不含甘油和吐温-80，即，以质量份数计，实施例6的第一试剂的组成为：1.2份的海藻酸钠和98.8份的DMEM培养基。
按照实施例6的方法制得的微囊化细胞如图8所示。由图8可知，按照实施例6的方法制得的微囊的直径为150μm～300μm，微囊化细胞为一个微囊包裹多个细胞。
实施例7
实施例7的制备微囊化的单细胞的方法大致与实施例5相同，其不同在于，实施例7的第一试剂的组成与实施例5的第一试剂的组成不同，实施例7的第一试剂还不含甘油，即，以质量份数计，实施例7的第一试剂的组成为：1.2份的海藻酸钠、0.2份的吐温-80和98.6份的DMEM培养基。
按照实施例7的方法制得的微囊化细胞如图9所示。由图9可知，按照实施例7的方法制得的微囊的直径为150μm～300μm，微囊化细胞为一个微囊包裹多个细胞。
实施例8
实施例8的制备微囊化的单细胞的方法大致与实施例1相同，其不同在于，实施例8的第一试剂的组成与实施例1的第一试剂的组成不同，实施例8的第一试剂还不含果胶和明胶，以质量份数计，实施例8的第一试剂的组成为：1.2份的海藻酸钠、0.2份的黄原胶、5份的甘油、0.2份的吐温-80和93.4份的DMEM培养基。
按照实施例8的方法制得的微囊化细胞如图10所示。由图10可知，按照实施例8的方法制得的微囊的直径为50μm～150μm，微囊大小不均匀，微囊化细胞为一个微囊包裹多个细胞。
对比例1
对比例1的制备微囊化的单细胞的方法大致与实施例1相同，其不同在于，对比例1的第一试剂的组成与实施例1的第一试剂的组成不同，以质量份数计，对比例1的第一试剂的组成为：1.2份的海藻酸钠、0.2份的黄原胶、0.3份的果胶、5份的甘油、0.2份的吐温-80和93.1份的DMEM培养基。
按照对比例1的方法制得的微囊化细胞如图11所示。由图11可知，按照对比例1的方法制得的微囊的直径为30μm～100μm，微囊大小不均匀，微囊化细胞为一个微囊包裹多个细胞。
对比例2
对比例2的制备微囊化的单细胞的方法大致与实施例1相同，其不同在于，对比例2的第一试剂的组成与实施例1的第一试剂的组成不同，以质量份数计，对比例2的第一试剂的组成为：1.2份的海藻酸钠、0.2份的黄原胶、0.1份的果胶、5份的甘油、0.2份的吐温-80、0.1份的明胶和93.2份的DMEM培养基。
按照对比例2的方法制得的微囊化细胞如图12所示。由图12可知，按照对比例2的方法制得的微囊的直径为50μm～200μm，微囊大小不均匀，微囊化细胞为一个微囊包裹多个细胞。
对比例3
对比例3的制备微囊化的单细胞的方法大致与实施例1相同，其不同在于，对比例3的第一试剂的组成与实施例1的第一试剂的组成不同，以质量份数计，对比例3的第一试剂的组成为：1.2份的海藻酸钠、0.2份的黄原胶、1份的果胶、5份的甘油、0.2份的吐温-80、0.1份的明胶和92.3份的DMEM培养基。
按照对比例3的方法制得的微囊化细胞如图13所示。由图13可知，按照对比例3的方法制得的微囊的直径为50μm～250μm，微囊大小不均匀，微囊化细胞为一个微囊包裹多个细胞。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种组合物，用于制备包裹细胞的微囊，其特征在于，以质量份数计，包括0.8份～1.4份的海藻酸钠、0.1份～0.3份的黄原胶、0.2份～0.8份的果胶、3份～6份的甘油、0.1份～0.3份的表面活性剂及0.1份～0.2份的稳定剂，所述稳定剂为明胶。
2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，以质量份数计，所述组合物包括0.8份～1.2份的海藻酸钠、0.1份～0.2份的黄原胶、0.2份～0.3份的果胶、3份～5份的甘油、0.1份～0.2份的表面活性剂及0.1份的稳定剂。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，以质量份数计，所述组合物还包括91份～96份的基础培养基。
4.根据权利要求1或2所述的组合物，其特征在于，所述表面活性剂选自吐温-80、吐温-20及吐温-60中至少一种。
5.一种细胞微囊化试剂盒，其特征在于，包括第一试剂和第二试剂，所述第一试剂为权利要求1～4任一项所述的组合物，所述第二试剂的介电常数为3～5且在10℃～30℃下为液体。
6.根据权利要求5所述的细胞微囊化试剂盒，其特征在于，所述第二试剂选自硅油、玉米油、豆油和蓖麻油中的至少一种。
7.根据权利要求5或6所述的细胞微囊化试剂盒，其特征在于，所述细胞微囊化的试剂盒还包括固化剂，所述固化剂包括氯化钙和乙醇。
8.一种微囊化的单细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
利用同轴电喷技术，将权利要求5～7任一项所述的细胞微囊化试剂盒中的第一试剂与细胞混合后作为内相液，将所述细胞微囊化试剂盒中的第二试剂作为外相液，制备微囊化的单细胞。
9.根据权利要求8所述的微囊化的单细胞的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
将所述第一试剂与细胞混合，制备所述内相液；
将可溶性钙盐溶液与能够溶解所述外相液的试剂混合，制备接收液；及
将所述内相液泵入同轴双通道喷头的内通道中，将所述第二试剂泵入所述同轴双通道喷头的外通道中，并对所述外通道中的第二试剂施加电压，以使所述第二试剂和所述内相液在所述同轴双通道喷头的喷嘴处形成具有双相结构的液滴，并使所述液滴能滴入所述接收液中，其中，所述双相结构的液滴由外相和被所述外相完全包裹的内相组成，所述外相为第二试剂，所述内相为被所述第一试剂包裹着的细胞。
10.根据权利要求9所述的微囊化的单细胞的制备方法，其特征在于，施加到所述第二试剂上的电压为8KV～10KV，所述第二试剂的流速为1mL/h～4mL/h，所述内相液的流速为0.5mL/h～1.5mL/h。
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