CN102168022A - 一株来自植物窝儿七的内生真菌斯氏青霉及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株来自植物窝儿七的内生真菌斯氏青霉及其应用。本发明提供了斯氏青霉(Penicillium ateckii)WEQD CGMCC No.3784。本发明的斯氏青霉WEQD具有产生表鬼臼毒素双葡萄糖苷、黄芪苷和芦丁的生理特性，可用于鬼臼毒素类物质和黄酮类物质的制备。本发明的制备表鬼臼毒素双葡萄糖苷和/或黄芪苷和/或芦丁的方法，发酵条件简单、菌种易培养、生产周期短，具有工业化规模生产的应用潜力。本发明为鬼臼毒素类物质的资源开发提供了新途径，对保护植物生态多样性具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及一株来自植物窝儿七的内生真菌斯氏青霉及其应用。
背景技术
鬼臼毒素(podophyllotoxin)主要存在于小檗科鬼臼属及其近缘植物中，是一类具有广泛生物学活性的天然化合物，有拟雌激素样、抗雌激素样、抗癌、抗病毒、抗真菌、镇静、抑制植物生长和抗氧化等作用。鬼臼毒素具有较强的抗癌活性，其作用机制是抑制微管蛋白的解聚作用以阻止细胞分裂以及抑制DNA拓扑异构酶的活性。鬼臼毒素的糖苷衍生物etoposide和teniposide的毒性较低，对小细胞肺癌、淋巴癌等多种肿瘤疾病均具有很好的疗效，从而成为临床应用的广谱抗肿瘤药物。
目前，鬼臼毒素主要是从野生鬼臼类植物的根茎中提取得到，而这类植物在全世界仅有4属15种，我国有3属12种，主要生长在秦岭、西藏等高海拔地区，其生长缓慢，且鬼臼毒素类物质的含量较低。
由于鬼臼毒素类物质在医学和农林防治等方面具有广阔的应用前景，因而其需求量日益增加。对野生鬼臼类植物资源的大量采集，已使其资源遭到严重破坏，造成生物多样性和生态环境的不可逆的损失。因此解决鬼臼毒素类物质的来源问题具有重要意义。
由于植物生长环境复杂，难以模拟，且其生长周期长，很难进行大规模的人工栽培，而组织培养技术对于鬼臼类植物也不适用。加之，鬼臼毒素类物质化学结构复杂，化学合成虽可进行，但成本太高。而通过基因工程学手段构建工程菌也由于参与形成该类物质的酶数量过多而无法进行。所以利用内生菌具有产生和宿主相同或相似的生物活性物质的性质，来解决鬼臼毒素的来源问题，可能是唯一也是最有效的方法。
近年来，已有学者利用内生菌具有产生和宿主相同或相似的生物活性物质的性质，对我国特有的一些鬼臼类植物的内生菌进行了研究，已有从川八角莲、中华山荷叶中分离到青霉属的内生菌，其培养物经层析分析具有与鬼臼毒素相同的Rf值的报道(中华山荷叶内生真菌的分离及其发酵产生药用成分的初步研究，刘仕平、曾松茸、郭仕平、杨春艳、张玲琪，中国药物与临床，2003.3(3)：227-228；川八角莲内生真菌产鬼臼毒素类似物的初步研究，郭仕平、蒋斌、苏莹珍、刘仕平、张玲琪，生物技术，2004.14(2)：55-56.)。
此外，由于鬼臼类植物中还含有多种黄酮类化合物，因而其内生菌也可能产生黄酮类化合物。许多研究证实，黄酮类化合物在人体中具有多种生物活性，包括抗氧化、抗癌、防癌、清除自由基、抗病毒、消炎和促进血管舒张等。此外，异黄酮(如染料木黄酮和羟基异黄酮)还具有雌激素特性。黄酮类化合物的多种生理作用，使其在医药、食品等行业具有广泛的应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供一株来自植物窝儿七的内生真菌斯氏青霉及其应用。
本发明提供的斯氏青霉(Penicillium ateckii)，命名为WEQD，分离自陕西省眉县红河谷(海拔1560m)采集的植物窝儿七(Diphyllria sinensis L.)的根及根状茎，已于2010年04月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，菌种保藏号为CGMCC No.3784。斯氏青霉(Penicillium ateckii)CGMCC No.3784简称斯氏青霉WEQD。
斯氏青霉WEQD可用于制备表鬼臼毒素双葡萄糖苷和/或黄芪苷和/或芦丁。
本发明还保护一种制备表鬼臼毒素双葡萄糖苷和/或黄芪苷和/或芦丁的方法，是发酵培养斯氏青霉WEQD，得到表鬼臼毒素双葡萄糖苷和/或黄芪苷和/或芦丁。
所述发酵培养的培养基可为马铃薯葡萄糖培养基。
所述发酵培养的条件可为：26-30℃、100-150rpm振荡培养5-9天。所述发酵培养的条件具体可为：28℃、120rpm振荡培养7天。
所述方法还可包括将发酵液进行萃取的步骤。所述萃取的萃取剂具体可为氯仿。
表鬼臼毒素双葡萄糖苷(picropodophillotpxin 7’-O-(β-D-glucopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranoside)的结构式如式I所示。
黄芪苷(Astragalin)的结构式如式II所示。
芦丁(Rutin)的结构式如式III所示。
本发明的斯氏青霉WEQD具有产生表鬼臼毒素双葡萄糖苷、黄芪苷和芦丁的生理特性，可用于鬼臼毒素类物质和黄酮类物质的制备。本发明的制备表鬼臼毒素双葡萄糖苷和/或黄芪苷和/或芦丁的方法，发酵条件简单、菌种易培养、生产周期短，具有工业化规模生产的应用潜力。本发明为鬼臼毒素类物质和黄酮类物质的资源开发提供了新途径，对保护植物生态多样性具有重要意义。
附图说明
图1为斯氏青霉的菌落形态。
图2为斯氏青霉分生孢子头和孢子形态；A为(10×40)时分生孢子头形态，B为(10×100)时分生孢子头形态，C为(10×40)孢子形态。
图3为表鬼臼毒素双葡萄糖苷标准品的HPLC谱图。
图4为黄芪苷标准品的HPLC谱图。
图5为芦丁标准品的HPLC谱图。
图6为氯仿提取物的HPLC谱图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1、斯氏青霉WEQD的分离和鉴定
一、样品的采集
样品为2010年06月自陕西省眉县红河谷(海拔1560m)采集的植物窝儿七(Diphyllria sinensis L.)的根及根状茎。
二、斯氏青霉WEQD的分离和筛选
将采集的样品分别用自来水洗净，在超净工作台中用75％(体积百分含量)乙醇处理5min，然后无菌水冲洗3-5次；而后再用2.5％(质量百分含量)次氯酸钠处理10min，再无菌水冲洗3-5次。用灭菌的镊子和刀片将窝儿七的根的外皮剥去，再切成0.5cm×0.5cm大小的小片种植于PDA固体培养基上，28℃培养3-7天。同时将同样灭菌处理过的窝儿七的根不做剥皮及切割，将窝儿七的根在PDA培养基上滚动一周后，同条件培养作为对照观察。
培养几天后发现在窝儿七的根的切口处有菌丝长出，取切口处新长出的菌丝，转接到新鲜的PDA培养基上培养，待菌落出现后，根据菌落的形态、颜色的差异及菌落长出时间的不同，分别挑取培养基边缘的菌丝接种于新的PDA培养基上进行分离培养，直至筛选出单一的菌落，挑取单菌落作进一步研究。
将上述分离得到的单菌落接种至PDA培养基上，当细胞生长至对数生长后期，菌落大小稳定后，进行单菌落平均状态的描述。将分离得到的菌株命名为WEQD。
三、斯氏青霉WEQD的鉴定
菌株WEQD在PDA培养基上菌落薄，生长局限，产孢面暗蓝绿色或灰绿色，绒状，上泌出多数无色以至鲜黄色的水滴，背面带暗黄色，具体的菌落形态如图1所示。分生孢子梗从菌丝垂直生出，无足细胞，有横隔膜，顶端生排列成帚状的间枝，下部不分枝；间枝长短不一，散开，上生多数平行排列的小梗，小梗8-10×2微米；分生孢子链常作散开的圆柱状；分生孢子球形至椭圆形，直径2-2.5微米。
综合上述特征，依据《真菌鉴定手册》、《中国真菌志》等资料，将菌株WEQD鉴定为斯氏青霉(Penicillium ateckii)，其分类属于半知菌纲、丛梗孢目、丛梗孢科、青霉属。将斯氏青霉(Penicillium ateckii)WEQD保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为No.3784。斯氏青霉(Penicillium ateckii)WEQDCGMCC No.3784简称斯氏青霉WEQD。
实施例2、利用斯氏青霉WEQD制备表鬼臼毒素双葡萄糖苷、黄芪苷和芦丁
一、培养菌株
马铃薯葡萄糖液体培养基(自然pH)：去皮马铃薯200g(切成约2cm2的小块)，放入烧杯中煮沸30min，然后用双层纱布过滤，取滤液加入20g葡萄糖，加水定容至1000mL。
挑取斯氏青霉WEQD的单菌落接种于250ml三角瓶(装有100ml马铃薯葡萄糖液体培养基，已灭菌)中，28℃、120r/min摇床培养7天，得到菌液。
二、制备提取物
1、将菌液用抽滤器抽滤两次，分别收集菌丝体与发酵液。
2、将发酵液用等体积的氯仿(萃取剂)萃取，取萃取液；
3、萃余液用等体积的氯仿(萃取剂)萃取，取萃取液；
反复进行步骤3的操作，每次均取萃余液于紫外吸收检测器(检测波长：254nm)下检测，直至萃余液在紫外吸收检测器下无荧光；合并萃取液，减压蒸馏回收，得到发酵液的氯仿提取物。
三、高效液相色谱(HPLC)检测
将步骤二的氯仿提取物采用高效液相色谱法(HPLC)进行检测，同时以表鬼臼毒素双葡萄糖苷标准品(Changqi ZHAO，Akito NAGATSU，Keiichiro HATAN0，Naohiro SHIRAI，Setsuko KATO，and Yukio OGIHARA，New Lignan Glycosides from Chinese Medicinal Plant：Sinopodophillum emodi，Chem.Pharm.Bull.51(3)：55-261(2003))、黄芪苷(购自中国药品生物制品检定所)和芦丁标准品(购自中国药品生物制品检定所)作为对照。
具体的检测方法如下：
检测前，将表鬼臼毒素双葡萄糖苷标准品、黄芪苷标准品和芦丁标准品以及氯仿提取物分别用甲醇充分溶解，0.45μm微孔滤膜过滤。采用外标法进行分析，每个样品至少重复三次，实验设三次重复。
高效液相色谱仪：Aglient 1100型；
色谱柱：Aglient 1100 Eclipse XDB-C18(5μm，4.6×150mm)；
检测器：紫外检测器；检测波长：254nm；
色谱条件：流动相：甲醇∶水＝60∶40(体积比)；
流速：0.5ml/min；
进样量：5μl；
柱温：室温；
标准品：表鬼臼毒素双葡萄糖苷、黄芪苷和芦丁。
表鬼臼毒素双葡萄糖苷(picropodophillotpxin 7’-O-(β-D-glucopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranoside)标准品的结构式如式I所示。
黄芪苷(Astragalin)标准品的结构式如式II所示。
芦丁(Rutin)标准品的结构式如式III所示。
式III。
图3为表鬼臼毒素双葡萄糖苷标准品的HPLC谱图。图4为黄芪苷标准品的HPLC谱图。图5为芦丁标准品的HPLC谱图。图6为氯仿提取物的HPLC谱图。将氯仿提取物的HPLC谱图分别与表鬼臼毒素双葡萄糖苷标准品、黄芪苷标准品和芦丁标准品的HPLC谱图进行比对。氯仿提取物在保留时间为3.370分钟时具有吸收峰，而表鬼臼毒素双葡萄糖苷标准品在3.401分钟时具有吸收峰，说明氯仿提取物中含有表鬼臼毒素双葡萄糖苷。氯仿提取物在保留时间为4.943分钟时具有吸收峰，而黄芪苷标准品在4.965分钟时具有吸收峰，说明氯仿提取物中含有黄芪苷。氯仿提取物在保留时间为4.394分钟时具有吸收峰，而芦丁标准品在4.459分钟时具有吸收峰，说明氯仿提取物中含有芦丁。以上结果表明，发酵液的氯仿提取物中含有表鬼臼毒素双葡萄糖苷、黄芪苷和芦丁。
四、薄层层析(TLC)检测
将步骤二的氯仿提取物采用薄层层析(TLC)进行检测，同时以表鬼臼毒素双葡萄糖苷标准品、黄芪苷标准品和芦丁标准品作为对照。
具体的检测条件如下：
首先，取表鬼臼毒素双葡萄糖苷标准品、黄芪苷标准品、芦丁标准品和氯仿提取物，分别用甲醇充分溶解，然后分别在正相薄层板和反相薄层板上共层析，在紫外灯下进行检测，并进一步用硫酸-乙醇(15∶85，体积比)显色，观察样品和标准品的斑点荧光颜色和显色后的颜色，并分别计算Rf值。
正相薄层层析：
氯仿层提取物展开剂：氯仿∶甲醇＝80∶20(体积比)。
反相薄层层析：
氯仿层提取物展开剂：甲醇∶水＝60∶40(体积比)。
紫外检测波长：254nm。
在正相层析板上：表鬼臼毒素双葡萄糖苷标准品的Rf值为0.22，而在氯仿提取物中同样存在一个Rf值为0.22的斑点，其斑点与表鬼臼毒素双葡萄糖苷标准品在紫外灯下具有相同的荧光颜色，用硫酸-乙醇色后也具有相同的颜色，说明氯仿提取物中含有表鬼臼毒素双葡萄糖苷；黄芪苷标准品的Rf值为0.30，而在氯仿提取物中同样存在一个Rf值为0.30的斑点，其斑点与黄芪苷标准品在紫外灯下具有相同的荧光颜色，用硫酸-乙醇显色后也具有相同的颜色，说明氯仿提取物样品中含有黄芪苷。
在反相层析板上：表鬼臼毒素双葡萄糖苷标准品的Rf值为0.78，而在氯仿提取物中同样存在一个Rf值为0.78的斑点，其斑点与表鬼臼毒素双葡萄糖苷标准品在紫外灯下具有相同的荧光颜色，用硫酸-乙醇显色后也具有相同的颜色，说明氯仿提取物中含有表鬼臼毒素双葡萄糖苷；黄芪苷标准品的Rf值为0.58，而在氯仿提取物中同样存在一个Rf值为0.58的斑点，其斑点与黄芪苷标准品在紫外灯下具有相同的荧光颜色，用硫酸-乙醇显色后也具有相同的颜色，说明氯仿提取物中含有黄芪苷；芦丁标准品的Rf值为0.68，而在氯仿提取物样品中同样存在一个Rf值为0.68的斑点，其斑点与芦丁标准品在紫外灯下具有相同的荧光颜色，用硫酸-乙醇显色后，也具有相同的颜色，说明氯仿提取物样品中含有芦丁。
Claims (8)
1.斯氏青霉(Penicillium ateckii)WEQD，其保藏编号为CGMCC No.3784。
2.斯氏青霉(Penicillium ateckii)WEQD CGMCC No.3784在制备表鬼臼毒素双葡萄糖苷和/或黄芪苷和/或芦丁中的应用。
3.一种制备表鬼臼毒素双葡萄糖苷和/或黄芪苷和/或芦丁的方法，是发酵培养斯氏青霉(Penicillium ateckii)WEQD CGMCC No.3784，得到表鬼臼毒素双葡萄糖苷和/或黄芪苷和/或芦丁。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述发酵培养的培养基为马铃薯葡萄糖培养基。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于：所述发酵培养的条件为：26-30℃、100-150rpm振荡培养5-9天。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述发酵培养的条件为：28℃、120rpm振荡培养7天。
7.根据权利要求3-6中任一所述的方法，其特征在于：所述方法还包括将发酵液进行萃取的步骤。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述萃取的萃取剂为氯仿。
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