CN113075141A - 一种酵母β-葡聚糖的提取方法及其含量测定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种酵母β‑葡聚糖的提取方法及其含量测定方法，包括将样品加入乙醇溶液溶散均匀，采用苯酚硫酸溶液溶解提取；采用硫酸苯酚法测定样品中的总葡聚糖含量；再用淀粉酶解法测定样品中的非β‑葡聚糖含量；总葡聚糖含量与非β‑葡聚糖含量的差值即为样品中酵母β‑葡聚糖的含量。本发明的提取方法能使酵母β‑葡聚糖得到有效提取，含量测定结果能更能真实反映样品中酵母β‑葡聚糖含量。本发明通过方法学验证，证明该测定方法科学有效，能对酵母β‑葡聚糖原料中的酵母β‑葡聚糖含量起到质量控制的目的。

Description

一种酵母β-葡聚糖的提取方法及其含量测定方法
技术领域
本发明属于保健食品检测领域，具体涉及一种酵母β-葡聚糖的提取方法及其含量测定方法。
背景技术
酵母β-葡聚糖为国家新食品原料，是存在于酵母细胞壁中的一种具有增强免疫力活性的多糖，并具有改善血脂、抗辐射、改善肠道功能的作用。酵母β-葡聚糖以酿酒酵母为原料，经提取、酸碱处理、喷雾干燥等步骤生产而成，主要以β-1,3-D葡萄糖为主链。
中华人民共和国卫生部公2010年第9号规定了酵母β-葡聚糖的含量≥70％，但未指明检测方法。由于酵母β-葡聚糖为非水溶性多糖，常规的水溶解提取方法无法将目标物提取出来，因此需要采用特殊的处理方法将酵母β-葡聚糖转变为水溶性糖，再进行检测。目前检测行业里对酵母β-葡聚糖提取主要采用酸解法(《QB/T 4572-2013酵母β-葡聚糖》)和酶解法(美国药典)，酸解法水解条件剧烈，在将酵母β-葡聚糖水解成葡萄糖的同时，也会破坏一部分葡萄糖，导致检测结果不准确；酶解法专属性好，但该方法需要经过多次的酶解及复杂的操作，整个项目检测时间较长，对酶活的影响因素较多，导致检测结果不稳定，另外酶试剂使用量较大且价格高昂，检测成本高。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种酵母β-葡聚糖的提取方法，该方法既可以保证酵母β-葡聚糖的常温溶解，又可以避免酵母β-葡聚糖不被破坏，使酵母β-葡聚糖能得到有效提取。
本发明是通过以下技术方案实现：
一种酵母β-葡聚糖的提取方法，包括步骤：
将样品加入乙醇溶液溶散均匀，采用苯酚硫酸溶液溶解提取；所述苯酚硫酸溶液中浓硫酸与苯酚溶液的体积比为6-8:2-4。
本发明采用的提取剂为苯酚硫酸溶液，其中浓硫酸为溶解液，在常温条件下，可以溶解酵母β-葡聚糖，解决酵母β-葡聚糖的常温溶解问题，苯酚溶液为保护剂，可以防止酵母β-葡聚糖降解，解决了酵母β-葡聚糖在酸性环境下被破坏的问题，因此，本发明采用苯酚硫酸溶液作为提取剂，避免了剧烈的酸水解条件而引起的酵母β-葡聚糖大量破坏的问题，酵母β-葡聚糖能得到有效提取。
本发明样品为软糖样品，采用乙醇溶液溶解，为使样品溶散均匀，优选的，所述乙醇溶液的质量浓度为80-100％，优选为95％。
本发明采用一定浓度的苯酚硫酸溶液作为提取剂，既可以保证酵母β-葡聚糖的常温溶解，又可以避免酵母β-葡聚糖不被破坏。优选的，所述苯酚硫酸溶液中浓硫酸与苯酚溶液的体积比7:3。
优选的，所述苯酚溶液的质量浓度为4-6％，优选为5％。
本发明还提供了一种酵母β-葡聚糖的含量测定方法，包括如下步骤：
a、使用上述的提取方法对样品进行溶解提取，得到供试品溶液；
b、采用硫酸苯酚法测定样品中的总葡聚糖含量；
c、再用淀粉酶解法测定样品中的非β-葡聚糖含量；
d、总葡聚糖含量与非β-葡聚糖含量的差值即为样品中酵母β-葡聚糖的含量。
优选的，步骤b具体为：在比色管中，先加水和5％苯酚溶液，摇匀，再加供试品溶液，摇匀，加浓硫酸，摇匀，置沸水浴10-20min，冷水冷却，采用比色法于490nm处测定吸光值。
优选的，所述水、5％苯酚溶液与供试品溶液的体积比为1:1:1。
优选的，所述供试品溶液与浓硫酸的体积比为1:5。
本发明与现有技术相比，具有如下有益效果：
本发明提供了一种酵母β-葡聚糖的提取方法，该方法采用苯酚硫酸溶液作为提取剂，提取过程不涉及样品的水解，而且其中的苯酚溶液作为保护剂，既可以保证酵母β-葡聚糖的常温溶解，又可以避免酵母β-葡聚糖不被大量破坏，能使酵母β-葡聚糖得到有效提取。
本发明还提供了一种酵母β-葡聚糖的含量测定方法，采用测定总葡聚糖含量和非β-葡聚糖含量，通过二者差值得到酵母β-葡聚糖的含量，该方法能区分酵母β-葡聚糖和非β-葡聚糖，测定结果能更能真实反映样品中酵母β-葡聚糖含量。
本发明通过方法学验证，证明该测定方法科学有效，能对酵母β-葡聚糖原料中的酵母β-葡聚糖含量起到质量控制的目的。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明，以下实施例为本发明具体的实施方式，但本发明的实施方式并不受下述实施例的限制。
本发明实施例所采用的原料均来源于市购。
实施例1：
一种酵母β-葡聚糖的提取方法，包括步骤：
将样品加入95％乙醇溶液溶散均匀，采用苯酚硫酸溶液溶解提取；所述苯酚硫酸溶液中浓硫酸与苯酚溶液的体积比为7:3，苯酚溶液的质量浓度为5％。
实施例2：
一种酵母β-葡聚糖的提取方法，包括步骤：
将样品加入90％乙醇溶液溶散均匀，采用苯酚硫酸溶液溶解提取；所述苯酚硫酸溶液中浓硫酸与苯酚溶液的体积比为6:4，苯酚溶液的质量浓度为4％。
实施例3：
一种酵母β-葡聚糖的提取方法，包括步骤：
将样品加入85％乙醇溶液溶散均匀，采用苯酚硫酸溶液溶解提取；所述苯酚硫酸溶液中浓硫酸与苯酚溶液的体积比为8:2，苯酚溶液的质量浓度为6％。
实施例4：酵母β-葡聚糖的含量测定方法
1.检验原理
样品采用实施例1方法溶解提取，采用硫酸苯酚法测定样品中的总葡聚糖；再用淀粉酶解法测定样品中的非β-葡聚糖，总葡聚糖含量与非β-葡聚糖含量的差值即为样品中酵母β-葡聚糖的含量。
2试剂
除特殊说明，所用试剂均为分析纯。
2.1.5％苯酚溶液：取苯酚5g，加水溶解并定容至100mL，4℃可保存一个月；
2.2.苯酚硫酸溶液：取浓硫酸70mL，小心加入30mL 5％苯酚溶液中，摇匀(注意冷却后补水至100mL)；
2.3.酵母β-葡聚糖检测试剂盒：Megazyme，编码：K-YBGL，按各瓶标签的要求条件进行保存(也可使用拥有等同效果的检测试剂盒)；
2.4.葡萄糖对照品。
3仪器/设备
电子分析天平：感量为0.01mg；紫外可见光分光光度计；恒温水浴锅；旋涡振荡器。
4分析方法
4.1非β-葡聚糖的测定
按Megazyme酵母β葡聚糖检测试剂盒(编码：K-YBGL)中非β-葡聚糖检测的方法进行检测操作。
4.2酵母β-葡聚糖的测定
4.2.1标准曲线的制备：
称取葡萄糖对照品100mg于1000mL容量瓶中，用水适量溶解并定容，使成0.1mg/mL葡萄糖对照溶液。分别吸取0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL于25mL比色管中，补水至1mL(得0μg、10μg、20μg、40μg、60μg、80μg、100μg标准系列)，先加5％苯酚溶液1mL，摇匀，再加苯酚硫酸溶液1mL，摇匀，加浓硫酸5mL，摇匀，置沸水浴15min，冷水冷却。用空白管调零，于490nm处测定吸光值，以吸光度为纵坐标，葡萄糖质量(μg)为横坐标，制备标准曲线。
4.2.2供试品溶液的制备和测定：
称取样品40～50mg于干燥洁净的25mL容量瓶中，加入95％乙醇0.5mL使样品溶散均匀，用苯酚硫酸溶液定容至刻度，摇匀。室温放置30min，中途摇匀2～3次，使样品充分溶解。精密吸取溶解液1.0mL于另一25mL容量瓶中，加苯酚硫酸溶液稀释并定容，摇匀，得供试品溶液。
于25ml比色管中，先加1mL水和1mL 5％苯酚溶液，摇匀，再加1mL供试品溶液，摇匀，加浓硫酸5mL，摇匀，置沸水浴15min，冷水冷却。于490nm处测定吸光值，在标准曲线上读取供试品溶液中葡萄糖的量(μg)，计算供试品中酵母β-葡聚糖的含量。
4.2.3酵母β-葡聚糖含量(以葡萄糖计)计算
Figure BDA0002999087530000041
式中：X-供试品中酵母β-葡聚糖含量(以葡萄糖计)，％
X1-供试品中非β-葡聚糖含量(以葡萄糖计)，％；
C-供试品溶液中葡萄糖的量，μg；
V-供试品溶液的稀释体积，mL；
m-供试品取样量，mg。:
4.2.4含量测定结果(见表1)
表1：含量测定结果
Figure BDA0002999087530000042
对比例1：酸解法
将三份相同样品采用酸解法(《QB/T 4572-2013酵母β-葡聚糖》)测定，该方法为了补偿因酸解过程中引起的葡萄糖破坏，引入了校正系数，该方法可获得两组数据，即酸水解后的总葡萄糖(以葡萄糖计)和经校正后的酵母β-葡萄糖(以葡萄糖计)，相关数据如表2所示：
表2：QB/T 4572的方法测试结果
Figure BDA0002999087530000051
由表1和表2结果可知，酸水解是在一个非常剧烈的条件下进行，此过程必然会导致水解产物葡萄糖的大量降解，因此检测出的葡萄糖含量会偏低，不能真实反映样品中总的葡萄糖含量。而本发明方法在提取过程中不涉及样品的水解，而且其中添加了苯酚作为保护剂，能有效避免葡萄糖的降解，其结果能真实反映样品中的总葡萄糖含量，因此，其结果准确度明显比酸解法的要好。
另外，酸解法不能区分酵母β-葡聚糖和非β-葡聚糖，样品实际上含有含量不等的非酵母β-葡聚糖，按此方法得出的结果包含了非β-葡聚糖部分，其酵母β-葡聚糖的结果不准确，使结果虚高，另不同时间、不同批次的标准品，水解时获得的校正系数偏差比较大，且参与计算的校正系数会使结果明显虚高，不能真实反映出样品中的实际酵母β-葡聚糖含量。而本发明方法，其非β-葡聚糖的检测方法为非常成熟的方法，采用总葡聚糖含量与非β-葡聚糖含量的差值即为酵母β-葡聚糖含量，结果稳定、可靠，更能真实反映样品中酵母β-葡聚糖含量。
5方法学验证
5.1专属性试验(空白方法)
5.1.1试验方法
不称取样品，分别按上述4.1和4.2的方法处理，测定空白方法溶液的吸光度值。
5.1.2试验数据(见表3)：
表3
Figure BDA0002999087530000052
5.1.3试验结论：
从上表可知，4.1和4.2的空白试液基本无吸收，对结果基本无干扰，表明该方法的专属性良好。
5.2线性范围确认
5.2.1试验数据(见表4-5)：
表4：非β-葡聚糖的测定部分线性关系
Figure BDA0002999087530000061
表5：酵母β-葡聚糖的测定部分线性关系
Figure BDA0002999087530000062
5.2.2线性试验结论
线性评价：非β-葡聚糖的测定部分的相关性为0.99984，该方法测定非β-葡聚糖在浓度0.1mg/mL至1.0mg/mL之间呈现良好的线性；酵母β-葡聚糖的测定部分的相关性为0.99556，该方法测定总葡聚糖在浓度10.3381μg至103.3805μg之间呈现良好的线性，均符合GB/T27404-2008《实验室质量控制规范》的要求【GB/T 27404-2008要求相关性≥0.99】。
5.3检出限
5.3.1试验方法：
于510nm(非β-葡聚糖的测定部分)处及490nm(酵母β-葡聚糖的测定部分)处分别连续20次测定标准空白的吸光度，按下式计算方法的测定低限：
CL＝3Sb/b
式中：CL-方法的测定低限；
Sb-空白值标准偏差；
b-方法校准曲线的斜率。
5.3.2试验数据(见表6-7)：
表6：非β-葡聚糖的测定部分
序号 1 2 3 4 5 6 7
吸光度 0.0001 0.0001 0.0001 0.0001 0.0001 0.0001 0.0001
序号 8 9 10 11 12 13 14
吸光度 -0.0000 0.0000 0.0000 -0.0000 -0.0000 -0.0001 -0.0001
序号 15 16 17 18 19 20 S<sub>b</sub>
吸光度 -0.0000 -0.0000 0.0000 0.0000 -0.0000 0.0000 0.000064
表7：酵母β-葡聚糖的测定部分
序号 1 2 3 4 5 6 7
吸光度 0.0000 0.0001 0.0000 0.0000 0.0000 0.0000 0.0001
序号 8 9 10 11 12 13 14
吸光度 0.0001 0.0001 0.0001 0.0000 0.0001 0.0001 0.0001
序号 15 16 17 18 19 20 S<sub>b</sub>
吸光度 0.0001 0.0001 0.0001 0.0001 0.0001 0.0001 0.000047
5.3.3试验结论：
非β-葡聚糖测定部分的方法的检测浓度为：3×0.000064×1000/1.07223＝0.18μg/mL，按实际样品的处理过程计算，方法的检出限为：0.18×25×100/100＝4.5mg/100g。
酵母β-葡聚糖测定部分的方法的检测浓度为：3×0.000047/0.00787327＝0.018μg，按实际样品的处理过程计算，方法的检出限为：0.018×625×100/40＝28.1mg/100g。
5.4精密度试验
5.4.1试验方法
称取6份样品，按上述“4分析方法”的方法检测样品中非β-葡聚糖和酵母β-葡聚糖含量，计算其RSD(％)。
5.4.2试验数据(见表8-9)
表8：非β-葡聚糖的测定部分
Figure BDA0002999087530000081
表9：酵母β-葡聚糖的测定部分
Figure BDA0002999087530000082
5.4.3试验结论
6份样品非β-葡聚糖含量的RSD为1.7％，表明该方法有较好的精密度，符合GB/T27404-2008《实验室质量控制规范》的要求【GB/T 27404-2008要求RSD(％)≤2.0％】。
6份样品酵母β-葡聚糖含量的RSD为1.0％，表明该方法有较好的精密度，符合GB/T27404-2008《实验室质量控制规范》的要求【GB/T 27404-2008要求RSD(％)≤1.3％】。
5.5耐用性试验(稳定性)
5.5.1试验方法：
按上述“4分析方法”处理样品，将显色后的待测液分别在室温下放置0min、10min、20min、30min、60min、90min、120min后，测定吸光度值，计算其RSD(％)。
5.5.2试验数据(表10)：
表10
放置时间(min) 非β-葡聚糖的测定部分 酵母β-葡聚糖的测定部分
0 0.0472 0.5417
10 0.0472 0.5414
20 0.0464 0.5410
30 0.0465 0.5404
60 0.0462 0.5402
90 0.0459 0.5399
120 0.0457 0.5396
RSD(％) 1.3 0.2
5.5.3试验结论
显色后的待测液分别在室温下放置0min、10min、20min、30min、60min、90min、120min后，非β-葡聚糖的测定部分的RSD为1.3％，酵母β-葡聚糖的测定部分的RSD为0.2％，表明显色后的待测液在室温下120min内的耐用性良好。
5.6准确度试验(标准样品分析)
5.6.1试验方法
取USP酵母β-葡聚糖标准品(标称值78％)按上述“4分析方法”的方法检测酵母β-葡聚糖含量，计算准确度。
5.6.2试验数据(表11-12)：
表11：非β-葡聚糖的测定部分
Figure BDA0002999087530000091
表12：准确度测试部分
Figure BDA0002999087530000101
准确度偏差(％)＝(测得值-标称值)/标称值×100％
5.6.3试验结论
酵母β-葡聚糖准确度偏差为：-2.6％，符合GB/T 27404-2008《实验室质量控制规范》的要求【GB/T 27404-2008要求偏差为＜5％】。
6结论
通过对酵母β-葡聚糖的含量测定方法进行专属性(空白)、线性、检测低限、精密度、耐用性(稳定性)、准确度(标准样品分析)试验，均符合GB/T 27404-2008《实验室质量控制规范》的要求，证明该测定方法科学有效，能对酵母β-葡聚糖原料中的酵母β-葡聚糖含量起到质量控制的目的。

Claims (8)

1.一种酵母β-葡聚糖的提取方法，其特征在于，包括步骤：
将样品加入乙醇溶液溶散均匀，采用苯酚硫酸溶液溶解提取；所述苯酚硫酸溶液中浓硫酸
与苯酚溶液的体积比为6-8:2-4。
2.根据权利要求1所述的酵母β-葡聚糖的提取方法，其特征在于，所述乙醇溶液的质量浓度为80-100%，优选为95%。
3.根据权利要求1所述的酵母β-葡聚糖的提取方法，其特征在于，所述苯酚硫酸溶液中浓硫酸与苯酚溶液的体积比7:3。
4.根据权利要求1或3所述的酵母β-葡聚糖的提取方法，其特征在于，所述苯酚溶液的质量浓度为4-6%，优选为5%。
5.一种酵母β-葡聚糖的含量测定方法，其特征在于，包括如下步骤：
a、使用权利要求1-4任一项所述的提取方法对样品进行溶解提取，得到供试品溶液；
b、采用硫酸苯酚法测定样品中的总葡聚糖含量；
c、再用淀粉酶解法测定样品中的非β-葡聚糖含量；
d、总葡聚糖含量与非β-葡聚糖含量的差值即为样品中酵母β-葡聚糖的含量。
6.根据权利要求5所述的酵母β-葡聚糖的含量测定方法，其特征在于，步骤b具体为：
在比色管中，先加水和5%苯酚溶液，摇匀，再加供试品溶液，摇匀，加浓硫酸，摇匀，置沸水浴10-20min，冷水冷却，采用比色法于490nm处测定吸光值。
7.根据权利要求6所述的酵母β-葡聚糖的含量测定方法，其特征在于，所述水、5%苯酚溶液与供试品溶液的体积比为1:1:1。
8.根据权利要求6所述的酵母β-葡聚糖的含量测定方法，其特征在于，所述供试品溶液与浓硫酸的体积比为1:5。
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