CN108445113A - 检测血液中氯硝西泮含量的在线固相萃取液相色谱分析方法 - Google Patents

检测血液中氯硝西泮含量的在线固相萃取液相色谱分析方法 Download PDF

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Abstract

本发明检测血液中氯硝西泮含量的在线固相萃取液相色谱分析方法是使用高效液相色谱仪和DVD检测器对标准溶液进行标定，拟合得到标准曲线方程为y＝a*x+b，取待测血液样品，在该待检测血液经过处理后，同样使用高效液相色谱仪和DVD检测器对待测的样品进行检测，得到待测血液y值，将待测血液y代入标准曲线方程中，通过计算得到待测血液样品中氯硝西泮相对浓度x，内标物工作液浓度是已知的，由此计算得到该样本中待检测血液中的氯硝西泮药物浓度，本发明血清经沉淀离心后直接进样，使检测过程简便快速，实验成本降低，更利于在临床治疗中对患者体内的氯硝西泮血药浓度进行监测。

Description

检测血液中氯硝西泮含量的在线固相萃取液相色谱分析方法
技术领域
本发明涉及精神类药物的临床血药浓度监测技术领域，尤其涉及一种检测血液中抗癫痫抗惊厥药物氯硝西泮浓度的方法。
背景技术
癫痫是常见的神经系统疾病，有突然、反复发作的特点，目前临床上首选药物治疗。氯硝西泮是广谱的抗癫痫药物，用于控制各型癫痫发作，对失神发作、婴儿痉挛症、肌阵挛性及运动不能性发作疗效较好。也可用于药物引起的注意缺陷障碍(多动症)和各种神经痛的治疗。其口服后通过胃肠道后，在血液中循环的活性化合物为氯硝西泮。氯硝西泮(Clonazepam，CZP)，分子式为C15H10ClN3O3，具体化学结构如下图1所示。氯硝西泮的有效血药浓度参考区间：20.00～70.00ng/mL(抗惊厥)4.00～80.00ng/mL(抗焦虑催眠)，当血药浓度＞100ng/mL时，毒副作用增强。常见不良反应有动作不灵活、步态不稳、嗜睡，共济失调及行为紊乱如激动、兴奋、不安、出现攻击行为等；少见的有视力模糊、便秘、腹泻、眩晕或头昏、头痛、气管分泌物增多或流涎、恶心、呕吐、排尿障碍、语言不清、口干。氯硝西泮主要通过神经系统发挥其药理作用，由于其治疗窗较窄，体内代谢过程存在较大的个体差异，服药周期长，给药剂量和血药浓度相关性不稳定，而血药浓度与疗效及毒性反应相关，用药剂量不足与药物过量的临床症状相似，所以对其血药浓度的监测是调整剂量，减少不良反应的重要参考，在临床用药中具有重大意义。
目前常用的氯硝西泮血药浓度的测定方法众多，各有优缺点，包括高效液相色谱法、气相色谱法、液相色谱串联质谱法等。气相色谱法检测时对样本先进行衍生化处理，此前处理过程较为繁琐。液相色谱串联质谱法测定血药浓度具有灵敏度高、专属性强等优点，成本较高，且对人员和环境的要求较高。高效液相色谱法定量准确，重现性好，且经济效益好，但目前仍存在前处理复杂，分析时间较长等问题。
发明内容
针对上述技术问题，本发明目的是提供一种检测血液中氯硝西泮药物浓度的方法，使氯硝西泮血药浓度的测定快速准确，很大程度上缩短样本分析时间。
本发明采用的技术方案是：
本发明的一种检测血液中氯硝西泮含量的在线固相萃取液相色谱分析方法，其中：它包括以下步骤：
(一)标准溶液的标定
首先用移液枪将至少三种不同浓度的标准工作液10μL、10μL标准内标液和190μL空白血清分别置于1.5ml离心管中混合制成至少三种标准溶液，上述标准溶液分别在转速为1000-2000rpm下涡旋混匀30s-1min后，加入含有0.2mol/L硫酸锌甲醇溶液的沉淀剂200μL，并在转速为1200-2000rpm下涡旋混匀2-4min后，再在转速10000-15000rpm下高速离心4-6min后，得到上清液，分别取上述上清液200uL，用高效液相色谱仪和DVD检测器对上述上清液进行检测，分别得出上述至少三种标准溶液中的氯硝西泮色谱图和2-萘酚色谱图，以上述至少三个标准溶液的氯硝西泮峰面积与2-萘酚峰面积之比作为标准曲线图的纵坐标y，以上述标准工作液中含有氯硝西泮的浓度与标准内标液中含有2-萘酚浓度之比作为标准曲线图的横坐标x，将以上检测所得至少三组数据进行线性回归，拟合得到标准曲线方程为y＝a*x+b，并且得出权重系数a和b，标准工作液是含有氯硝西泮的溶液，标准内标液是含有2-萘酚的溶液；
(a)标准工作液的配制：
精确称取氯硝西泮标准品1.58mg置于2mL容量瓶中，用2mL甲醇进行溶解，得到标准储备液A，其氯硝西泮的浓度为790ug/mL，将标准储备液A用含水量为10％-40％的甲醇溶液的沉淀液进行沉淀，分别在含有200-4000ng/mL氯硝西泮的范围内配置出各浓度的标准工作液，并在-80℃条件下保存；
(b)标准内标液的配制
精确称取2-萘酚标准品2.04mg于2mL试管中，用2mL甲醇进行溶解，得到内标储备液B，其2-萘酚浓度为1020ug/L，将内标储备液B用含水量为10％-40％的甲醇溶液的沉淀液进行沉淀，得到含有2-萘酚浓度为50ug/L的标准内标液，并在-80℃条件下保存，
(二)检测血液的离心
取待检测血液至少5ml，在离心速度为3500rpm下离心10min，得到上清液即血清，将上述血清置于-20℃冷冻下保存至分析前备用；
(三)待测样品处理
(c)用移液枪移取步骤(b)的标准内标液10uL于1.5ml的离心管中，然后加入步骤(二)的200uL的血清于上述离心管中，在离心速度为1500-2500rpm下离心30s-1min；然后在上述离心管中加入含有0.2mol/L硫酸锌甲醇溶液的沉淀剂200μL，并在转速为1200-2000rpm下涡旋混匀2-4min后，再在转速10000-15000rpm下高速离心4-6min后，得到上清液即为待测样品；
(四)待测样品的检测
移取步骤(c)待测样品200uL，使用高效液相色谱仪和DVD检测器对上述待测样品进行检测，得出上述待测样品的氯硝西泮色谱图和2-萘酚色谱图，将上述色谱图中的氯硝西泮峰面积和2-萘酚峰面积之比y代入上述步骤(一)的标准曲线方程y＝a*x+b中，通过计算得到待检测样品中氯硝西泮浓度与标准内标液中2-萘酚浓度之比x，标准内标液中2-萘酚浓度是已知的，通过计算得到待检测血液中的氯硝西泮药物浓度；
本发明的一种检测血液中氯硝西泮含量的在线固相萃取液相色谱分析方法，其中：在步骤(一)中使用七种不同浓度的标准工作液，七种不同浓度的标准工作液分别为含有200、500、1000、1500、2000、3000和4000ng/mL浓度的氯硝西泮溶液；
本发明的一种检测血液中氯硝西泮含量的在线固相萃取液相色谱分析方法，其中：所述沉淀剂是将0.2mol硫酸锌超声溶解在1L甲醇中制成的；
本发明的一种检测血液中氯硝西泮含量的在线固相萃取液相色谱分析方法，其中：在步骤(a)和(b)中的沉淀液是由3∶7的水和甲醇组成的沉淀液；
本发明的一种检测血液中氯硝西泮含量的在线固相萃取液相色谱分析方法，其中：所述高效液相色谱仪还包括：在线固相萃取装置，在线固相萃取装置所使用的萃取柱为SHISEIDO，MF-Ph-1 S-5(NNJV)；
本发明的一种检测血液中氯硝西泮含量的在线固相萃取液相色谱分析方法，其中：所述高效液相色谱仪所使用的分析色谱柱为Waters，C18；所使用的在线过滤器为SSI COL PRE-FILTER WATER 1/16 0.5M，高效液相色谱仪设置的柱温为50℃，进样量为100uL；
本发明的一种检测血液中氯硝西泮含量的在线固相萃取液相色谱分析方法，其中：所述在线固相萃取装置的萃取柱流动相为水，萃取柱流速为2.0mL/min，萃取柱采用反冲模式；
本发明的一种检测血液中氯硝西泮含量的在线固相萃取液相色谱分析方法，其中：所述分析色谱柱的流动相含有20∶12∶68比例的乙腈∶甲醇∶水，分析色谱柱流速为0.6mL/min，分析色谱柱采用等度洗脱方式；
本发明的一种检测血液中氯硝西泮含量的在线固相萃取液相色谱分析方法，其中：所述DVD检测器为Vanquish二极管阵列检测器，其检测波长为330nm；
本发明的一种检测血液中氯硝西泮含量的在线固相萃取液相色谱分析方法，其中：所述含水量为体积比的含水量。
本发明有益效果：
本发明所述的检测血液中氯硝西泮药物浓度的在线固相萃取液相分析方法，血清经沉淀离心后直接进样，减少了人员操作，提高了定量结果的准确性，极大地缩短分析时间，使检测过程简便快速，实验成本降低，更利于在临床治疗中对患者体内的氯硝西泮血药浓度进行监测，为氯硝西泮的个性化给药、减少毒副反应的发生提供实验基础。
附图说明
图1为氯硝西泮化学结构式；
图2为实施例中标准溶液中氯硝西泮色谱图；
图3为实施例中加标血清样本中氯硝西泮色谱图。
在图2和图3中，标注1为氯硝西泮的峰面积；标注2为2-萘酚的峰面积。
下面将结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明。
具体实施方式
本发明的一种检测血液中氯硝西泮含量的在线固相萃取液相色谱分析方法，它包括以下步骤：
(一)标准溶液的标定
首先用移液枪将七种不同浓度的标准工作液10μL、10μL标准内标液和190μL空白血清分别置于1.5ml离心管中混合制成七种标准溶液，上述标准溶液分别在转速为2000rpm下涡旋混匀30s后，加入含有0.2mol/L硫酸锌甲醇溶液的沉淀剂200μL(沉淀剂是将0.2mol硫酸锌超声溶解在1L甲醇中制成的)，并在转速为2000rpm下涡旋混匀3min后，再在转速12000rpm下高速离心5min后，得到上清液，分别取上述上清液200uL，用高效液相色谱仪和DVD检测器对上述上清液进行检测，分别得出上述至少三种标准溶液中的氯硝西泮色谱图和2-萘酚色谱图，以上述至少七个标准溶液的氯硝西泮峰面积与2-萘酚峰面积之比作为标准曲线图的纵坐标y，以上述标准工作液中含有氯硝西泮的浓度与标准内标液中含有2-萘酚浓度之比作为标准曲线图的横坐标x，将以上检测所得至少七组数据进行线性回归，拟合得到标准曲线方程为y＝a*x+b，并且得出权重系数a和b，标准工作液是含有氯硝西泮的溶液，标准内标液是含有2-萘酚的溶液；
(a)标准工作液的配制：
精确称取氯硝西泮标准品1.58mg置于2mL容量瓶中，用2mL甲醇进行溶解，得到标准储备液A，其氯硝西泮的浓度为790ug/mL，将标准储备液A用含水量为30％的甲醇溶液的沉淀液进行沉淀，分别配制出含有200、500、1000、1500、2000、3000和4000ng/mL浓度的氯硝西泮溶液作为标准工作液，并在-80℃条件下保存；
(b)标准内标液的配制
精确称取2-萘酚标准品2.04mg于2mL试管中，用2mL甲醇进行溶解，得到内标储备液B，其2-萘酚浓度为1020ug/L，将内标储备液B用含水量为30％的甲醇溶液的沉淀液进行沉淀，得到含有2-萘酚浓度为50ug/L的标准内标液，并在-80℃条件下保存，
(二)检测血液的离心
取待检测血液至少5ml，在离心速度为3500rpm下离心10min，得到上清液即血清，将上述血清置于-20℃冷冻下保存至分析前备用；
(三)待测样品处理
(c)用移液枪移取步骤(b)的标准内标液10uL于1.5ml的离心管中，然后加入步骤(二)的200uL的血清于上述离心管中，在离心速度为2000rpm下离心30s；然后在上述离心管中加入含有0.2mol/L硫酸锌甲醇溶液的沉淀剂200μL，并在转速为2000rpm下涡旋混匀3min后，再在转速12000rpm下高速离心5min后，得到上清液即为待测样品；
(四)待测样品的检测
移取步骤(c)待测样品200uL，使用高效液相色谱仪和DVD检测器对上述待测样品进行检测，得出上述待测样品的氯硝西泮色谱图和2-萘酚色谱图，将上述色谱图中的氯硝西泮峰面积和2-萘酚峰面积之比y代入上述步骤(一)的标准曲线方程y＝a*x+b中，通过计算得到待检测样品中氯硝西泮浓度与标准内标液中2-萘酚浓度之比x，标准内标液中2-萘酚浓度是已知的，通过计算得到待检测血液中的氯硝西泮药物浓度。
现有高效液相色谱仪包括：进样模块、液相泵模块和柱温模块，本申请的高效液相色谱仪还包括：在线固相萃取装置，在线固相萃取装置在进样模块和液相泵模块之间，线固相萃取仪所使用的萃取柱为SHISEIDO，MF-Ph-1 S-5(NNJV)，在线固相萃取装置的萃取柱流动相为水，萃取柱流速为2.0mL/min，萃取柱采用反冲模式；高效液相色谱仪所使用的在线过滤器为SSI COL PRE-FILTER WATER 1/16 0.5M，所使用的分析色谱柱为Waters，C18，设置的柱温为50℃，进样量为100uL，分析色谱柱流动相含有20∶12∶68比例的乙腈∶甲醇∶水，分析色谱柱流速为0.6mL/min，分析色谱柱采用等度洗脱方式；DVD检测器为Vanquish二极管阵列检测器，其检测波长为330nm。含水量为体积比的含水量。
本实施例中技术方法论证如下：
一、该方法的线性关系和定量限
将上述配制的10μL的各个浓度(200-4000ng/mL)的氯硝西泮标准工作液，加入190μL空白血清混匀，经沉淀后进样，氯硝西泮浓度在10ng/mL到200ng/mL范围内，按本实施例测定条件，按浓度由低到高进行测定，以定量色谱峰面积-浓度作图，得到标准曲线，结果表明氯硝西泮的线性范围和定量限如下：
(1)检测限(LOD)：1.39ng/mL。
(2)定量限(LOQ)：4.63ng/mL。
(3)线性范围：
氯硝西泮在10ng/mL到200ng/mL范围内，线性良好，相关系数R2＞0.99。
二、该方法的回收率和精密度
取氯硝西泮标准工作液配制成高、中、低3种浓度进行加样回收率实验和精密度实验，按本实施例方法进行测定，重复分析测定3批次，其回收率和精密度分别如表1。其在低、中、高的3个添加水平范围内的平均回收率为99.20％～100.18％，相对标准偏差为1.58％～3.46％，表1为氯硝西泮加标回收率和精密度。
加标量/(ng/mL) 25.00 75.00 150.00
平均回收率/％ 99.20 99.24 100.18
精密度RSD/％ 3.46 2.70 1.58
表1
综合上述验证试验，本实施例的检测限，回收率和精密度等各项技术指标均符合要求，方法检测血液中氯硝西泮药物浓度，重现性良好，加样回收率高，提高了检测结果的准确度。
血清样本中氯硝西泮色谱图见图3，标准溶液中氯硝西泮色谱图见图2，氯硝西泮保留时间为7.80min，内标保留时间为7.00min，由图2和图3可知本实施例方法目标化合物的识别准确，且分析时间短、干扰小，特异性强。
以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种检测血液中氯硝西泮含量的在线固相萃取液相色谱分析方法，其特征在于：它包括以下步骤：
(一)标准溶液的标定
首先用移液枪将至少三种不同浓度的标准工作液10μL、10μL标准内标液和190μL空白血清分别置于1.5ml离心管中混合制成至少三种标准溶液，上述标准溶液分别在转速为1000-2000rpm下涡旋混匀30s-1min后，加入含有0.2mol/L硫酸锌甲醇溶液的沉淀剂200μL，并在转速为1200-2000rpm下涡旋混匀2-4min后，再在转速10000-15000rpm下高速离心4-6min后，得到上清液，分别取上述上清液200uL，用高效液相色谱仪和DVD检测器对上述上清液进行检测，分别得出上述至少三种标准溶液中的氯硝西泮色谱图和2-萘酚色谱图，以上述至少三个标准溶液的氯硝西泮峰面积与2-萘酚峰面积之比作为标准曲线图的纵坐标y，以上述标准工作液中含有氯硝西泮的浓度与标准内标液中含有2-萘酚浓度之比作为标准曲线图的横坐标x，将以上检测所得至少三组数据进行线性回归，拟合得到标准曲线方程为y＝a*x+b，并且得出权重系数a和b，标准工作液是含有氯硝西泮的溶液，标准内标液是含有2-萘酚的溶液；
(a)标准工作液的配制：
精确称取氯硝西泮标准品1.58mg置于2mL容量瓶中，用2mL甲醇进行溶解，得到标准储备液A，其氯硝西泮的浓度为790ug/mL，将标准储备液A用含水量为10％-40％的甲醇溶液的沉淀液进行沉淀，分别在含有200-4000ng/mL氯硝西泮的范围内配制出各浓度的标准工作液，并在-80℃条件下保存；
(b)标准内标液的配制
精确称取2-萘酚标准品2.04mg于2mL试管中，用2mL甲醇进行溶解，得到内标储备液B，其2-萘酚浓度为1020ug/L，将内标储备液B用含水量为10％-40％的甲醇溶液的沉淀液进行沉淀，得到含有2-萘酚浓度为50ug/L的标准内标液，并在-80℃条件下保存，
(二)检测血液的离心
取待检测血液至少5ml，在离心速度为3500rpm下离心10min，得到上清液即血清，将上述血清置于-20℃冷冻下保存至分析前备用；
(三)待测样品处理
(c)用移液枪移取步骤(b)的标准内标液10uL于1.5ml的离心管中，然后加入步骤(二)的200uL的血清于上述离心管中，在离心速度为1500-2500rpm下离心30s-1min；然后在上述离心管中加入含有0.2mol/L硫酸锌甲醇溶液的沉淀剂200μL，并在转速为1200-2000rpm下涡旋混匀2-4min后，再在转速10000-15000rpm下高速离心4-6min后，得到上清液即为待测样品；
(四)待测样品的检测
移取步骤(c)待测样品200uL，使用高效液相色谱仪和DVD检测器对上述待测样品进行检测，得出上述待测样品的氯硝西泮色谱图和2-萘酚色谱图，将上述色谱图中的氯硝西泮峰面积和2-萘酚峰面积之比y代入上述步骤(一)的标准曲线方程y＝a*x+b中，通过计算得到待检测样品中氯硝西泮浓度与标准内标液中2-萘酚浓度之比x，标准内标液中2-萘酚浓度是已知的，通过计算得到待检测血液中的氯硝西泮药物浓度。
2.如权利要求1所述的检测血液中氯硝西泮含量的在线固相萃取液相色谱分析方法，其特征在于：在步骤(一)中使用七种不同浓度的标准工作液，七种不同浓度的标准工作液分别为含有200、500、1000、1500、2000、3000和4000ng/mL浓度的氯硝西泮溶液。
3.如权利要求2所述的检测血液中氯硝西泮含量的在线固相萃取液相色谱分析方法，其特征在于：所述沉淀剂是将0.2mol硫酸锌超声溶解在1L甲醇中制成的。
4.如权利要求3所述的检测血液中氯硝西泮含量的在线固相萃取液相色谱分析方法，其特征在于：在步骤(a)和(b)中的沉淀液是由3∶7的水和甲醇组成的沉淀液。
5.如权利要求4所述的检测血液中氯硝西泮含量的在线固相萃取液相色谱分析方法，其特征在于：所述高效液相色谱仪还包括：在线固相萃取装置，在线固相萃取装置所使用的萃取柱为SHISEIDO，MF-Ph-1 S-5(NNJV)。
6.如权利要求5所述的检测血液中氯硝西泮含量的在线固相萃取液相色谱分析方法，其特征在于：所述高效液相色谱仪所使用的分析色谱柱为Waters，C18，所使用的在线过滤器为SSI COL PRE-FILTER WATER 1/16 0.5M，高效液相色谱仪设置的柱温为50℃，进样量为100uL。
7.如权利要求5所述的检测血液中氯硝西泮含量的在线固相萃取液相色谱分析方法，其特征在于：所述在线固相萃取装置的萃取柱流动相为水，萃取柱流速为2.0mL/min，萃取柱采用反冲模式。
8.如权利要求6所述的检测血液中氯硝西泮含量的在线固相萃取液相色谱分析方法，其特征在于：所述分析色谱柱的流动相含有20∶12∶68比例的乙腈∶甲醇∶水，分析色谱柱流速为0.6mL/min，分析色谱柱采用等度洗脱方式。
9.如权利要求7或8所述的检测血液中氯硝西泮含量的在线固相萃取液相色谱分析方法，其特征在于：所述DVD检测器为Vanquish二极管阵列检测器，其检测波长为330nm。
10.如权利要求9所述的检测血液中氯硝西泮含量的在线固相萃取液相色谱分析方法，其特征在于：所述含水量为体积比的含水量。
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