CN101581704A - 用于检测肿瘤的乙酰化金刚烷胺的测定方法 - Google Patents
用于检测肿瘤的乙酰化金刚烷胺的测定方法 Download PDFInfo
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Abstract
一种用于检测肿瘤的乙酰化金刚烷胺的测定方法，属于生物医学技术领域。本发明通过向人体给药金刚烷胺，从人体中获取液体样品，采用高效液相色谱－电喷雾离子阱质谱联用技术，即采用氘代乙酰化金刚烷胺作为内标物进行色谱质谱分析，来测定样品中乙酰化金刚烷胺的浓度。本发明使用的药物剂型扩大到口服剂型，使得更易于操作、应用范围更广泛，本发明能够在人体生物体液中检测出低水平浓度的亚精胺和精胺N1－乙酰转移酶代谢产物，从而显示出亚精胺和精胺N1－乙酰转移酶的活性，最终间接提示人体的肿瘤细胞。
Description
技术领域
本发明涉及的是一种用于生物医学技术领域的检测方法，具体地说，是一种用于检测肿瘤的乙酰化金刚烷胺的测定方法。
背景技术
科学家们曾经尝试检测出肿瘤和癌细胞的存在。这些方法大体上可以分为四类：(1)基因组学方法；(2)蛋白质组学方法；(3)代谢组学方法；(4)代谢产物学方法。其中，基因组学方法是对生物体基因组的研究。该领域包括集中精力对生物体整个DNA(脱氧核糖核酸)序列进行测定，并努力绘制精密标度的遗传图谱。蛋白质组学方法是对蛋白质的大规模研究，尤其是对蛋白质的结构和功能。代谢组学方法研究的是机体对化学药物、环境变化和疾病的代谢反应。代谢组学是对代谢产物学的组学延伸。代谢组是指一个生物有机体所有代谢产物的集合，这些代谢产物是该有机体基因表达的最终产物。
1960年杜邦实验室首次合成金刚烷胺。金刚烷胺具有独特的多环脂肪族结构，并有一个无手性伯胺，从而使得它具有弱碱性。在生理PH条件下，它主要以阳离子的形式存在。在加拿大，金刚烷胺批准用于以下两个临床适应症：帕金森综合症缓解辅助治疗和甲型流感病毒的预防和治疗。布雷德那(Bleidner)等人首次发表了关于金刚烷胺代谢的论文，文中指出没有任何证据表明人体尿液中含有乙酰化或甲基化的金刚烷胺，也没有发现其它外来峰归属于金刚烷胺的代谢产物。这一观点被广泛接受，并奠基了关于金刚烷胺代谢的普遍观点和一个公认的假设，即：物料的失衡是由于口服吸收的不完全因素导致的。然而，最近有证据表明金刚烷胺是可以通过某种特殊的乙酰转移酶进行乙酰化的。
经对现有技术的文献检索发现，美国专利号US6811967B2，公开日为2002年9月19日，专利名称为：检测精胺碱/精胺N1-乙酰转移酶亚精胺活性的非精胺/亚精胺活性检测方法，该专利自述为：使用SSAT(spermine/spermidine acetyltransferase，亚精胺和精胺N1-乙酰转移酶)过度表达的转基因小鼠进行试验，结果显示无论是在体内还是在体外，金刚烷胺都出现了乙酰化，这表明SSAT是金刚烷胺乙酰化的一种途径。体外研究使用转基因小鼠的肝胞液作为SSAT来源，结果证实亚精胺有乙酰化的催化活性：蛋白质表观Km(米氏常数)＝267±46μM和表观Vmax＝0.009±0.002nmol/min/mg。金刚烷胺竞争性地抑制亚精胺乙酰化催化作用，表观Ki＝738±157μM。在乙酰辅酶A再生系统中培养金刚烷胺和SSAT，结果产生了适量的乙酰化金刚烷胺。N-乙酰基转移酶2(NAT2)底物和磺胺二甲嘧啶都可抑制亚精胺乙酰化催化作用，计算出来的Ki＝3.5mM，这一结果显示SSAT可能是NAT2底物乙酰化的另外一条途径。N-乙酰化转移酶1(NAT1)底物和P-氨基苯甲酸则没有抑制作用。这些结果都证实了SSAT可以乙酰化金刚烷胺，并且金刚烷胺可能是SSAT的专属性药物底物。给转基因小鼠注射3mg/kg的盐酸金刚烷胺，24小时后，小鼠排泄出给药剂量的4.5+1％的乙酰化金刚烷胺。在对照组中的非转基因小鼠重复上述步骤，结果发现在它们的尿液中没有检测到乙酰化金刚烷胺。这一结果表明在小鼠肿瘤细胞内SSAT酶上调表达。该专利的不足之处是：该专利的给药方法是注射形式，并且其涉及的转基因小鼠试验中采用的气相色谱分析方法仅仅适用于老鼠，而并不适用于人体，无法到检测人体尿液中低浓度的乙酰化金刚烷胺，因此也无法进一步检测到人体的肿瘤细胞。造成这一现象的原因是人体和小鼠的新陈代谢、体重和其它环境因素(如：饮食、年龄和性别)都不相同，人体和小鼠体内乙酰化金刚烷胺的浓度不同，所以适用于小鼠检测的气相色谱分析方法并不适用于检测人体尿液中的乙酰化金刚烷胺。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种用于检测肿瘤的乙酰化金刚烷胺的测定方法，使其更加灵敏地可以检测到人体尿液中低浓度的乙酰化金刚烷胺，从而进一步间接检测到人体的肿瘤细胞。
本发明是通过以下技术方案实现的，本发明通过向人体给药金刚烷胺，从人体中获取液体样品，采用高效液相色谱-电喷雾离子阱质谱联用技术(HPLC/MS/MS，HighPerformance Liquid Chromatography/Mass Spectrometry/Mass Spectrometry)来测定样品中乙酰化金刚烷胺的浓度。
所述的高效液相色谱-电喷雾离子阱质谱联用技术是指采用氘代乙酰化金刚烷胺作为内标物进行色谱质谱分析测定样品中乙酰化金刚烷胺的浓度。
所述的高效液相色谱-电喷雾离子阱质谱联用技术，其具体步骤如下：(1)制备校正标准品溶液和质量控制(QC，Quality Control)样品溶液；(2)加氘代乙酰化金刚烷胺至试管内；(3)加乙酰化金刚烷胺储备溶液至上述试管内；(4)加金刚烷胺储备溶液至上述试管内；(5)涡旋震荡后，加人体尿液至上述试管内；(6)涡旋震荡后，加磷酸盐缓冲液至上述试管内；(7)涡旋震荡后，再离心，加乙酸乙酯溶液至上述试管内；(8)将上层清夜转移至试管内，在水浴锅蒸发至干燥；(9)将甲醇甲酸水溶液涡旋震荡后，再超声处理，然后使用该溶液复溶干燥残留物；(10)将样品转移至HPLC(highperformance liquid chromatography，高效液相色谱)进样瓶中，然后离心；(11)使用HPLC/MS/MS仪器进行色谱质谱分析，测定尿液样品中乙酰化金刚烷胺的浓度。
所述的色谱质谱分析，其色谱系统分析的HPLC流动相A是溶于去离子水的甲酸。
所述的色谱质谱分析，其色谱系统分析的HPLC流动相B是溶于甲醇的甲酸。
所述的色谱质谱分析，其色谱系统分析的HPLC色谱条件设置如下：当时间为0分钟时，流动相A为95％，流动相B为5.0％，流速为0.30mL/分钟；当时间为1分钟时，流动相A为95％，流动相B为5.0％，流速为0.30mL/分钟；当时间为1.1分钟时，流动相A为5％，流动相B为95.0％，流速为0.30mL/分钟；当时间为6分钟时，流动相A为5％，流动相B为95.0％，流速为0.30mL/分钟；当时间为6.1分钟时，流动相A为95％，流动相B为5.0％，流速为0.30mL/分钟；当时间为11分钟时，流动相A为95％，流动相B为5.0％，流速为0.30mL/分钟。
所述的色谱质谱分析，其质谱参数设置是采用电喷射离子化。
所述的色谱质谱分析，其质谱参数设置是正离子模式。
所述的色谱质谱分析，其质谱参数设置是毛细管电压3.3KV。
所述的超声处理，其温度为25℃。
在本发明中，建立HPLC/MS/MS分析法的过程解释如下：在临床试验中，检测收集的尿样中金刚烷胺和乙酰化金刚烷胺的浓度。在建立方法时，需要确定在人体尿液中金刚烷胺和乙酰化金刚烷胺的萃取回收率，还需要确定分析的方法参数和数据的可接受标准，以及相应的质谱和色谱参数，然后需要验证该分析方法的操作程序可以满足甚至超过预先设定的数据的可接受标准。
所述的方法参数包括：定性样品、储备溶液的稳定性、系统适应性、方法选择性和专属性、定量范围和线性(校正标准品溶液)、方法准确度和精密度、萃取回收率、检测下限。
定性样品数据的可接受标准是指根据已有的数据，在体外(离体条件下)，使用掺加有待检化合物的储备溶液配制的校正标准品溶液和QC(Quality Control，质量控制)样品溶液。
储备溶液的稳定性数据的可接受标准是指每个分析批次都使用新鲜配制的金刚烷胺和乙酰化金刚烷胺对照品储备溶液。
系统适应性数据的可接受标准是指共进样6针QC尿液样品提取物，其中最后3针的CV(变异系数)小于等于10％。
方法选择性和专属性数据的可接受标准是指进样3针人体尿液样品作为空白对照；进样3针掺加有金刚烷胺和乙酰化金刚烷胺的尿样；进样3针掺加有氘代乙酰化金刚烷胺人体尿液样品。
定量范围和线性(校正标准品溶液)数据的可接受标准是指每个分析批次的尿液至少应配制有5个浓度的掺加有金刚烷胺和乙酰化金刚烷胺的校正标准品溶液。
方法准确度和精密度数据的可接受标准是指每个分析批次的尿液至少应配制有3个浓度的掺加有金刚烷胺和乙酰化金刚烷胺QC样品溶液。可接受标准：平均误差±15％；CV小于等于15％。
萃取回收率数据的可接受标准是指每个分析批次的尿液至少应配制有3个浓度的掺加有金刚烷胺和乙酰化金刚烷胺的回收率测定样品溶液。
检测下限数据的可接受标准是指每个分析批次的尿液(体外已掺加QC样品)中金刚烷胺和乙酰化金刚烷胺的浓度应该小于等于1ng/ml。
本发明中，建立HPLC/MS/MS分析法的具体步骤如下：
1、准备下述材料
(1)对照标准品：
①名称：盐酸金刚烷胺；批号：073K3695；供应商：Sigma-Aldrich Company(西格玛奥德里奇公司)；标示纯度：供应商分析证书显示使用高氯酸滴定法测定时纯度为100.7％；使用TLC(Thin Layer Chromatography，薄层色谱法)测定时纯度大于99％(备注：以校正后的盐含量报告所有对照标准品的浓度结果)。
②名称：乙酰化金刚烷胺；批号：C2703A；供应商：Alfa Aesar A Johnson MattheyCompany(阿法埃莎公司)；标示纯度：供应商分析证书显示使用GC(Gas Chromatography，气相色谱)法测定的纯度为99.9％。
③名称：氘代乙酰化金刚烷胺(内标物)；批号：MAK-29-06-07；供应商：BiomarkTechnologies Inc(拜瑞曼克生物科技有限公司)；标示纯度：供应商分析证书显示使用TLC法测定的纯度为100％；使用HPLC法测定的纯度为98％a/a；同位素纯度为99％。
(2)研究样品
100份干冰冷冻管包装的人体尿液样品。
(3)空白人体尿液
由美国Bio reclamation公司(美国生物再生公司)提供。
(4)化学试剂
化学试剂包括：①乙酸乙酯，供应商：EMD Chemicals Inc(EMD化学有限公司)，HPLC级别，批号：46318；②甲醇，供应商：EMD Chemicals Inc，HPLC级别，批号：47151、47045；③甲酸，供应商：Fisher Scientific(飞世尔科技)，USP级别(UnitedStates Pharmacopeia Grade，美国药典级别)，批号：064023；④磷酸氢二钾，供应商：Sigma-Aldrich Company(西格玛奥德里奇公司)，ACS级别(American ChemicalSociety Grade，美国化学协会级别)，批号：093K0095；⑤磷酸，供应商：FisherScientific，ACS级别，批号：43213336。
(5)样品处理设备
①定量吸移管；②分析天平：型号为Mettler-Toledo AG285(梅特勒-托利多AG28，5进位分析天平)；③微量天平：型号为Mettler-Toledo MT5(梅特勒-托利多AG28，6进位微量天平)；④涡旋震荡器：型号为VWR多管涡旋震荡器和型号为VWR迷你涡旋震荡器；⑤离心机：型号为IEC Centra GP8R；⑥pH计：型号为VWR SP20；⑦超声波仪和水浴锅：型号为Aquasonic 250D；⑧艾本德移液器(Eppendorf pipettes，Eppendorf repeaters)。
2、制备溶液
(1)配制流动相A(溶于去离子水的浓度为0.1％(v/v)甲酸)和流动相B(溶于甲醇的浓度为0.1％甲酸)。
(2)配制金刚烷胺储备溶液
称取盐酸金刚烷胺，溶解于去离子水中，获得浓度为4mg/mL的金刚烷胺储备溶液。
(3)配制金刚烷胺工作溶液
使用去离子水稀释4mg/mL金刚烷胺储备溶液分别获得浓度各为1200μg/mL、400μg/mL、200μg/mL、80μg/mL、40μg/mL、20μg/mL、8μg/mL、4μg/mL的工作溶液。
(4)配制金刚烷胺校正标准品溶液
取20ul工作溶液溶于1000ul尿液中，分别获得浓度各为24μg/mL、8μg/mL、4μg/mL、1.6μg/mL、0.8μg/mL、0.4μg/mL、0.16μg/mL、0.08μg/mL的校正标准品溶液。
(5)配制金刚烷胺QC工作溶液
使用去离子水稀释4mg/mL的金刚烷胺储备溶液，分别获得浓度各为800μg/mL、160μg/mL、16μg/mL的QC工作溶液。
(6)配制金刚烷胺QC样品溶液
取20ul QC工作溶液溶于1000ul尿液中，分别获得浓度各为16μg/mL、3.2μg/mL、0.32μg/mL的QC样品溶液。
(7)配制乙酰化金刚烷胺储备溶液
称取乙酰化金刚烷胺，溶解于去离子水中，获得浓度为10mg/mL的乙酰化金刚烷胺储备溶液。
(8)配制乙酰化金刚烷胺工作溶液
使用去离子水稀释10mg/mL的乙酰化金刚烷胺储备溶液，分别获得浓度各为5000μg/mL、3750μg/mL、1500μg/mL、500μg/mL、250μg/mL、100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL、10μg/mL、5μg/mL的乙酰化金刚烷胺工作溶液。
(9)配制乙酰化金刚烷胺校正标准品溶液
取20ul工作溶液溶于1000ul尿液中，分别获得浓度各为100μg/mL、75μg/mL、30μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、2μg/mL、1μg/mL、0.5μg/mL、0.2μg/mL、0.1μg/mL、的校正标准品溶液。
(10)配制乙酰化金刚烷胺QC工作溶液
使用去离子水稀释10mg/mL的乙酰化金刚烷胺储备溶液，分别获得浓度各为4000μg/mL、1000μg/mL、200μg/mL、20μg/mL的QC样品溶液。
(11)配制乙酰化金刚烷胺QC样品溶液
取20ul QC工作溶液溶于1000ul尿液中，分别获得浓度各为80μg/mL、20μg/mL、4μg/mL、0.4μg/mL的QC样品溶液。
(12)配制氘代乙酰化金刚烷胺(内标物)储备溶液
称取氘代乙酰化金刚烷胺，溶解于甲醇中，获得浓度为1mg/mL的氘代乙酰化金刚烷胺储备溶液，再使用甲醇稀释1mg/mL的氘代乙酰化金刚烷胺储备溶液，以获得浓度为2μg/mL氘代乙酰化金刚烷胺，做为掺加示踪剂。氘代乙酰化金刚烷胺由HPSI公司(一家加拿大公司)提供5g。 该氘代乙酰化金刚烷胺的分析证书见表一。
表一：氘代乙酰化金刚烷胺的分析证书
| 检测项目 | 质量标准 | 结果 |
| 外观 | 白色晶状粉末 | 符合标准 |
| 熔点 | 142-151℃ | 145-147℃ |
| TLC纯度 | ≥98％ | 100％ |
| HPLC纯度 | ≥98％ | 98％a/a |
| 同位素纯度 | ≥98％ | 99％ |
| 1H NMR(Hydrogen-1 nuclear Magnetic resonancespectroscopy，1H核磁共振波谱法) | 与结构一致 | 符合标准 |
| 13C NMR(Carbon-13 nuclear magneticresonance spectroscopy；13C核磁共振波谱法) | 与结构一致 | 符合标准 |
| MS(mass spectrometry；质谱分析法) | 与结构一致 | 符合标准 |
| IR(infrared spectrum；红外光谱) | 与结构一致 | 符合标准 |
(13)配制1M磷酸氢二钾缓冲液(pH 7.4)
取磷酸氢二钾溶解于去离子水中，使用磷酸调节pH值，以获得pH值为7.4的1M磷酸氢二钾缓冲液。
(14)配制浓度为0.05％(v/v)的甲酸50％(v/v)的甲醇/水溶液
混合甲醇和去离子水，获得50％(v/v)甲醇/水溶液，再加入甲酸，以获得浓度为0.05％(v/v)的甲酸50％(v/v)甲醇/水溶液。
(15)制备2份校正标准品溶液和3份QC样品溶液，具体掺加流程按表二操作。
表二：掺加流程表
①加20μL(2μg/mL)的内标物(IS)至16×100mm螺口试管内；
②加20μL乙酰化金刚烷胺储备溶液至上述试管内；
③加20μL金刚烷胺储备溶液至上述试管内；
④涡旋震荡后，加1000μL空白人体尿液至上述试管内；
⑤涡旋震荡后，加500μL 1M磷酸盐缓冲液至上述试管内；
⑥涡旋震荡1分钟后，再在RCF(relative centrifugal force，相对离心力)为3270xg离心5分钟，加5mL乙酸乙酯溶液至上述试管内；
⑦将上层清夜转移至干净的13×100mm试管内，在37℃水浴锅蒸发至干燥；
⑧将0.05％(v/v)甲酸-50％(v/v)甲醇/水溶液涡旋震荡1分钟后，再在25℃超声处理2分钟，然后使用200μL该溶液复溶干燥残留物；
⑨将样品转移至250μL HPLC进样瓶中，然后在RCF 3270xg离心5分钟，再使用HPLC/MS/MS仪器进行色谱质谱分析。
4、设置HPLC/MS/MS仪器检测参数
(1)使用的HPLC/MS/MS仪器设备如下：①Agilent Model 1100 G1312A二元梯队泵；②Agilent Model 1100 G1316A柱温箱(Agilent，安捷伦公司)；③Agilent Model1100 G1313A自动采样器；④Micromass三级四极杆质谱仪，(Micromass英国质谱公司)；⑤上述HPLC装置均是由Micromass
版软件控制。
(2)HPLC色谱柱：色谱柱类型：Synergi Hydro-RP 4μ
供应商：美国Phenomenex公司(美国菲罗门公司)，柱长×ID：50mm×2.0mm。
(3)HPLC流动相：流动相A：溶于去离子水的(0.1％)甲酸，流动相B：溶于甲醇的(0.1％)甲酸，进样量：10μL。
(4)HPLC色谱条件设置见表三：
表三：HPLC色谱条件设置
| 时间(分钟) | 流动相A(％) | 流动相B(％) | 流速(mL/分钟) |
| 0.00 | 95.0 | 5.0 | 0.30 |
| 1.00 | 95.0 | 5.0 | 0.30 |
| 1.10 | 5.0 | 95.0 | 0.30 |
| 6.00 | 5.0 | 95.0 | 0.30 |
| 6.10 | 95.0 | 5.0 | 0.30 |
| 11.00 | 95.0 | 5.0 | 0.30 |
(5)设置质谱参数：
①采用电喷射离子化，正离子模式，毛细管电压为3.3kV
②多反应监测数据采集见表四：
表四：多反应监测数据采集表
| 通道反应 | 停留时间(秒) | 锥孔电压(eV) | 碰撞能量(eV) | |
| 功能1 | 151.80＞134.80 | 0.10 | 18 | 18 |
| 151.80＞92.80 | 0.10 | 18 | 28 | |
| 151.80＞78.80 | 0.10 | 18 | 28 | |
| 功能2 | 193.90＞134.80 | 0.10 | 18 | 18 |
| 193.90＞92.80 | 0.10 | 18 | 28 | |
| 193.90＞106.80 | 0.10 | 18 | 28 | |
| 功能3 | 196.80＞134.80 | 0.05 | 18 | 18 |
| 196.80＞92.80 | 0.05 | 18 | 32 | |
| 196.80＞106.80 | 0.05 | 18 | 32 |
(6)检测结果如下：
①系统适应性
共重复进样6次，评价仪器的系统适应性。样品溶液中AA的浓度为0.1ng/mL，AM的浓度为0.08μg/mL。确保每次分析前，系统具有良好的性能和重复性。AA/IS响应比和AM/IS响应比的CV分别为4.7％和1.6％。AA、AM、IS的保留时间的偏差小于等于±0.1分钟，见表五。
表五：人体尿液中AA、AM和IS的HPLC/MS/MS系统适应性数据
| 样品编号 | AM保留时间(分钟) | AM峰面积 | AA峰保留时间(分钟) | AA峰面积 | IS峰保留时间(分钟) | IS峰面积 | AM/IS响应比 | AA/IS响应比 |
| 系统适应性1 | 4.5 | 683468 | 5.8 | 13759 | 5.8 | 1043413 | 0.6550 | 0.0132 |
| 系统适应性2 | 4.5 | 682841 | 5.8 | 12422 | 5.8 | 1028009 | 0.6642 | 0.0121 |
| 系统适应性3 | 4.5 | 678469 | 5.8 | 12466 | 5.8 | 1052758 | 0.6445 | 0.0118 |
| 系统适应性4 | 4.5 | 669242 | 5.8 | 12269 | 5.8 | 1036473 | 0.6457 | 0.0118 |
| 系统适应性5 | 4.5 | 664285 | 5.8 | 11793 | 5.8 | 1017650 | 0.6528 | 0.0116 |
| 系统适应性6 | 4.5 | 676051 | 5.8 | 12223 | 5.8 | 1006850 | 0.5715 | 0.0121 |
| 平均值 | 4.5 | 5.8 | 5.8 | 0.66 | 0.012 | |||
| ％CV | 0.1 | 0.2 | 0.1 | 1.6 | 4.7 |
②方法选择性和专属性
使用3个不同批次的空白人体尿液评价方法专属性和选择性。掺加有浓度为0.4ng/mL的AA和浓度为0.32μg/mL的AM(n＝3)的人体尿液，和掺加有分析浓度为40ng/mL IS的人体尿液(n＝3)。在AA、AM和IS的保留时间出现的峰响应分别小于等于AMLLOQ(Lower Limit of Quantitation，定量下限)峰响应的3.7％、AA LLOQ峰响应的10％和分析浓度的IS峰响应的0.08％。3份掺加有低浓度AM和AA的人体尿液样品在IS保留时间检测到的峰响应小于等于分析浓度的IS峰响应的0.06％。3份掺加有IS的人体尿液样品在AM和AA保留时间分别检测到的峰响应小于等于AM LLOQ峰响应的1.2％和小于等于AA LLOQ峰响应的11％，见表六。
表六：方法专属性和选择性数据
| 样品编号 | AM峰面积 | AA峰面积 | IS峰面积 | AM LLOQ响应％ | AA LLOQ响应％ | IS LLOQ响应％ |
| HU801(空白尿液) | 5854 | 429 | 656 | 3.7 | 10 | 0.06 |
| HU802(空白尿液) | 2738 | 395 | 714 | 1.7 | 9.6 | 0.06 |
| HU803(空白尿液) | 1531 | 115 | 899 | 1.0 | 2.8 | 0.08 |
| 专属性AA+AM1 | 689625 | 16312 | 664 | 0.06 | ||
| 专属性AA+AM2 | 713720 | 14853 | 586 | 0.05 | ||
| 专属性AA+AM3 | 726364 | 14835 | 628 | 0.05 | ||
| 专属性IS1 | 1973 | 454 | 1179847 | 1.2 | 11 | |
| 专属性IS2 | 1530 | 414 | 1333893 | 1.0 | 10 | |
| 专属性IS3 | 1281 | 276 | 1004195 | 0.8 | 6.7 | |
| 平均值 | 1172645 | |||||
| LLOQ平均值 | 5118 | 备注1 |
备注1：AM LLOQ和AA LLOQ峰面积的平均值见表十。
这些响应都远远低于LLOQ，因此不会影响定量样品中的AA和AM，因为样品中AA和AM的浓度远远超过该方法LLOQ的10倍。
③定量范围和线性
在分析人体尿液量为1000μL时，在规定的浓度下(AA浓度为0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、30、75、100ng/mL；AM浓度为0.08、0.16、0.4、0.8、1.6、4、8、24μg/mL)，校验该方法。通过二次方程式y＝ax2+bx+c，使用所有浓度的加权1/x(平均值)，构建校验标准曲线。确定系数(R2)＝0.995090，校正曲线：Y＝-8.21565e-005*x2+0.033846*x+0.000175228。
AA校正标准品溶液的推算浓度在预期值的±13％之内，LLOQ样品溶液的推算浓度则在预期值的±15％之内(见表七)。AM校正标准品溶液的推算浓度在预期值的±15％之内，LLOQ样品的推算浓度则在预期值的±14％之内(见表七)。校正标准品溶液分析方法的性能符合数据的可接受标准。
表七：人体尿液中AM和AA校正标准品HPLC/MS/MS数据
备注2：该数据没有用于回归分析，因为绝对％Dev(偏差百分比)＞15。
④方法准确度和精密度
使用AA浓度为0.4、4、20、80ng/mL和AM浓度为0.32、3.2和16μg/mL的QC样品溶液评价分析方法的准确度和精密度，每个浓度各进样3次，所有溶液均使用AA和AM储备溶液进行配制，与之前的校正标准品溶液无关。对所有浓度(0.4、4、20、80ng/mL)的AA溶液和浓度为0.32和3.2μg/mL的AM溶液进行浓度测定，测定的浓度值与预期浓度值之间的偏差在±15％之内。然而，高浓度(16μg/mL)的AM溶液观察到的偏差为-27％。这是因为AM在高浓度时，离子化程度受抑制。对所有浓度(0.4、4、20and 80ng/mL)的AA而言，其测定浓度的精密度CV在12％之内，对所有浓度(0.32、3.2和16μg/mL)的AM而言，其测定浓度的精密度CV在7.1％之内(见表八)。
表八：HPLC/MS/MS人体尿液中AM和AA QC样品数据
备注3：绝对％Dev＞15，用于AM定性分析数据仅供参考，因为在高浓度时由于离子化已经饱和，所以校正曲线不可以定量AM。
⑤萃取回收率
使用体外混合基质样品评价AA和AM分析方法的萃取回收率，样品中AA的浓度分别为0.4、4、20和80ng/mL(n＝3)，AM的浓度分别为0.32、3.2和16μg/mL。通过比较QC样品溶液的峰响应(n＝3)和掺加有适宜浓度的AA和AM的萃取回收率样品溶液的峰响应(n＝3)来测定平均萃取回收率。采用该分析方法，人体尿液中AA的萃取回收率范围为75至96％，AM为10至29％(见表九)。采用本分析方法，可以获得较高的AA萃取回收率，这正符合预期的结果，可以分析尿液样品ng/mL浓度的AA。AM的萃取回收率较低，是因为AM在pH值为7.4时亲水性较大，但是该pH值对AA的提取却非常有利。但总的来说，AM较低的萃取回收率仍然足以测定尿液样品中的μg/mL浓度的AM。
表九 人体尿液中AM和AA方法萃取回收率数据综述
⑥检测下限
通过3份LLOQ样品溶液(标定浓度为0.1ng/mL的AA)评价本分析方法的检测下限。AA LLOQ样品溶液的推算浓度与预期值之间的偏差小于等于±20％，CV小于等于10％(见表十)。
表十：人体尿液中AM和AA方法LLOQ数据综述
备注4：该数据没有用于计算平均值，因为绝对％Dev＞20。
综上所述，根据二次回归方程函数得知，人体尿液中AA的定量浓度范围为0.1～100ng/mL。根据预先设定的可接受标准，通过评价本分析方法的专属性、选择性、线性、准确度、精密度、定量范围、回收率和检测下限，证明本分析方法适用于检测人体尿液中的AA。
本发明的核心观点是基于在肿瘤细胞中SSAT是上调表达的(活性增强)。如果SSAT活性增强，那么则表明肿瘤细胞的存在。最佳的SSAT底物应该是：该底物高度专属于SSAT而不是人体内其它乙酰化转移酶，这样就可以最小化它们所产生的干扰；再者是毒性低，从而可以大剂量服用，以增加人体体液(如：血清、尿液和唾液)中乙酰化产物的浓度。低毒性和高专属性的底物，例如乙酰化金刚烷胺，则可以造就检测的高灵敏性。
本发明的有益效果是：1、本发明使用HPLC/MS/MS分析法，该方法通过在体外掺加AA或AM至1000μL人体尿液分析样品中，AA的定量范围为0.1～100ng/mL，AM的定量范围为0.08～4μg/mL。在所有样品中接种恒定量的内标物氘代乙酰化金刚烷胺(IS)对AA和AM进行定量，从而能够在人体生物体液中检测出低水平(1-10ng/ml的浓度)SSAT代谢产物，从而显示出SSAT(亚精胺/精胺N1-乙酰转移酶)的活性，最终间接提示人体的肿瘤细胞。2、本发明所使用的药物剂型并不仅仅局限于注射制剂，而是扩大到口服剂型，使本发明更易于操作、应用范围更广泛。现有技术仅用腹腔注射药物来进行动物研究，而且没有应用口服的药物剂型被用于检测亚精胺和精胺N1-乙酰转移酶活性的先例。由于口服的药物剂型的应用，乙酰化金刚烷胺在生物液体的总量应低于注射剂型。
具体实施方式
实施例1
某肺癌患者1，性别：男，年龄：65岁，身高：1.72米，体重：64公斤，在给其服用金刚烷胺前5天内、给药期间以及尿液收集阶段，该患者都必须戒酒。该患者晚餐2小时后，在睡觉之前，服用200mg治疗剂量的金刚烷胺，然后收集给药后共计12小时的整夜尿液676ml。然后使用代码标记尿液样品，在20℃冰冻，直至分析结束；尿液样品按以下步骤操作：
1、根据表二的掺加流程表制备2份校正标准品溶液和3份QC样品溶液；
2、加20μL(2μg/mL)的氘代乙酰化金刚烷胺内标物(IS)至16×100mm螺口试管内；
3、加20μL乙酰化金刚烷胺储备溶液至上述试管内；
4、加20μL金刚烷胺储备溶液至上述试管内；
5、涡旋震荡后，加1000μL空白人体尿液至上述试管内；
6、涡旋震荡后，加500μL 1M磷酸盐缓冲液至上述试管内；
7、涡旋震荡1分钟后，再在RCF 3270xg离心5分钟，加5mL乙酸乙酯溶液至上述试管内；
8、将上层清夜转移至干净的13×100mm试管内，在37℃水浴锅蒸发至干燥；
9、将0.05％(v/v)的甲酸50％(v/v)甲醇/水溶液涡旋震荡1分钟后，再在25℃超声处理2分钟，然后使用200μL该溶液复溶干燥残留物；
10、将样品转移至250-μL HPLC进样瓶中，然后在RCF 3270x g离心5分钟，再使用HPLC/MS/MS仪器进行分析。
11、设置HPLC/MS/MS仪器检测参数
(1)使用的HPLC/MS/MS仪器设备如下：Agilent Model 1100 G1312A二元梯队泵，Agilent Model 1100 G1316A柱温箱，Agilent Model 1100 G1313A自动采样器，Micromass
三级四极杆质谱仪，上述HPLC装置是由Micromass
版软件控制。
(2)HPLC色谱柱：色谱柱类型：Synergi Hydro-RP4μ，供应商：Phenomenex，柱长×ID：50mm×2.0mm。
(3)HPLC流动相：流动相A：溶于去离子水的(0.1％)甲酸，流动相B：溶于甲醇的(0.1％)甲酸，进样量：10μL。
(4)HPLC色谱条件设置见表三。
(5)设置质谱参数：
①采用电喷射离子化，正离子模式，毛细管电压为3.3kV
②多反应监测数据采集见表四。
12、进样到色谱系统分析，测定尿液样品中乙酰化金刚烷胺(AA)的浓度，尿液中AA的含量为6.4ng/ml，AA总量为4326ng，平均为361ng/h。
本实施例1的有益效果是：1、使用HPLC/MS/MS分析法，该方法通过在体外掺加AA或AM至人体尿液分析样品中，在所有样品中接种恒定量的内标物氘代乙酰化金刚烷胺(IS)对AA和AM进行定量，从而能够在人体生物体液中检测出低水平(6.4ng/ml的浓度)SSAT代谢产物。2、本发明所使用的药物剂型并不仅仅局限于注射制剂，而是扩大到口服剂型，使本发明更易于操作、应用范围更广泛。
实施例2
某肺癌患者2，性别：女，年龄：54岁，身高：1.62米，体重：72公斤，在给其服用金刚烷胺前5天内、给药期间以及尿液收集阶段，该患者都必须戒酒。该患者晚餐2小时后，在睡觉之前，服用200mg治疗剂量的金刚烷胺，然后收集给药后共计12小时的整夜尿液206ml。然后使用代码标记尿液样品，在20℃冰冻，直至分析结束；尿液样品按实施例1中的步骤1至步骤11操作，最后进样到色谱系统分析，测定尿液样品中乙酰化金刚烷胺(AA)的浓度，尿液中AA的含量为7.9ng/ml，AA总量为1627ng，平均为136ng/h。
本实施例2的有益效果是：1、使用HPLC/MS/MS分析法，该方法通过在体外掺加AA或AM至人体尿液分析样品中，在所有样品中接种恒定量的内标物氘代乙酰化金刚烷胺(IS)对AA和AM进行定量，从而能够在人体生物体液中检测出低水平(7.9ng/ml的浓度)SSAT代谢产物。2、本发明所使用的药物剂型并不仅仅局限于注射制剂，而是扩大到口服剂型，使本发明更易于操作、应用范围更广泛。
实施例3
某肺癌患者3，性别：男，年龄：64岁，身高：1.68米，体重：83公斤，在给其服用金刚烷胺前5天内、给药期间以及尿液收集阶段，该患者都必须戒酒。该患者晚餐2小时后，在睡觉之前，服用200mg治疗剂量的金刚烷胺，然后收集给药后共计12小时的整夜尿液515ml。然后使用代码标记尿液样品，在20℃冰冻，直至分析结束；尿液样品按实施例1中的步骤1至步骤11操作，最后进样到色谱系统分析，测定尿液样品中乙酰化金刚烷胺(AA)的浓度，尿液中AA的含量为4.4ng/ml，AA总量为2266ng，平均为206ng/h。
本实施例3的有益效果是：1、使用HPLC/MS/MS分析法，该方法通过在体外掺加AA或AM至人体尿液分析样品中，在所有样品中接种恒定量的内标物氘代乙酰化金刚烷胺(IS)对AA和AM进行定量，从而能够在人体生物体液中检测出低水平(4.4ng/ml的浓度)SSAT代谢产物。2、本发明所使用的药物剂型并不仅仅局限于注射制剂，而是扩大到口服剂型，使本发明更易于操作、应用范围更广泛。
Claims (10)
1、一种用于检测肿瘤的乙酰化金刚烷胺的测定方法，其特征在于，通过向人体给药金刚烷胺，从人体中获取液体样品，采用高效液相色谱-电喷雾离子阱质谱联用技术来测定样品中乙酰化金刚烷胺的浓度。
2、根据权利要求1所述的用于检测肿瘤的乙酰化金刚烷胺的测定方法，其特征是，所述的高效液相色谱-电喷雾离子阱质谱联用技术是指采用氘代乙酰化金刚烷胺作为内标物进行色谱质谱分析测定样品中乙酰化金刚烷胺的浓度。
3、根据权利要求1或2所述的用于检测肿瘤的乙酰化金刚烷胺的测定方法，其特征是，所述的高效液相色谱-电喷雾离子阱质谱联用技术，其具体步骤如下：(1)制备校正标准品溶液和质量控制样品溶液；(2)加氘代乙酰化金刚烷胺至试管内；(3)加乙酰化金刚烷胺储备溶液至上述试管内；(4)加金刚烷胺储备溶液至上述试管内；(5)涡旋震荡后，加人体尿液至上述试管内；(6)涡旋震荡后，加磷酸盐缓冲液至上述试管内；(7)涡旋震荡后，再离心，加乙酸乙酯溶液至上述试管内；(8)将上层清夜转移至试管内，在水浴锅蒸发至干燥；(9)将甲醇甲酸水溶液涡旋震荡后，再超声处理，然后使用该溶液复溶干燥残留物；(10)将样品转移至HPLC进样瓶中，然后离心；(11)使用HPLC/MS/MS仪器进行色谱质谱分析，测定尿液样品中乙酰化金刚烷胺的浓度。
4、根据权利要求2或3所述的用于检测肿瘤的乙酰化金刚烷胺的测定方法，其特征是，所述的色谱质谱分析，其色谱系统分析的HPLC流动相A是溶于去离子水的甲酸。
5、根据权利要求2或3所述的用于检测肿瘤的乙酰化金刚烷胺的测定方法，其特征是，所述的色谱质谱分析，其色谱系统分析的HPLC流动相B是溶于甲醇的甲酸。
6、根据权利要求2或3所述的用于检测肿瘤的乙酰化金刚烷胺的测定方法，其特征是，所述的色谱质谱分析，其色谱系统分析的HPLC色谱条件设置如下：当时间为0.00分钟时，流动相A为95.0％，流动相B为5.0％，流速为0.30mL/分钟；当时间为1.00分钟时，流动相A为95.0％，流动相B为5.0％，流速为0.30mL/分钟；当时间为1.10分钟时，流动相A为5.0％，流动相B为95.0％，流速为0.30mL/分钟；当时间为6.00分钟时，流动相A为5.0％，流动相B为95.0％，流速为0.30mL/分钟；当时间为6.10分钟时，流动相A为95.0％，流动相B为5.0％，流速为0.30mL/分钟；当时间为11.00分钟时，流动相A为95.0％，流动相B为5.0％，流速为0.30mL/分钟。
7、根据权利要求2或3所述的用于检测肿瘤的乙酰化金刚烷胺的测定方法，其特征是，所述的色谱质谱分析，其质谱参数设置是采用电喷射离子化。
8、根据权利要求2或3所述的用于检测肿瘤的乙酰化金刚烷胺的测定方法，其特征是，所述的色谱质谱分析，其质谱参数设置是正离子模式。
9、根据权利要求2或3所述的用于检测肿瘤的乙酰化金刚烷胺的测定方法，其特征是，所述的色谱质谱分析，其质谱参数设置是毛细管电压3.3KV。
10、根据权利要求3所述的用于检测肿瘤的乙酰化金刚烷胺的测定方法，其特征是，所述的超声处理，其温度为25℃。
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