JP5028275B2 - 亜リン酸、ホセチル−Ａｌ又は両者を同時に分析する方法 - Google Patents

Description

本発明は、殺虫性化合物の分析の分野に関する。このような方法は、このような殺虫性化合物が一旦適用されたときに、それらの挙動をモニターするのに有用であり、このような方法は、このような殺虫性化合物に対する市販承認手続きの間にも有用である。

本発明の分析の方法によって分析できる化合物は、植物の保護に有用な化合物であり、これらの生物活性化合物の代謝産物である化合物の幾つかでもある。これらの代謝産物の幾つかは、生物活性も示し得る。

殺虫性化合物を分析するための方法は、公知である。特に、飲料水中又は地表水中の、ホセチル−Ａｌ残留物及びその主要代謝産物である亜リン酸を測定するための分析方法が公知である。

このような公知の方法は、誘導体化剤として（トリメチルシリル）ジアゾメタン（ＴＭＳＤ）を使用する。

一般に、このような方法は、以下の工程：
−水試料の濃縮
−濃縮された試料の一定分量の（トリメチルシリル）ジアゾメタンによる誘導体化（メチル基による水素原子の置換）
−ジクロロメタンを用いた液体−液体分配による前記誘導体化された試料の精製
を含む。

この分析は、亜リン酸モードでの炎光光度検出器（又はＦＰＤ）による半毛細管カラムでのガスクロマトグラフィーによって実施され、定量化は、外部標準物質を基準物質として採用する。熱イオン化検出器の使用も可能である。

この公知の方法は、以下のスキーム１に従って実施される。

この方法による検出限界（ＬＯＤ）は、次のとおりである。

−ホセチル−Ａｌに関して、
−飲料水（鉱水又は水道水）の場合、０．０５μｇ／Ｌ
−地表水（河川水）の場合、０．０５μｇ／Ｌ
−亜リン酸に関して、
−飲料水（鉱水又は水道水）の場合、０．７μｇ／Ｌ
−地表水（河川水）の場合、２．５μｇ／Ｌ
である。

この方法による定量化限界（ＬＯＱ）は、次のとおりである。

−ホセチル−Ａｌに関して、
−飲料水（鉱水又は水道水）の場合、０．１μｇ／Ｌ
−地表水（河川水）の場合、１μｇ／Ｌ
−亜リン酸に関して、
−飲料水（鉱水又は水道水）の場合、２．０ｇ／Ｌ
地表水（河川水）の場合、４．０ｇ／Ｌ
である。

この公知の分析方法は、次の基質：鉱水、水道水、ローヌ川河川水に対して使用されてきた。定量化の限界まで及びこれらの限界の１０倍まで、ホセチル−Ａｌ及び亜リン酸で濃縮された非処理対照試料の分析によって、前記分析方法は、水の様々な種類に関して有効とされてきた。

これらの濃縮された試料の分析は、ホセチル−Ａｌ又は亜リン酸に関する回収割合値を付与し、これらの値は予測される理論値と比較される。

別の公知の分析方法として、シャザイダゼルギュー（Ｃｈａｚａｙ ｄ’Ａｚｅｒｇｕｅｓ）（フランス）、ゴッホ（Ｇｏｃｈ）（ドイツ）、及びセビール（Ｓｅｖｉｌｌｅ）（スペイン）において採取される土壌中に存在するホセチル−Ａｌ残留物又は亜リン酸残留物を分析するための方法が挙げられる。

この方法自体も、（トリメチルシリル）ジアゾメタンを使用する。これも、スキーム１に従って実施される。

この方法のこの過程において、ホセチル−Ａｌ及び亜リン酸残留物が、アンモニア緩衝液の存在下での撹拌によって、土壌試料から抽出された後、存在する陽イオンが、イオン交換樹脂によって抽出物から除去され、水を試料から蒸発させる。最終的に、得られた抽出物は、（トリメチルシリル）ジアゾメタンの作用によって誘導体化される。

その後、定量化は、外部標準物質を使用する（亜リン酸モードでの）炎光光度検出器を使用する半毛細管カラムでのガスクロマトグラフィーによって実施される。

この方法の定量化限界（ＬＯＱ）は、各化合物に関して０．１００ｍｇ／ｋｇである。

ホセチル−Ａｌ又は亜リン酸を定量化限界まで及びこの限界の１００倍まで、対照試料を濃縮した。

残留物を分析するための別の公知の方法は、果物及び野菜の両者に由来する植物試料中のホセチル−Ａｌ及び亜リン酸残留物の分析に関する。

この方法自体も、（トリメチルシリル）ジアゾメタンを使用する。本方法も、スキーム１に従って実施される。

この方法の過程において、ホセチル−Ａｌ及び亜リン酸残留物は、水とアセトニトリルとの混合物中で粉砕することによって、植物試料から抽出される。抽出物はその後、Ｃ１８カートリッジを使用して精製された後、（トリメチルシリル）ジアゾメタンの作用によって誘導体化される。

その後、外部標準物質を使用する（亜リン酸モードでの）炎光光度検出器を使用する半毛細管カラムでのガスクロマトグラフィーによって、定量化が実施される。

この公知の方法の定量化限界は、ホップを除く各産物について０．５０ｍｇ／ｋｇであり、この限界は、ホセチル−Ａｌの場合２．０ｍｇ／ｋｇであり、亜リン酸の場合２０．０ｍｇ／ｋｇである。

この方法は、ブドウ、オレンジ、バナナ、イチゴ、レタス及びキュウリの束の試料に対して使用されてきた。特に定量化限界まで、対照試料を濃縮した。

残留物を分析するためのさらに別の公知の方法は、乳、牛肉、ウシ腎臓、ウシ肝臓、又は卵などの動物組織又は動物由来の産物中のホセチル−Ａｌ残留物又は亜リン酸残留物の分析に関する。

この研究によると、分析されるべき化合物の残留物は、水／アセトニトリル混合物（５０／５０、乳の場合２０／８０）中で二重粉砕することによって、試料から抽出される。

抽出物の一定分量はその後、（乳の場合を除き）Ｃ１８カートリッジによって精製される。精製された抽出物はその後、ＴＭＳＤの溶液で誘導体化される。

この分析方法もスキーム１に従う。

定量化は、亜リン酸モードでの炎光光度検出器を使用する、ＤＢワックスカラムでのガスクロマトグラフィーによって実施される。

定量化限界は次のとおりである。

−牛肉、ウシ腎臓、ウシ肝臓及び卵中のホセチル−Ａｌ及び亜リン酸の場合、０．５０ｍｇ／ｋｇ、
−乳中のホセチル−Ａｌ及び亜リン酸の場合、０．１０ｍｇ／ｋｇ
である。

この方法の場合、定量化限界まで及びこの限界の数倍まで試料を濃縮するとともに、処理されていない対照試料を調製及び分析した。

直前に挙げた公知の分析方法は、特に次の特徴に関して、１９９６年からの欧州指令第４６号（１９９６年７月１６日発令の９６／４６／ＥＣ）の規定に従うものである。

−各基質及び各レベルに関して、
−回収割合の平均は、７０ないし１１０％であるべきである。

−変動係数として表される反復可能性（百分率として表される、関連試料の平均に対する標準偏差の比）は、最大でも２０％であるべきである。

−各基質に関して、（すべてのレベルを含んだ）総変動係数は、最大でも２０％であるべきである。

ホセチル−Ａｌを分析するための別の公知の方法は、液体クロマトグラフィー／エレクトロスプレータンデム質量分析によるレタス中のホセチル−Ａｌ残留物の迅速な測定と題された論文（Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ＡＯＡＣ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， Ｖｏｌ．８６， Ｎｏ．４， ２００３）に記載されている。

記載されているこの方法は、レタス由来の植物試料中のホセチル−Ａｌ残留物の定量に関する。本方法は、高速ミキサーによる水を用いた抽出後に、５倍希釈した抽出物を液相クロマトグラフへ注入することからなる工程を要する。

従って、ホセチル−Ａｌは、イオン対形成剤としての酢酸テトラブチルアンモニウムの添加後のエレクトロスプレータンデム質量分析に連結された液体クロマトグラフィーによって定量化される。

２ｍｇ／ｋｇ及び０．２ｍｇ／ｋｇで濃縮したレタスの試料の分析が報告される。定量化限界が０．２ｍｇ／ｋｇであるのに対し、ホセチル−Ａｌの検出限界は０．０５ｍｇ／ｋｇである。

しかしながら、これらの公知の分析方法の多くは、化学的誘導体化工程を要する。このような追加工程は、分析を複雑にし、分析時間を極めて大幅に長期化する。さらに、この工程の実施には、専門家が必要であり、これらの方法の経費を増大させる。

さらに、このような誘導体化工程の間に、使用される誘導体化剤（ＴＭＳＤ、ジアゾメタン、又は他の代替的な誘導体化剤であり得る。）は、それらの高額な経費に加えて、使用時にかなりの危険を有する反応試薬である。このような誘導体化剤を使用する場合に遭遇する危険性としては、それらの毒性及び又それらの爆発性が挙げられる。このような薬剤の使用もコストを増大させる。

さらに、これらの公知の方法は、多くの取り扱い工程（蒸発、再溶解、試料転移）が増大することを含み、従って、分析されるべき化合物の損失及び散在を含む。化合物の特にこれらの分析方法に由来する流出物が再処理される場合には、このような散在は、その環境上の影響という問題を引き起こし得る。

さらに、これらの公知の方法は、特定の化合物に対して特異的ではないという大きな欠点を有している。この特異性の欠失によって、保護及び定量化の特徴が似通っており、識別されない化合物が生じ得る。他の公知の方法は、ホセチル−Ａｌしか分析できないという欠点を有し、例えば亜リン酸の同時分析を実施できない。

前記の公知の方法の幾つかは、特定のマトリクスに関してのみ記載されており、例えば、すでに公知のある方法は、レタスに由来する特定の植物組織のみに関する。

最後に、これらの公知の方法は、より厳格なある種の定量化の限界、特に最近の規制、例えば１９９６年７月１６日発令の指令９６／４６／ＥＣに従った定量化の限界に到達できない。

これらの問題に対する解決策を提供できるか、又は公知の方法と関連したこれらの欠点を防止できる分析の方法が、ここに見出された。

したがって、本発明は、殺虫性化合物の残留物を分析するための方法に関する。

本発明の方法は、殺真菌剤、除草剤、殺虫剤、又は成長制御剤であると否とを問わず、殺虫性化合物の分析に適し得る。

有利なことに、本発明の分析方法は、殺真菌性化合物の残留物を分析するのに使用される。

特に有利なことに、本発明の分析方法は、ホセチル−Ａｌ残留物及び亜リン酸残留物を分析するのに使用される。

ホセチル−Ａｌは、その化学名がホスホン酸水素エチルアルミニウム塩であるホスホン酸型の殺真菌性化合物であり、式

を有する。

亜リン酸は、式Ｈ_３ＰＯ_３を有する。

したがって、数ある利点の中でも、本発明の分析方法は、優れた単純性にある。さらに、この方法は、直接的であり、分析される殺虫性化合物がこれまでに到達されなかった定量化のレベルに到達できる。

本発明の方法は、環境の視点からも特に有利であり、及び経済的にも有利である。

一般に、本発明は、以下の工程：
−試料の調製、
−場合により行われる、調製された試料の希釈
−場合により希釈された試料の、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）／タンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）による直接的な分析
を含む、試料の０．００００５ｍｇ／ｋｇ以下、好ましくは０．０００００５ｍｇ／ｋｇ以下、より好ましくは０．００００００５ｍｇ／ｋｇ以下の量で存在する１つ又はそれ以上の殺虫性化合物を分析するための方法に関する。

本発明に従って分析される液体試料の場合、定量化の限界は、ｍｇ／Ｌで表され得る。当業者は、必要な変換をなすことができる。

本発明の分析方法は、調製された試料の希釈の段階を含み得る。

本発明の分析方法は、殺真菌性、除草性、殺虫性又は成長制御化合物であり得る幾つもの殺虫性化合物の同時分析に適している。

好ましくは、本発明の方法は、亜リン酸又はその誘導体、ホスホン酸又はその誘導体から選択される殺真菌性化合物の分析のために、好ましくはホセチル又は１つ若しくはそれ以上のその塩の分析のために、より好ましくはホセチル−Ａｌ又は亜リン酸の分析のために使用される。

特に有利なことに、本発明の分析方法は、亜リン酸及びホセチル−Ａｌの同時分析のために使用される。

好ましくは、本発明の分析方法は、植物組織、好ましくは高い水分含有量の植物マトリクス、酸性ｐＨを有する植物マトリクス、乾燥植物マトリクス、脂肪性植物マトリクス、水、好ましくは鉱水、地下水、水道水又は地表水、土壌、動物の産物又は組織、好ましくは乳、卵、肝臓、腎臓、脂肪、筋肉、空気、食用農作物、好ましくは変換されたもの、並びに血液及び尿などのヒトの体液から選択される試料の分析のために使用され得る。

本発明の分析方法において、調製工程は、植物組織、土壌、動物産物又は組織、及び変換された食用農作物についての抽出、場合によって行われる水の濃縮、及び空気の捕捉から選択され得る。

このような濃縮工程は、他の試料に対しても使用され得る。

本発明の分析方法において、希釈工程は、好ましくはギ酸、酢酸又はトリフルオロ酢酸から選択される酸性化され得る水性溶媒中で、又は酸性化され得る有機溶媒、好ましくはアセトニトリル若しくはメタノール中で、あるいはこのような溶媒の混合物中で実施することが可能である。

本発明の特定の第一の態様によると、以下の工程：
−水試料の調製、
−場合により行われる、調製された試料の希釈、
−場合により希釈された試料の、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）／タンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）による直接的な分析
を含む、水試料の０．００５ｍｇ／ｋｇ以下、好ましくは０．００００５ｍｇ／ｋｇ以下、より好ましくは０．００００００５ｍｇ／ｋｇ以下の量で存在する１つ又はそれ以上の殺虫性化合物を分析するための方法に関する。

水試料を分析するための本発明の方法は、調製された試料の希釈からなる工程を含み得る。

水試料を分析するための本発明の方法は、殺真菌性、除草性、殺虫性又は成長制御化合物であり得る幾つかの殺虫性化合物の同時分析に適している。

好ましくは、水試料を分析するための本発明の方法は、亜リン酸又はその誘導体、ホスホン酸又はその誘導体から選択される殺真菌性化合物の分析のために、好ましくはホセチル又は１つ若しくはそれ以上のその塩の分析のために、より好ましくはホセチル−Ａｌの分析ために使用される。

特に有利なことに、水試料を分析するための本発明の方法は、亜リン酸及びホセチル−Ａｌの同時分析に使用される。

好ましくは、水試料を分析するための本発明の方法は、鉱水、地下水、水道水又は地表水から選択される試料の分析のために使用することが可能である。

水試料を分析するための本発明の方法において、調製工程は濃縮であり得る。

水試料を分析するための本発明の方法において、希釈工程は、好ましくはギ酸、酢酸、若しくはトリフルオロ酢酸から選択される、酸性化され得る水性溶媒中で、又は酸性化され得る有機溶媒、好ましくはアセトニトリル若しくはメタノール中で、あるいはこのような溶媒の混合物中で実施され得る。

本発明の特定の第二の態様によると、以下の工程：
−植物組織試料の調製、
−場合により行われる、調製された試料の希釈
−場合により希釈された試料の、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）／タンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）による直接的な分析
を含む、植物組織試料の１ｍｇ／ｋｇ以下、好ましくは０．０１ｍｇ／ｋｇ以下、より具体的には０．００１ｍｇ／ｋｇ以下の量で存在する１つ又はそれ以上の殺虫性化合物を分析するための方法に関する。

植物組織試料を分析するための本発明の方法は、調製された試料の希釈からなる工程を含み得る。

植物組織試料を分析するための本発明の方法は、殺真菌性、除草性、殺虫性又は成長制御化合物であり得る幾つかの殺虫性化合物の同時分析に適している。

好ましくは、植物組織試料を分析するための本発明の方法は、亜リン酸又はその誘導体、ホスホン酸又はその誘導体から選択される殺真菌性化合物の分析のために、好ましくはホセチル又は１つ若しくはそれ以上のその塩の分析のために、より好ましくはホセチル−Ａｌの分析のために使用される。

特に有利なことに、植物組織試料を分析するための本発明の方法は、亜リン酸及びホセチル−Ａｌの同時分析のために使用される。

好ましくは、植物組織試料を分析するための本発明の方法は、高い水分含有量の植物マトリクス、酸性ｐＨを有する植物マトリクス、乾燥植物マトリクス及び脂肪性植物マトリクスから選択される試料の分析のために使用され得る。

本発明の分析方法は、コムギ、オオムギ、イモ、ワタ、タンパク質性穀物、油産生穀物、トウモロコシ、アマ、コメ、野菜作物、果実樹木、ブドウ及びテンサイ根から選択される植物の試料の分析に使用され得る。

植物組織試料を分析するための本発明の方法において、調製工程は、植物組織の抽出であり得る。この調製工程は、試料の濃縮も含み得る。

植物組織試料を分析するための本発明の方法において、希釈工程は、好ましくはギ酸、酢酸若しくはトリフルオロ酢酸から選択される、酸性化され得る水性溶媒中で、又は酸性化され得る有機溶媒、好ましくはアセトニトリル若しくはメタノール中で、あるいはこのような溶媒の混合物中で実施され得る。

本発明の特定の第三の態様によると、以下の工程：
−土壌試料の調製、
−場合により行われる、調製された試料の希釈、
−場合により希釈された試料の、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）／タンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）による直接的な分析
を含む、土壌試料の５ｍｇ／ｋｇ以下、好ましくは０．０５ｍｇ／ｋｇ以下、より具体的には０．００５ｍｇ／ｋｇ以下の量で存在する１つ又はそれ以上の殺虫性化合物を分析するための方法に関する。

土壌試料を分析するための本発明の方法は、調製された試料の希釈の工程を含み得る。

土壌試料を分析するための本発明の方法は、殺真菌性、除草性、殺虫性又は成長制御化合物であり得る幾つかの殺虫性化合物の同時分析に適している。

好ましくは、土壌試料を分析するための本発明の方法は、亜リン酸又はその誘導体、ホスホン酸又はその誘導体から選択される殺真菌性化合物の分析のために、好ましくはホセチル又は１つ若しくはそれ以上のその塩の分析のために、より好ましくはホセチル−Ａｌの分析のために使用される。

特に有利なことに、土壌試料を分析するための本発明の方法は、亜リン酸及びホセチル−Ａｌの同時分析に使用される。

土壌試料を分析するための本発明の方法は、土壌のいずれかの種類、例えば粘土質、砂質又は白亜質の土壌の分析に使用され得る。

土壌を分析するための本発明の方法は、特に作付け前又は収穫後の、耕作された土壌又は草木のない土壌に対して使用され得る。

土壌試料を分析するための本発明の方法において、調製工程は、土壌試料の抽出であり得る。この調製工程は、試料の濃縮も含み得る。

土壌試料を分析するための本発明の方法において、希釈工程は、好ましくはギ酸、酢酸、又はトリフルオロ酢酸から選択される、酸性化され得る水性溶媒中で、又は酸性化され得る有機溶媒、好ましくはアセトニトリル若しくはメタノール中で、あるいはこのような溶媒の混合物中で実施され得る。

本発明の特定の第四の態様によると、以下の工程：
−空気試料の調製、
−場合によって行われる、調製された試料の希釈、
−場合によって希釈された試料の、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）／タンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）による直接的な分析
を含む、空気試料の０．１ｍｇ／ｍ^３以下、好ましくは０．０１ｍｇ／ｍ^３以下、より具体的には０．００１ｍｇ／ｍ^３以下の量で存在する１つ又はそれ以上の殺虫性化合物を分析するための方法に関する。

空気試料を分析するための本発明の方法は、調製された試料の希釈の工程を含み得る。

空気試料を分析するための本発明の方法は、殺真菌性、除草性、殺虫性又は成長制御化合物であり得る幾つかの殺虫性化合物の同時分析に適している。

好ましくは、空気試料を分析するための本発明の方法は、亜リン酸又はその誘導体、ホスホン酸又はその誘導体から選択される殺真菌性化合物の分析のために、好ましくはホセチル又は１つ若しくはそれ以上のその塩の分析のために、より好ましくはホセチル−Ａｌの分析のために使用される。

特に有利なことに、空気試料を分析するための本発明の方法は、亜リン酸及びホセチル−Ａｌの同時分析のために使用される。

空気試料を分析するための本発明の方法において、調製工程は捕捉であり得る。

空気試料を分析するための本発明の方法において、希釈工程は、好ましくはギ酸、酢酸、又はトリフルオロ酢酸から選択される、酸性化され得る水性溶媒中で、又は酸性化され得る有機溶媒、好ましくはアセトニトリル若しくはメタノール中で、あるいはこのような溶媒の混合物中で実施され得る。

本発明の特定の第五の態様によると、以下の工程：
−ヒトの体液試料の調製、
−場合により行われる、調製された試料の希釈、
−場合により希釈された試料の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）／タンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）による直接的な分析
を含む、ヒトの体液の試料の０．００００５ｍｇ／ｋｇ以下、好ましくは０．０００００５ｍｇ／ｋｇ以下、より好ましくは０．００００００５ｍｇ／ｋｇ以下の量で存在する１つ又はそれ以上の殺虫性化合物を分析するための方法に関する。

ヒトの体液の試料を分析するための本発明の方法は、調製された試料の希釈の段階を含み得る。

ヒトの体液の試料を分析するための本発明の方法は、殺真菌性、除草性、殺虫性又は成長制御化合物であり得る幾つかの殺虫性化合物の同時分析に適している。

好ましくは、ヒトの体液の試料を分析するための本発明の方法は、亜リン酸又はその誘導体、ホスホン酸又はその誘導体から選択される殺真菌性化合物の分析のために、好ましくはホセチル又は１つ若しくはそれ以上のその塩の分析のために、より好ましくはホセチル−Ａｌの分析のために使用される。

特に有利なことに、ヒトの体液の試料を分析するための本発明の方法は、亜リン酸及びホセチル−Ａｌの同時分析のために使用される。

好ましくは、ヒトの体液の試料を分析するための本発明の方法は、ヒトの血液及びヒトの尿から選択される試料の分析のために使用され得る。

ヒトの体液の試料を分析するための本発明の方法において、希釈工程は、好ましくはギ酸、酢酸又はトリフルオロ酢酸から選択される、酸性化され得る水性溶媒中で、又は酸性化され得る有機溶媒、好ましくはアセトニトリル又はメタノール中で、あるいはこのような溶媒の混合物中で実施され得る。

本発明の特定の第六の態様によると、以下の工程：
−動物の産物又は組織の試料の調製、
−場合により行われる、調製された試料の希釈、
−場合により希釈された試料の、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）／タンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）による直接的な分析
を含む、動物の産物又は組織の試料の１ｍｇ／ｋｇ以下、好ましくは０．０１ｍｇ／ｋｇ以下、より好ましくは０．００１ｍｇ／ｋｇ以下の量で存在する１つ又はそれ以上の殺虫性化合物を分析するための方法に関する。

動物の産物又は組織の試料を分析するための本発明の方法は、調製された試料の希釈の工程を含み得る。

動物の産物又は組織の試料を分析するための本発明の方法は、殺真菌性、除草性、殺虫性又は成長制御化合物であり得る幾つかの殺虫性化合物の同時分析に適している。

好ましくは、動物の産物又は組織の試料を分析するための本発明の方法は、亜リン酸又はその誘導体、ホスホン酸又はその誘導体から選択される殺真菌性化合物の分析のために、好ましくはホセチル又は１つ若しくはそれ以上のその塩の分析のために、より好ましくはホセチル−Ａｌの分析のために使用される。

特に有利なことに、動物の産物又は組織の試料を分析するための本発明の方法は、亜リン酸及びホセチル−Ａｌの同時分析のために使用される。

好ましくは、動物の産物又は組織の試料を分析するための本発明の方法は、乳、卵、肝臓、腎臓、脂肪及び筋肉から選択される試料の分析のために使用され得る。

動物の産物又は組織の試料を分析するための本発明の方法において、希釈工程は、好ましくはギ酸、酢酸又はトリフルオロ酢酸から選択される、酸性化され得る水性溶媒中で、又は酸性化され得る有機溶媒、好ましくはアセトニトリル又はメタノール中で、あるいはこのような溶媒の混合物中で実施され得る。

動物の産物又は組織の試料を分析するための本発明の方法において、調製工程は、動物の産物又は組織の抽出であり得る。この調製工程は、試料の濃縮も含み得る。

本発明の特定の第七の態様によると、変換された食用農作物試料中に存在する１つ又はそれ以上の殺虫性化合物を分析するための方法に関する。変換された食用農作物試料を分析するための本発明の本方法は、本発明の植物産物試料を分析するための方法と同様であり、本方法では、植物産物試料が、変換された食用農作物試料と置換される。

この第７の態様においては、種々の工程や好ましい実施形態も、他の態様において言及されているものと同様である。

本発明の様々な態様では、分析段階において、使用される外部標準物質は、分析されるべき試料と同一の性質のマトリクスの存在下で調製される。

以下の実施例は、本発明の様々な態様を例示するために与えられている。これらの実施例は、本発明の範囲を限定するものではない。特に、当業者は、彼らが直面する具体的な必要性に応じて、本発明の分析方法の工程の幾つかを適応又は改変できる。このような改変又は適応は、本発明の範囲の一部である。

本実施例は、植物組織試料を用いた、ホセチル−Ａｌ及び亜リン酸の分析に関する。植物マトリクスは、キュウリ、オレンジ、レタス、ブドウ及びアボカドの作物に由来する。

本発明の分析方法を使用するための手順：
１．ホモゲナイズされた植物マトリクス試料２０．０ｇを１２５ｍＬのポリプロピレンフラスコ中で秤量する。

２．水／アセトニトリル混合物（５０：５０、容積／容積）８０ｍＬを添加する。

３．ＩＫＡ Ｔ２５型ミルを使用して、試料を５分間破砕する。

４．３６００ｒｐｍ、５℃で５分間遠心分離する。

５．上清を２００ｍＬのメスフラスコへ転移させる。

６．ペレットを水／アセトニトリル混合物（５０：５０、容積／容積）８０ｍＬに溶解する。

７．試料を再度５分間破砕する。

８．３６００ｒｐｍ、５℃で５分間遠心分離する。

９．上清を２００ｍＬのメスフラスコへ転移させる。

１０．メタノールを使用して２００ｍＬに調整する。

１１．約１０ｍＬの一定分量を大気温、６０００ｒｐｍで１０分間遠心分離する。

１２．（ＡｃｒｏｄｉｓｃＣＲ型２５ｍｍ、０．４５μｍの）ＰＴＦＥフィルターを通じて上清をろ過する。

１３．０．５％ギ酸で酸性化したメタノールを使用して、ろ液を５倍希釈する。

１４．高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）／タンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）又はＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析によって分析する。

分析を実施するため、外部標準化により較正を実施する。使用される標準物質は、特定の分析の対象である試料と同一の性質のマトリクス中で調製されなければならない。

工程１４に対する分析条件：
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）条件：
カラム： Ｈｙｐｅｒｃａｒｂ、１００×３．０ｍｍ、５μｍ
プレカラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｃ１８ ＯＤＳ、４×２．０ｍｍ
移動相：０．５％ギ酸で酸性化した水／メタノール（６５：３５、容積：容積）定組成モード（以下、「定組成」は、「イソクラティック」ともいう。）
流速： ４００μＬ／分
カラム温度：大気温
注入容積： ２０μＬ
分析前に、クロマトグラフィーシステムを安定化させるために、約２時間放置する。

タンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）条件：
検出器： 三重四極子、ＡＰＩ４０００型Ｓｃｉｅｘ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ
インターフェース：ＴＩＳ（ターボイオンスプレー）
走査型： ＭＲＭ（多重反応観察）モード
極性： 負
ガス入り口圧：窒素：４バール
空気：７．５バール
空気（排気）：４バール
ガス流速： 噴霧状ガス（空気、ＧＳ１）：４０
ターボガス（空気、ＧＳ２）：６０
保護ガス（窒素、ＣＵＲ）：２０
衝突ガス（窒素、ＣＡＤ）：６
高電圧ＴＩＳ（ＩＳ）：−４５００Ｖ
ソース温度： ６００℃
入り口電位（ＥＰ）： −１０Ｖ
衝突エネルギー：

本発明の分析方法が使用される場合、工程１ないし１２は試料の調製に関し、段階１３は希釈に関する。したがって、工程１４は、事前に調製された後、希釈された植物マトリクス試料のＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析に関する。

様々な植物マトリクスの分析から得られた結果が、下表に詳しく記されており、表中、ＣＶ値は変動係数を示している。本発明において、ＣＶ値は、ＲＳＤ値にも相当し得る。

ホセチル−Ａｌ及び亜リン酸を定量化限界（亜リン酸の場合０．１ｍｇ／ｋｇ、ホセチル−Ａｌの場合０．０１ｍｇ／ｋｇ）及びこれらの限界の１０倍まで濃縮した対照試料から、これらの結果を得た。

本実施例も、植物組織試料を用いた、ホセチル−Ａｌ及び亜リン酸の分析に関する。植物マトリクスは、コムギ作物に由来する。

本実施例は、実施例１の条件を工程９まで反復した後、実施例１の工程１０ないし１４を次の工程と置換する。

１０．純ギ酸１ｍＬを添加し、メタノールを使用して２００ｍＬに調整する。

１１．約１０ｍＬの一定分量を大気温、６０００ｒｐｍで１０分間遠心分離する。

１２．０．５％ギ酸で酸性化したメタノールを使用して、上清を２倍希釈する。

１３．ＰＴＦＥフィルター（Ａｃｒｏｄｉｓｃ ＣＲ型２５ｍｍ、０．４５μｍ）を通じてろ過する。

１４．高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）／タンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）、又はＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析によって分析する。

その他に関して、本実施例は、実施例１と同一である。

コムギ試料の分析から得られた結果が、下表に詳しく記されており、表中、ＣＶ値は変動係数を示す。

ホセチル−Ａｌ及び亜リン酸を定量化限界（亜リン酸の場合０．１ｍｇ／ｋｇ、ホセチル−Ａｌの場合０．０１ｍｇ／ｋｇ）及びこれらの限界の１０倍まで濃縮した対照試料からこれらの結果を得た。

これら２つの実施例に関して、得られた結果は、規制発令（１９９６年７月１６日発令の９６／４６／ＥＣ）に従っている。

さらに、これらの結果は、すでに公知の方法で実現可能な限界を下回る定量化限界を達成できた。これらの実施例も、本発明の方法の単純性及びより優れた安全性を示す。

この詳細な実施例は、植物組織試料を用いた、ホセチル−Ａｌ及び亜リン酸の分析に関する。本実施例は、ブドウ、オレンジ、レタス、キュウリ、アボカド及びコムギ中／上のホセチル−Ａｌ及びその代謝産物（亜リン酸）の残留物の、ＬＣＭＳＭＳによる測定に対する分析方法００８６１への改変Ｍ００１である。

記述
データ要件：
委員会指令９６／６８／ＥＣによって修正された欧州連合議会指令９１／４１４／ＥＥＣ
指令９１／４１４、ＳＡＮＣＯ／３０２９／９９の補遺ＩＩ（パートＡ、セクション４）及び補遺ＩＩＩ（パートＡ、セクション５）に対する予備登録データ要件を充足する分析方法を作製及び報告するための欧州委員会指針文書
残留物分析方法ＳＡＮＣＯ／８２５／００に関する欧州委員会指針文書
要約：
ブドウ（全果実）、オレンジ（全果実）、レタス（頭部）、キュウリ（全果実）、アボカド（全果実）及びコムギ（穀粒）中のホセチル−Ａｌ及びその代謝産物（亜リン酸）の残留物の、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによる測定に対して、上記残留物分析方法の改変００８６１／Ｍ００１の有効性を確認した。

ホセチル−Ａｌ及びその代謝産物（亜リン酸）を、試料材料から、アセトニトリル／水（５０：５０）の混合物で抽出した。試料材料の遠心分離及び希釈後、Ｈｙｐｅｒｃａｒｂカラムを使用するＨＰＬＣによって残留物を定量化し、エレクトロスプレーイオン化を使用するタンデム質量分析によって残留物を検出する。マトリクスに合致させた標準物質中での外部標準化により、定量化を実施した。

有効性確認のセットは、検出器の直線性の決定、定量化の限界、方法の正確性及び試料最終抽出物の保存安定性を包含した。

溶媒中の標準物質及びマトリクスに合致させた標準物質を使用して、ホセチル−Ａｌ及び亜リン酸に対して、使用される検出器の直線性を検査した。

０．３１ないし８．３μｇ／Ｌ及び３．１ないし８３μｇ／Ｌのコムギ試料の場合を除き、０．１ないし５μｇ／Ｌ及び１ないし５０μｇ／Ｌの個々の濃度で、ホセチル−Ａｌ及び亜リン酸の標準物質を注入することによって、直線性を検査した。

マトリクス効果の発生を観察した。すべての試料材料において、亜リン酸の測定は、マトリクスに合致させた標準物質を使用して確立されなければならない。そのため、マトリクスに合致させた標準物質を使用して、両化合物の測定を確立する。

すべての対照試料の見かけの残留物は、各化合物についてＬＯＱの３０％を下回っていた。すなわち、ホセチル−Ａｌの０．００３ｍｇ／ｋｇ未満及び亜リン酸の０．０３ｍｇ／ｋｇであった。

定量化限界（ＬＯＱ）は、７０ないし１１０％の範囲内の平均回収及び２０％以下のＲＳＤを得ることができる最低の強化レベルとして定義した。ブドウ（全果実）、オレンジ（全果実）、レタス（頭部）、キュウリ（全果実）、アボカド（全果実）及びコムギ（穀粒）において、ホセチル−Ａｌでは０．０１ｍｇ／ｋｇに、亜リン酸では０．１ｍｇ／ｋｇに、ＬＯＱを設定した。

方法の正確性は、測定された回収率に基づいて評価できる。単一の回収率は、ホセチル−Ａｌの場合６９ないし１１４％の、亜リン酸の場合６５ないし１１３％の範囲にあった。ホセチル−Ａｌの場合、強化レベルあたりの平均回収率は９３ないし９７％の範囲にあり、すべての試料材料にわたる全体的な回収率及び強化レベルは９５％であり、並びに、亜リン酸の場合、強化レベルあたりの平均回収率は８６ないし９７％の範囲にあり、すべての試料材料にわたる全体的な回収率及び強化レベルは９１％であった。本方法の正確性は、各強化レベルに対する平均回収が７０ないし１１０％の範囲であるべきことを要求する残留物分析方法に関する要件を満たす。

本方法の精度及び再現性は、回収率の平均値に対して求められた相対的標準偏差（ＲＳＤ）に基づいて評価することが可能である。単一の強化レベルに対する相対的標準偏差（ＲＳＤ）は、ホセチル−Ａｌでは７．６ないし１２．３％、亜リン酸では９．５ないし１４．９％の範囲であった（ｎ＝３０）。

単一の強化レベルに対する相対的標準偏差（ＲＳＤ）は、ホセチル−Ａｌでは７．６ないし１２．３％、亜リン酸では９．５ないし１４．９％の範囲であった（ｎ＝３０）。試料材料あたりの全体的なＲＳＤ値は、ホセチル−Ａｌでは２．１ないし１０．９％、亜リン酸では６．０ないし１７．８％であった（ｎ＝１０）。すべての試料にわたるＲＳＤ値は、ホセチル−Ａｌでは１０．２％、亜リン酸では１３．７％であった（ｎ＝６０）。

試料材料あたりの全体的なＲＳＤ値は、ホセチル−Ａｌでは２．１ないし１０．９％、亜リン酸では６．０ないし１７．８％であった（ｎ＝１０）。すべての試料にわたるＲＳＤ値は、ホセチル−Ａｌでは１０．２％、亜リン酸では１３．７％であった（ｎ＝６０）。すべてのＲＳＤ値は、２０％を十分に下回っていたため、方法の精度及び再現性は許容されると考えることができる。

方法の妥当性確認についてのすべての結果は、残留物分析方法に関する一般的な要件に従っているため、この方法の改変の妥当性は適切に確認された。

１．序論
ホセチル−Ａｌは殺真菌剤である
精製及び誘導体化の工程を省略し、分析及び検出モードを変化させ、０．５ｍｇ／ｋｇから、ホセチル−Ａｌの場合０．０１ｍｇ／ｋｇまで、亜リン酸の場合０．１ｍｇ／ｋｇまで原法００８６１の定量化限界（ＬＯＱ）を低下させるために、この報告に記載されている方法の改変００８６１／Ｍ００１の妥当性を確認した。

１．１原法の引用
原法：００８６１
化合物：ホセチル−Ａｌ及びその代謝産物（亜リン酸）
改変に関する理由：
・精製及び誘導体化の工程を省略する。

・分析及び検出モードをＧＣ／ＦＰＤからＬＣ／ＭＳ／ＭＳまで変化させる。

・ホセチル−Ａｌの場合、０．５ｍｇ／ｋｇから０．０１０ｍｇ／ｋｇまで、亜リン酸の場合、０．５ｍｇ／ｋｇから０．１ｍｇ／ｋｇまでＬＯＱを低下させる。

１．２ 物理的及び化学的特性
物質名 ホセチル−Ａｌ
物質コード ＡＥ Ｆ０５３６１６
化学名 アルミニウム−トリス−（エチルホスホン酸塩）
実験式 Ｃ_６Ｈ_１８ＡｌＯ_９Ｐ_３
構造式

相対的分子量 ３５４．１ｇ／モル
モノアイソトピック質量 ３５４．０ｇ／モル
可溶性 水１２０ｇ／Ｌ（２０℃）
アセトニトリル５ｍｇ／Ｌ（２０℃）
物質名 亜リン酸
物質コード ＡＥ ０５４００９９
化学名 ホスホン酸
実験式 Ｈ_３ＰＯ_３
構造式

相対的分子量 ８２．０ｇ／モル
モノアイソトピック質量 ８２．０ｇ／モル
２．実験セクション
２．１ 材料
２．１．１ 装置
・アセトンですすいだ標準的な実験用ガラス器具
・平衡：
→正確性±０．１ｍｇ（分析用標準物質）（例えば、Ｍｅｔｔｌｅｒ ＡＴ２６１範囲）
→正確性±０．１ｇ（試料）（例えば、Ｍｅｔｔｌｅｒ ＰＭ６０００）
・希釈装置 （例えば、Ｈａｍｉｌｔｏｎ ＭｉｃｒｏＬａｂ ５００）
・高速配合器 （例えば、分散器具Ｓ ５０ Ｇ−４０Ｇを備えた
Ｕｌｔｒａ Ｔｕｒｒａｘ Ｔ２５）
（例えば、ＩＫＡ）
・遠心分離機 （例えば、Ｈｅｒｍｌｅ Ｚ５１３Ｋ） （例えば、Ｈｅｔｔｉｃｈ ＥＢＡ１２）
・ＨＰＬＣ （例えば、二成分ポンプＡｇｉｌｅｎｔ １１００）
（例えば、四成分ポンプＡｇｉｌｅｎｔ １１００）
・オートサンプラー （例えば、ＣＴＣ Ａｎａｌｙｔｉｃｓ ＨＴＣ ＰＡＬ）
・三重四極子ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ質量分析器
（例えば、Ｓｃｉｅｘ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ＡＰＩ４０００システム）
・カラム （例えば、Ｈｙｐｅｒｃａｒｂ、１００×３．０ｍｍ、５μｍ）
２．１．２ 試薬及び支給品
・アセトン （例えば、ＳｕｐｒａＳｏｌｖ（登録商標） Ｍｅｒｃｋ）
・アセトニトリル （例えば、ＳｕｐｒａＳｏｌｖ（登録商標） Ｍｅｒｃｋ）
・メタノール （例えば、ＳｕｐｒａＳｏｌｖ（登録商標） Ｍｅｒｃｋ）
・ギ酸 （例えば、Ｎｏｒｍａｐｕｒ Ｐｒｏｌａｂｏ）
・ＰＴＦＥフィルター（２５ｍｍ、０．４５μｍ）（例えば、Ａｃｒｏｄｉｓｃ ＣＲ Ｐａｌｌ Ｇｅｌｍａｎ）
・ポリプロ瓶（１２５ｍＬ、広口） （例えば、Ｎａｌｇｅｎ）
・コニカル遠心分離用チューブ（１５ｍＬ）（例えば、Ｍｅｒｃｋ ０１ １４２．５１８）
・抽出溶媒：アセトニトリル／水（５０：５０、ｖ／ｖ）
・希釈用溶媒 ０．５％ＨＣＯＯＨを有するメタノール
・移動相溶媒：０．５％ＨＣＯＯＨを有する水
２．１．３ 基準品目
十分に性質が決定され、保証された品目のみを基準品目として使用した。

基準品目は、Ｂａｙｅｒ ＣｒｏｐＳｃｉｅｎｃｅ ＧｍｂＨ ｐｒｏｄｕｋｔ Ａｎａｌｙｔｉｋ， Ｇ８６４， ｌｎｄｕｓｔｒｉｅｐａｒｋ Ｈｏｃｈｓｔ， Ｄ−６５９２６ Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ−ａｍ−Ｍａｉｎ， Ｇｅｒｍａｎｙによって市販された。

２．１．４ 標準溶液
原液及び標準溶液を、約５℃の冷蔵庫で遮光保存した。

原液（１０００ｍｇ／Ｌ）
１００ｍＬの琥珀色のねじキャップ付きフラスコ中に、基準品目２０ないし５０ｍｇを正確に秤量する。ビューレットを使用して、水のある量を添加して、実際に１０００ｍｇ／Ｌの原液を得る。撹拌器を使用して完全に溶解するまで完全に混合する。２つの個別の原液は、各化合物に関して調製されなければならない。これら２つの原液の比較後、それらを混合する。

混合溶液
まず、ホセチル−Ａｌ原液を水で１０倍希釈する。次に、「Ａ^＋」クラスのピペットを使用して、前記ホセチル−Ａｌ原液の１０倍希釈液５ｍＬ及び亜リン酸の５ｍＬをピペットで採取する。「Ａ^＋」クラスの５０ｍＬメスフラスコへ注ぐ。容積を水で調整し、蓋をし、振とうにより混合する。混合溶液（１０ｍｇ／Ｌのホセチル−Ａｌ―１００ｍｇ／Ｌの亜リン酸）。

強化標準溶液
混合溶液は、１０ＬＯＱレベルでの回収のための強化標準溶液としても使用する。水で１０倍希釈して、ＬＯＱレベルでの回収に使用される強化標準溶液を得る。

溶媒中の標準溶液
ＬＯＱレベルでの回収に使用される強化溶液の適切な希釈により（１ｍｇ／Ｌホセチル−Ａｌ―１０ｍｇ／Ｌ亜リン酸）、０．５％ギ酸を有するメタノールを使用して、ホセチル−Ａｌ０．０５ｍｇ／Ｌ及び亜リン酸０．５ｍｇ／Ｌの中間的な標準溶液を調製する。

溶媒中の標準溶液
較正に使用される標準溶液を得るため、希釈装置及び０．５％ギ酸を有するメタノールを使用して、中間的な標準溶液を即座に希釈し、次の濃度：０．１μｇ／Ｌホセチル−Ａｌ―１μｇ／Ｌ亜リン酸、０．２μｇ／Ｌホセチル−Ａｌ―２μｇ／Ｌ亜リン酸、０．５μｇ／Ｌホセチル−Ａｌ―５μｇ／Ｌ亜リン酸、１μｇ／Ｌホセチル−Ａｌ―１０μｇ／Ｌ亜リン酸、２μｇ／Ｌホセチル−Ａｌ―２０μｇ／Ｌ亜リン酸、及び５μｇホセチル−Ａｌ―５０μｇ／Ｌ亜リン酸を得る。

コムギ試料の場合のみ、希釈装置及び０．５％ギ酸を有するメタノールを使用して、中間的な標準溶液を即座に希釈し、次の濃度：０．３１μｇ／Ｌホセチル−Ａｌ―３．１μｇ／Ｌ亜リン酸、０．５μｇ／Ｌホセチル−Ａｌ―５μｇ／Ｌ亜リン酸、０．８３μｇ／Ｌホセチル−Ａｌ―８．３μｇ／Ｌ亜リン酸、１μｇ／Ｌホセチル−Ａｌ―１０μｇ／Ｌ亜リン酸、２．５μｇ／Ｌホセチル−Ａｌ―２５μｇ／Ｌ亜リン酸、５μｇホセチル−Ａｌ―５０μｇ／Ｌ亜リン酸、及び８．３μｇ／Ｌホセチル−Ａｌ―８３μｇ／Ｌ亜リン酸を得る。

較正に使用される、マトリクスに合致させた標準溶液
マトリクス効果の発生をモニターし、試料材料すべてにおいてマトリクスに合致させた標準物質を使用して、両化合物の測定を確立する。

中間的な標準溶液から、対照試料の最終的な抽出物である希釈混合物を除き、希釈は、溶媒中の標準溶液の調製と同一である。

備考：最終抽出物の２０ないし２５ｍＬが、すべての希釈をするのに必要である。ろ過工程が困難な場合、フィルターを使用できる。

２．１．５ 標準溶液の安定性
約５℃の冷蔵庫で遮光保存された原液は、４ヶ月半安定であることがわかった。

約５℃の冷蔵庫で遮光保存された強化標準溶液は、２ヶ月半安定であることがわかった。

２．２ 残留物分析方法論
原法の分析方法と比較した幾つかの改変を導入した。

精製及び誘導体化の工程を省略し、分析及び検出モードを変化させ、及びホセチル−Ａｌの場合、０．５ｍｇ／ｋｇから０．０１ｍｇ／ｋｇまで、亜リン酸の場合、０．５ｍｇ／ｋｇから０．１ｍｇ／ｋｇまで、原法００８６１の定量化限界（ＬＯＱ）を低下させるために、この報告に記載の方法改変００８６１／Ｍ００１を確認した。

・０．５ｍｇ／ｋｇから、ホセチル−Ａｌの場合０．０１ｍｇ／ｋｇまで、亜リン酸の場合０．１ｍｇ／ｋｇまで、定量化限界を低下させた。

・Ｃ１８ ＳＰＥカートリッジ精製段階を省略した。

・誘導体化工程を抑制した。

・ＧＣ／ＦＰＤの替わりにＬＣ／ＭＳ／ＭＳによって、定量化を実施した。

すべての改変は、以下の記載に含めた。

方法の流れ図は、補遺１に記載されている。

回収実験の場合、秤量後及び抽出前に適切な標準溶液を試料材料へ添加することによって、試料を強化する。

抽出
１．均質な試料材料２０．０ｇを１２５ｍＬポリプロピレン瓶へと秤量する。

注意：変数Ｇとして表される残留物算出のために、試料の重量を使用する。

２．アセトニトリル／水（５０：５０、ｖ／ｖ）８０ｍＬを添加する。

３．高速配合器（ＩＫＡ又は均等物）を使用して、試料を約５分間配合する。

４．抽出物を約５分間遠心分離する（３６００ｒｐｍ、５℃）。

５．上清を２００ｍＬのメスフラスコへ注ぐ。

６．アセトニトリル／水（５０：５０、ｖ／ｖ）８０ｍＬを底に添加する。

７．高速配合器（ＩＫＡ又は均等物）を使用して、試料を約５分間配合する。

８．抽出物を約５分間遠心分離する（３６００ｒｐｍ、５℃）。

９．上清をメスフラスコへ注ぐ。

１０．メタノールで２００ｍＬにする。これは、抽出物Ａである。

注意：変数Ｖとして表される残留物の算出のために、抽出物Ａの容積を使用する。

１１．抽出物Ａの約１０ｍＬの一定分量を約１０分間遠心分離する（６０００ｒｐｍ―大気温）。

１２．ＰＴＦＥフィルター（Ａｃｒｏｄｉｓｃ ＣＲ型２５ｍｍ、０．４５μｍ）を通じてろ過する。

１３．０．５％ギ酸で酸性化されたメタノールを使用して、抽出物を５倍希釈する。これは、最終抽出物である。

１４．２．３章のＬＣ／ＭＳ／ＭＳ測定へ進む。

備考：コムギ試料の場合、工程１０から、後述の調製に従う。

１０．濃ギ酸１ｍＬを添加し、メタノールで２００ｍＬにする。これは、抽出物Ａである。

注意：変数Ｖとして表される残留物の算出のために、抽出物Ａの容積を使用する。

１１．抽出物Ａの約１０ｍＬの一定分量を約１０分間遠心分離する（６０００ｒｐｍ―大気温）。

１２．希釈装置で、０．５％ギ酸を有するメタノールを使用して、上清を２倍希釈する。

１３．Ａｃｒｏｄｉｓｃ ＣＲ ２５ｍｍ ＰＴＦＥフィルター（０．４５μｍ）を通じて抽出物をろ過する。これは、最終抽出物である。

１４．２．３章のＬＣ／ＭＳ／ＭＳ測定へ進む。

２．３ 分析及び機器条件
最終抽出物を高速液体クロマトグラフへ注入し、エレクトロスプレーイオン化を有するタンデム質量分析によって検出する。

マトリクスに合致させた標準物質を使用する外部標準化によって、定量化を実施する。

この方法の妥当性確認の過程で使用された典型的なＬＣ／ＭＳ／ＭＳ条件を、２．３．１章及び２．３．２章に列挙する。これらの条件を指針として付与し、他のＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳシステムに適応しなければならないことがある。

２．３．１ ＨＰＬＣ条件
機器：二成分ポンプＡｇｉｌｅｎｔ １１００
四成分ポンプＡｇｉｌｅｎｔ１１００（溶媒を調製）
オートサンプラー：ＣＴＣ Ａｎａｌｙｔｉｃｓ ＨＴＣ ＰＡＬ
カラム：Ｈｙｐｅｒｃａｒｂ、１００×３．０ｍｍ、５μｍ
プレカラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｃ１８ ＯＤＳ、４×２．０ｍｍ
注入容積：２０μＬ
カラム温度：大気温（約２５℃）
移動相：定組成モード：３５：６５（ｖ／ｖ）メタノール／水＋０．５％ギ酸
流量（カラム）：４００μＬ／分
保持時間：亜リン酸の場合４ないし６分、ホセチル−Ａｌの場合７ないし１０分
切り換え弁：分析カラムとＭＳ／ＭＳシステムとの間に置かれた弁
夾雑からイオン源を保護し、イオン抑制の危険性が生じるのを低下するために、この弁を使用し、実施の最初の数分からの溶出物を廃棄物へと迂回させ、ＬＣ溶出流を質量分析器へと再び切り換えた後にイオン源を安定化させる必要性を回避するために、補給流を使用した。

補給溶媒：５０：５０（ｖ／ｖ）メタノール／水
切り換え流量：２００μＬ／分
備考：
・注入前にＨＰＬＣシステムの安定化に約２時間待機することが必要である。試料のセットの間に、両化合物の保持時間のわずかなドリフトを観察できる。
・Ｈｙｐｅｒｃａｒｂプレカラムは、使用してはならない。

２．３．２ ＭＳ／ＭＳ条件
ＭＲＭ（多重反応観察）条件下で、負のイオンモードで作動するエレクトロスプレー界面の装備された三重四極子質量分析システムにおいて、実験を実施した。

例：
検出器：三重四極子ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ質量分析器、
例えば、Ｓｃｉｅｘ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ， ＡＰＩ４０００システム
ソース：ＴＩＳ（ターボイオンスプレー）
温度：６００℃
走査型：ＭＲＭモード（多重反応観察モード）
極性：負のイオンモード
ガス流：噴霧状ガス空気（ＧＳ１）：４０
ターボガス空気（ＧＳ２）：６０
カーテンガスＮ_２（ＣＵＲ）：２０
衝突気体Ｎ_２（ＣＡＤ）：６衝突エネルギー：

注意：幾つかの質量分析器条件は、機器特異的である。質量分析器条件は、分析前に適格な操作者によって最適化されるべきである。

ＭＳ／ＭＳ条件及びＬＣ条件に関する詳細を、補遺２に付与する。

ホセチル−Ａｌ及び亜リン酸の場合の定量化イオンに関する断片化経路を、図１及び図２に示す。

２．３．３ 確認のための遷移
試料中の何らかの干渉又は汚染を確認又は排除するために、上述の同一の条件において、次の遷移を使用できる。

ホセチル−Ａｌ及び亜リン酸に対する確認のための遷移に関する断片化経路が、図３及び図４に示されている。

注意：確認のための遷移を使用することによっても、すべての回収試料を分析した。結果を補遺３に示す。

２．４検出器の直線性
溶媒中の標準物質及びマトリクスに合致させた標準物質を使用して、ホセチル−Ａｌ及び亜リン酸に関して、使用される検出器の直線性を検査した。

０．３１ないし８．３μｇ／Ｌ及び３．１ないし８３μｇ／Ｌのコムギ試料の場合を除き、０．１ないし５μｇ／Ｌ及び１ないし５０μｇ／Ｌの個々の濃度で、ホセチル−Ａｌ及び亜リン酸の標準物質を注入することによって、直線性を検査した。

２．５ 抽出物の保存安定性
ホセチル−Ａｌ及び亜リン酸を含有する試料抽出物の安定性を、各試料材料に関して決定した。

この目的のため、初期分析後、約１０℃に恒温にしたオートサンプラーラック中に、回収試料の最終抽出物を保存し、数日の保存期間の後、再分析した。

２．６ 算出
２．６．１ 残留物の算出
この場合の評価は、マトリクスに合致させた標準物質を使用する外部標準化に従って実施する。

試料の各セットの分析の間、表１８に記載の６個（又はコムギ試料の場合７個）の標準溶液を１回注入する。機器応答のあらゆる僅かな変化も補正するために、試料の間に標準物質を配置すべきである。各化合物に関して、最小二乗法を用いた、１／ｘの重み付けをした直線回帰によって得られる較正曲線を確立するために、濃度に対してピーク面積をプロットする。Ａｎａｌｙｓｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（１．４版）を使用して、最終抽出物中の濃度を測定するための対応するモデルを算出する。標準溶液に関して上述したものと同一の条件を使用して、各最終抽出物を１回注入する。すでに確立された推定計算モデルを使用して、各化合物のμｇ／Ｌでの最終濃度を各注入に関して測定する。各化合物について、次式を使用して、ｍｇ／ｋｇで表される残留物Ｒの量を算出する。

２．６．２ 回収率の算出
２．６．１に従って、回収試料に関するμｇ／Ｌでの各化合物の濃度を測定する。

次に、パーセント回収率を以下のように算出する。

２．６．３ 相対的標準偏差（ＲＳＤ）の算出
ＲＳＤを次のとおり算出する。

ＲＳＤ（％）＝標準偏差／平均回収量×１００％

３ 結果及び考察
３．１ 特異性及び選択性
本方法によって、ブドウ、オレンジ、レタス、キュウリ、アボカド及びコムギの試料中のホセチル−Ａ及びその代謝産物（亜リン酸）を測定できる。

本方法の特異性は、非常に選択的なＭＳ／ＭＳ検出と組み合わせたＨＰＬＣ分離に起因した。

３．２ 対照試料中の見かけの残留物
各試料材料に関して、２つの対照試料を分析した。使用される対照材料の出所は、表６に列挙されている。

対照試料中の残留物レベルの概算を実施した。結果を表７に列挙する。すべての対照試料に関する見かけの残留物は、各化合物についてＬＯＱの３０％を下回る。すなわち、ホセチル−Ａｌの０．００３ｍｇ／ｋｇ未満及び亜リン酸の０．０３ｍｇ／ｋｇ未満であった。

３．３ 検出器の直線性及びマトリクス効果
溶媒中の標準物質及びマトリクスに合致させた標準物質を使用して、ホセチル−Ａｌ及び亜リン酸に関して、使用される検出器の直線性を検査した。

０．３１ないし８．３μｇ／Ｌ及び３．１ないし８３μｇ／Ｌのコムギ試料の場合を除き、０．１ないし５μｇ／Ｌ及び１ないし５０μｇ／Ｌの個々の濃度で、ホセチル−Ａｌ及び亜リン酸の標準物質を注入することによって、直線性を検査した。

実験の詳細は、２．４章に見出され得る。

各クロマトグラムにおいて、式
ｙ＝ａｘ＋ｂ（１／ｘで重み付けする）
（式中、ｙ＝ピーク面積
ｘ＝注入された標準溶液中の濃度）
の形式の較正曲線を得るために、各標準溶液中に含有されるホセチル−Ａｌ又は亜リン酸の個々の対応する濃度に対して、ホセチル−Ａｌ又は亜リン酸の測定されたピーク面積をプロットする。

ＬＣ／ＭＳ／ＭＳに関する検出器反応の測定の結果を、表８に要約する。

溶媒中で調製された標準物質又はマトリクスに合致させた標準物質のいずれかを使用して、ホセチル−Ａｌの場合０．１ないし５μｇ／Ｌ（又はコムギの場合０．３１ないし８．３μｇ／Ｌ）の範囲で、及び亜リン酸の場合１ないし５０μｇ／Ｌ（又はコムギの場合３．１ないし８３μｇ／Ｌ）の範囲で、標準物質に関して、分析物の注入された量とＬＣ／ＭＳ／ＭＳの検出器反応との間に優れた直線相関が観察された。

マトリクス効果の発生を観察した。結果を表９及び表１０に示す。

すべての試料材料において、亜リン酸の測定は、マトリクスに合致させた標準物質を使用して確立されなければならない。従って、両化合物の測定は、マトリクスに合致させた標準物質を使用して確立される。

３．４ 定量化限界及び回収実験
７０ないし１１０％の範囲内の平均回収及び２０％以下のＲＳＤを得ることができる場合の最低強化レベルとして、定量化限界（ＬＯＱ）を定義した。ブドウ（全果実）、オレンジ（全果実）、レタス（頭部）、キュウリ（全果実）、アボカド（全果実）及びコムギ（穀粒）において、ホセチル−Ａｌの場合０．０１ｍｇ／ｋｇ、亜リン酸の場合０．１ｍｇ／ｋｇにＬＯＱを設定した。

これらのマトリクスに関する方法の妥当性を確認するために、分析前に、ホセチル−Ａｌ及び亜リン酸の定義された量で試料を強化した。

３．５ 回収率
得られた詳細な回収結果が、表１１及び表１２に列挙されている。

得られた回収率は、下表１３に要約されている。

各化合物に対して、合計６０の回収率を決定した。単一の回収率は、ホセチル−Ａｌの場合６９ないし１１４％の範囲にあり、亜リン酸の場合６５ないし１１３％の範囲にあった。ホセチル−Ａｌの場合、強化レベルあたりの平均回収率は９３ないし９７％の範囲にあり、すべての試料材料にわたる全体的な回収率及び強化レベルは９５％であり、並びに、亜リン酸の場合、強化レベルあたりの平均回収率は８６ないし９７％の範囲にあり、すべての試料材料にわたる全体的な回収率及び強化レベルは９１％であった。

単一強化レベルに対する相対的標準偏差（ＲＳＤ）は、ホセチル−Ａｌでは７．６ないし１２．３％の範囲であり、亜リン酸では９．５ないし１４．９％の範囲であった（ｎ＝３０）。試料材料あたりの全体的なＲＳＤ値は、ホセチル−Ａｌでは２．１ないし１０．９％、亜リン酸では６．０ないし１７．８％であった（ｎ＝１０）。すべての試料にわたるＲＳＤ値は、ホセチル−Ａｌでは１０．２％、亜リン酸では１３．７％であった（ｎ＝６０）。

３．６ 抽出物の保存安定性
ホセチル−Ａｌ及びその代謝産物である亜リン酸を含有する最終抽出物の安定性を測定した。この目的のため、初期分析後、約１０℃に恒温にしたオートサンプラーラック中に、回収試料の最終抽出物を放置し、数日の保存期間の後、再分析した。

保存安定性の結果を、表１４に詳述する。

４ 評価及び考察
ブドウ（全果実）、オレンジ（全果実）、レタス（頭部）、キュウリ（全果実）、アボカド（全果実）及びコムギ（穀粒）中のホセチル−Ａｌ及びその代謝産物（亜リン酸）の残留物のＬＣ／ＭＳ／ＭＳによる測定について、表記の残留物分析方法の改変００８６１／Ｍ００１の妥当性を確認した。

ホセチル−Ａｌ及びその代謝産物（亜リン酸）を、試料材料から、アセトニトリル／水（５０：５０）の混合物で抽出した。試料材料の遠心分離及び希釈後、Ｈｙｐｅｒｃａｒｂカラムを使用するＨＰＬＣによって残留物を定量し、エレクトロスプレーイオン化を使用するタンデム質量分析によって検出する。マトリクスに合致させた標準物質中での外部標準化により、定量化を実施した。

確認セットは、検出器の直線性の測定、定量化の限界、方法の正確性及び試料最終抽出物の保存安定性を包含した。

溶媒中の標準物質及びマトリクスに合致させた標準物質を使用して、ホセチル−Ａｌ及び亜リン酸に関して、使用される検出器の直線性を検査した。

０．３１ないし８．３μｇ／Ｌ及び３．１ないし８３μｇ／Ｌのコムギ試料の場合を除き、０．１ないし５μｇ／Ｌ及び１ないし５０μｇ／Ｌの個々の濃度で、ホセチル−Ａｌ及び亜リン酸の標準物質を注入することによって、直線性を検査した。

マトリクス効果の発生をモニターした。

すべての試料材料において、亜リン酸の測定は、マトリクスに合致させた標準物質を使用して確立されなければならない。そのため、マトリクスに合致させた標準物質を使用して、両化合物の測定を確立する。

すべての対照試料の見かけの残留物は、各化合物でＬＯＱの３０％を下回った。すなわち、ホセチル−Ａｌの０．００３ｍｇ／ｋｇ未満及び亜リン酸の０．０３ｍｇ／ｋｇ未満であった。

定量化限界（ＬＯＱ）は、７０ないし１１０％の範囲内の平均回収及び２０％以下のＲＳＤを得ることができる場合の最低強化レベルとして定義した。ブドウ（全果実）、オレンジ（全果実）、レタス（頭部）、キュウリ（全果実）、アボカド（全果実）及びコムギ（穀粒）において、ホセチル−Ａｌでは０．０１ｍｇ／ｋｇ、亜リン酸では０．１ｍｇ／ｋｇにＬＯＱを設定した。

方法の正確性は、測定された回収率に基づいて評価できる。単一の回収率は、ホセチル−Ａｌの場合６９ないし１１４％の、亜リン酸の場合６５ないし１１３％の範囲にあった。ホセチル−Ａｌの場合、強化レベルあたりの平均回収率は９３ないし９７％の範囲にあり、すべての試料材料にわたる全体的な回収率及び強化レベルは９５％であり、並びに、亜リン酸の場合、強化レベルあたりの平均回収率は８６ないし９７％の範囲にあり、すべての試料材料にわたる全体的な回収率及び強化レベルは９１％であった。方法の正確性は、各強化レベルに対する平均回収が７０ないし１１０％の範囲であるべきことを要求する残留物分析方法に関する要条を満たす。

方法の精度及び再現性は、回収率の平均値に対して求められた相対的標準偏差（ＲＳＤ）に基づいて評価できる。単一の強化レベルに対する相対的標準偏差（ＲＳＤ）は、ホセチル−Ａｌでは７．６ないし１２．３％、亜リン酸では９．５ないし１４．９％の範囲であった（ｎ＝３０）。試料材料あたりの全体的なＲＳＤ値は、ホセチル−Ａｌのでは２．１ないし１０．９％、亜リン酸のでは６．０ないし１７．８％であった（ｎ＝１０）。すべての試料にわたるＲＳＤ値は、ホセチル−Ａｌでは１０．２％、亜リン酸では１３．７％であった（ｎ＝６０）。

試料材料あたりの全体的なＲＳＤ値は、ホセチル−Ａｌでは２．１ないし１０．９％、亜リン酸では６．０ないし１７．８％であった（ｎ＝１０）。すべての試料にわたるＲＳＤ値は、ホセチル−Ａｌでは１０．２％、亜リン酸では１３．７％であった（ｎ＝６０）。すべてのＲＳＤ値は、２０％を十分に下回っていたため、方法の精度及び再現性は許容されると考えることができる。

方法の妥当性確認のすべての結果は、残留物分析方法に関する一般的な要件に従っているため、この方法の改変は妥当性が適切に確認されている。

補遺１
残留物方法００８６１／Ｍ００１の流れ図

補遺２
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ条件に関する詳細
コメント：
同期化モード：ＬＣ同期化
自動平衡：オフ
獲得時間：１１分５９秒
走査数：８８８
ファイル中の時間：１
獲得モジュール：獲得方法
ソフトウェアバージョン Ａｎａｌｙｓｔ１．４
ＭＳ方法特性：
第１期
期間中の走査：８８８
相対開始時間：０．００ミリ秒
期間中の実験：１ １
第１期 実験１：
走査型：ＭＲＭ（ＭＲＭ）
極性：負
走査モード：Ｎ／Ａ
イオン源：ターボスプレー
解像Ｑ１：ユニット
解像Ｑ３：ユニット
強度閾値：０．００ｃｐｓ
設定時間：０．００００ミリ秒
ＭＲポーズ：５．００７０ミリ秒
ＭＣＡ：なし
段階の大きさ：０．００ａｍｕ

パラメータの表（第１期 実験１）：
ＣＵＲ：２０．００
ＧＳ１：４０．００
ＧＳ２：６０．００
ＩＳ：−４５００．００
ＴＥＭ：６００．００
ｉｈｅ：オン
ＣＡＤ：６．００
ＥＰ −１０．００
ＣＸＰ −１．００
確認のための遷移：

パラメータの表（第１期 実験１）：
ＣＵＲ：２０．００
ＧＳ１：４０．００
ＧＳ２：６０．００
ＩＳ：−４５００．００
ＴＥＭ：６００．００
ｉｈｅ：オン
ＣＡＤ：６．００
ＥＰ −１０．００
ＣＸＰ −５．００
Ａｇｉｌｅｎｔ １１００ ＬＣポンプ方法特性：
ポンプモデル：Ａｇｉｌｅｎｔ １１００ ＬＣ二成分ポンプ
最小圧力（ｐｓｉ）：０．０
最大圧力（ｐｓｉ）：５８０１．０
死容積（μＬ）：４０．０
最大流量傾斜（ｍＬ／分 ^２ ）：１００．０
最大圧力傾斜（ｐｓｉ／秒）：２９０．０

左側圧縮率：５０．０
右側圧縮率：１１５．０
左側死容積（μＬ）：４０．０
右側死容積（μＬ）：４０．０
左側拍出量（μＬ）：−１．０
右側拍出量（μＬ）：−１．０
左側溶媒：Ａ２（水＋０．５％ギ酸）
右側溶媒：Ｂ２（メタノール）
ＣＴＣ ＰＡＬオートサンプラー方法特性：
ループ容積１（μＬ）：１００
ループ容積２（μＬ）：２０
注入容積（μＬ）：５０．０００
方法の記述：
シリンジ：２５０μＬ
Ａｎａｌｙｓｔ ＬＣ−Ｉｎｊ
空気体積（μＬ） ０
溶媒１による前洗浄 ２
溶媒２による前洗浄 １
試料による前洗浄 ０
充填速度（μＬ／秒） ５０
充填拍出 ０
注入箇所 ＬＣ Ｖｌｖ２
注入速度（μＬ／秒） ５０
注入前遅延（ミリ秒） ５００
注入後遅延（ミリ秒） ５００
溶媒１による後洗浄 ３
溶媒２による後洗浄 ２
溶媒１によるバルブ洗浄 ２
溶媒２によるバルブ洗浄 １
Ａｇｉｌｅｎｔ １１００
ＬＣポンプ方法特性：
ポンプモデル：Ａｇｉｌｅｎｔ １１００ ＬＣ四成分ポンプ
最小圧力（ｐｓｉ）：０．０
最大圧力（ｐｓｉ）：５８０１．０
圧縮率：１００．０
死容積（μＬ）：４０．０
拍出量（μＬ）：−１．０
最大流量傾斜（ｍＬ／分^２）：１００．０
最大圧力傾斜（ｐｓｉ／秒）：２９０．０

初期流速（μＬ／分）：２００．０
流量センサー較正表インデックス：０
Ｖａｌｃｏバルブ方法特性
Ｖａｌｃｏバルブ偏向装置
総時間（分） 位置
１ ０．０ Ｂ 廃棄物
２ ３．０ Ａ スペクトロ

この詳細な実施例は、水試料を用いた、ホセチル−Ａｌ及び亜リン酸の分析に関する。本実施例は、飲料水及び地表水中／上のホセチル−Ａｌ及びその代謝産物（亜リン酸）の残留物の、ＬＣＭＳＭＳによる測定に関する分析方法００９３１への改変Ｍ００１である。

飲料水及び地表水中のホセチル−Ａｌ及びその代謝産物（亜リン酸）の残留物のＬＣ／ＭＳ／ＭＳによる測定について、表記残留物分析方法の改変００９３１／Ｍ００１の妥当性を確認した。

陽イオン性樹脂で試料材料を処理した後、濃縮する。Ｈｙｐｅｒｃａｒｂカラムを使用するＨＰＬＣによって、ホセチル−Ａｌ及びその代謝産物（亜リン酸）の残留物を定量化し、エレクトロスプレーイオン化を使用するタンデム質量分析によって検出する。マトリクスに合致させた標準物質中での外部標準化により、定量化を実施した。

確認のセットは、検出器の直線性の決定、定量化の限界及び方法の正確性を包含した。

溶媒中の標準物質及びマトリクスに合致させた標準物質を使用して、ホセチル−Ａｌ及び亜リン酸に関して、使用される検出器の直線性を検査した。

０．２ないし２０μｇ／Ｌの濃度でホセチル−Ａｌ及び亜リン酸の標準物質を注入することによって、直線性を検査した。

マトリクス効果の発生を観察した。飲料水中において、ホセチル−Ａｌの測定は、マトリクスに合致させた標準物質を使用して確立されなければならない。両試料材料中の亜リン酸に関する純溶媒中の標準物質で得られる結果は、欧州の要件に必ずしも従うとは限らない。そのため、飲料水及び地表水中の量化合物の測定は、マトリクスに合致させた標準物質を使用して確立される。

すべての対照試料に関する見かけの残留物は、各化合物に関してＬＯＱの３０％を下回っていた。すなわち０．００００３ｍｇ／Ｌ未満であった。

定量化限界（ＬＯＱ）は、７０ないし１１０％の範囲内の平均回収及び２０％のＲＳＤが得られ得る場合の最低強化レベルとして、定義した。飲料水及び地表水中の各化合物に関して、ＬＯＱを０．０００１ｍｇ／Ｌに設定した。

方法の正確性は、測定された回収率に基づいて評価できる。単一の回収率は、ホセチル−Ａｌの場合７５ないし１１８％の、亜リン酸の場合７２ないし１１７％の範囲にあった。ホセチル−Ａｌの場合、強化レベルあたりの平均回収率は８９ないし９６％の範囲にあり、すべての試料材料にわたる全体的な回収率及び強化レベルは９３％であり、並びに、亜リン酸の場合、強化レベルあたりの平均回収率は９１ないし９３％の範囲にあり、すべての試料材料にわたる全体的な回収率及び強化レベルは９２％であった。
方法の正確性は、各強化レベルに関する平均回収が７０ないし１１０％の範囲であるべきことを要求する残留物分析方法に関する要件を満たす。

方法の精度及び再現性は、回収率の平均値に対して求められた相対的標準偏差（ＲＳＤ）に基づいて評価できる。単一の強化レベルに対する相対的標準偏差（ＲＳＤ）は、ホセチル−Ａｌでは９．６ないし１４．３％、亜リン酸では８．８ないし１９．８％の範囲であった（ｎ＝１０）。

試料材料あたりの全体的なＲＳＤ値は、ホセチル−Ａｌでは７．５ないし９．７％、亜リン酸では９．３ないし１２．４％であった（ｎ＝２０）。すべての試料にわたるＲＳＤ値は、ホセチル−Ａｌでは１２．７％、亜リン酸では１５．０％であった（ｎ＝２０）。すべてのＲＳＤ値は、２０％を十分に下回っていたため、方法の精度及び再現性は許容されると考えることができる。

方法の妥当性確認のすべての結果は、残留物分析方法に関する一般的な要件に従っているため、この方法の改変の妥当性は適切に確認された。

飲料水及び地表水に対して、変法の妥当性も確認した。濃縮工程の省略によって、主要な方法の試料の調製を大幅に簡素化した。検査されるＬＣ条件とは無関係に、マトリクスに合致させた標準物質を使用した場合、ホセチル−Ａｌについては０．１μｇ／Ｌ及びホセチル−Ａｌについてはこの限界の１０倍で、及び亜リン酸では１μｇ／Ｌで、濃縮していない飲料水及び知用水に関して、欧州の必要条件（１９９６年７月１６日発令の９６／４６／ＥＣ）に従って、前記変法の妥当性を確認した。

主要な方法に関して、試料の調製を大いに簡素化し、時間を大幅に短縮できる。

１．序論
ホセチル−Ａｌは、殺真菌剤である
誘導体化及び精製の工程を省略し、分析及び検出モードを変化させ、地表水中のホセチル−Ａｌの場合０．００１ｍｇ／Ｌから、亜リン酸の場合０．００４ｍｇ／Ｌから、飲料水中の亜リン酸の場合０．００２ｍｇ／Ｌから、両試料材料中の各化合物について０．０００１ｍｇ／Ｌまで、原法００９３１の定量化限界（ＬＯＱ）を低下させるために、この報告に記載されている方法改変００９３１／Ｍ００１の妥当性を確認した。

１．１ 原法の引用
原法：００９３１
化合物：ホセチル−Ａｌ及びその代謝産物（亜リン酸）
著者：Ｌ．Ｂａｕｄｅｔ − Ｒ．Ｄｉｏｔ − Ｍ．Ｇｕｉｌｌｅｔ − Ｊ．Ｌ．Ｋｉｅｋｅｎ
Ａｖｅｎｔｉｓ ＣｒｏｐＳｃｉｅｎｃｅ Ｃｅｎｔｒｅ ｄｅ Ｒｅｃｈｅｒｃｈｅ ｄｅ ｌａ Ｄａｒｇｏｉｒｅ
１４／２０ ｒｕｅ Ｐｉｅｒｒｅ Ｂａｉｚｅｔ ６９００９ Ｌｙｏｎ − Ｆｒａｎｃｅ
引用：農業書類番号（Ａｇｒｅｄｏｃ Ｎｕｍｂｅｒｓ）：２０００年５月２２日付けのＲ０１１７６０及びＲ０１１７６１
改変に関する理由：・誘導体化及び精製の工程を省略する。

・ＧＣ／ＦＰＤからＬＣ／ＭＳ／ＭＳまで、分析及び検出モードを変化させる。

・地表水中のホセチル−Ａｌの場合０．００１ｍｇ／Ｌから、亜リン酸の場合０．００４ｍｇ／Ｌから、飲料水中の亜リン酸の場合０．００２ｍｇ／Ｌから、両試料材料中の各化合物における０．０００１ｍｇ／Ｌまで、ＬＯＱを低下させる。

１．２ 物理的及び化学的特性
実施例３を参照されたい。

２．実験の部
２．１ 材料
２．１．１ 装置
標準的な実験室用ガラス製消耗品は、リン酸塩を含有しない界面活性剤のみで洗浄し、水及びアセトンですすぐべきである。

いずれの夾雑も回避するため、使い捨ての実験室用消耗品を使用することを強く勧める。

・平衡：
→正確性±０．１ｍｇ（分析用標準物質）（例えば、Ｍｅｔｔｌｅｒ ＡＴ２６１範囲）
→正確性±０．１ｇ（試料）（例えば、Ｍｅｔｔｌｅｒ ＰＭ６０００）
・希釈装置（例えば、Ｈａｍｉｌｔｏｎ ＭｉｃｒｏＬａｂ １０００）
・回転式振とう器（例えば、Ｈｅｉｄｏｌｐｈ ＲＥＡＸ ２）
・試料濃縮器（例えば、Ｔｅｃｈｎｅ ｄｒｉ−ブロック）
・超音波槽
・ＨＰＬＣ（例えば、二股ポンプＡｇｉｌｅｎｔ １１００）
・オートサンプラー（例えば、ＣＴＣ Ａｎａｌｙｔｉｃｓ ＨＴＣ ＰＡＬ）
・三重四極子ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ質量分析器 （例えば、Ｓｃｉｅｘ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ， ＡＰＩ４０００システム）
・カラム（例えば、Ｈｙｐｅｒｃａｒｂ、１００×２．０ｍｍ、５μｍ）
２．１．２ 試薬及び支給品
・アセトン （例えば、ＳｕｐｒａＳｏｌｖ（登録商標） Ｍｅｒｃｋ）
・メタノール （例えば、ＳｕｐｒａＳｏｌｖ（登録商標） Ｍｅｒｃｋ）
・ギ酸 （例えば、Ｎｏｒｍａｐｕｒ Ｐｒｏｌａｂｏ）
・陽イオン性樹脂（ＡＧ ５０Ｗ−Ｘ８、２０ないし５０メッシュ、水素型）（例えば、Ｂｉｏ Ｒａｄ）
・ＧＦ／Ａフィルター（１２５ｍｍ） （例えば、Ｗｈａｔｍａｎ）
・ポリプロ瓶（１２５ｍＬ、広口） （例えば、Ｎａｌｇｅｎ）
・ポリプロ瓶（１０００ｍＬ、広口） （例えば、Ｎａｌｇｅｎ）
・パイレックス（登録商標）ガラス検査チューブ（２０×１５０ｍｍ）（例えば、Ｃｏｒｎｉｎｇ）
・ポリプロ漏斗（６７ｍｍ） （例えば、Ｍａｒｙｌａｎｄｓ Ｐｌａｓｔｉｃｓ）
・ガラス製使い捨てピペット（５ｍＬ）
・希釈用溶媒 ０．５％ＨＣＯＯＨを有する水
・移動相溶媒：２％ＨＣＯＯＨを有する水
２％ＨＣＯＯＨを有するメタノール
２．１．３ 基準品目
実施例３を参照されたい。

２．１．４ 標準溶液
ストック及び標準溶液を約５℃の冷蔵庫で遮光保存した。

原液（１０００ｍｇ／Ｌ）
１００ｍＬの琥珀色のねじキャップフラスコに、基準品目２０ないし５０ｍｇを正確に秤量する。ビューレットを使用して、水のある量を添加して、実際に１０００ｍｇ／Ｌの原液を得る。撹拌器を使用して、完全に溶解するまで完全に混合する。２つの個別の原液は、各化合物について調製しなければならない。これら２つの原液の比較後、それらを混合する。

混合溶液
「Ａ^＋」クラスのピペットを使用して、各原液５ｍＬをピペットで採取する。「Ａ^＋」クラスの５０ｍＬメスフラスコ中に注ぐ。水で容積を調整し、キャップし、振とうによって混合する（各化合物の１００ｍｇ／Ｌ）
強化標準溶液
混合溶液の水中での連続希釈によって、１０ＬＯＱレベル（各化合物の０．１ｍｇ／Ｌ）での回収に使用される強化標準溶液、及びＬＯＱレベル（各化合物の０．０１ｍｇ／Ｌ）での回収に使用される強化標準溶液を調製する。

中間的な標準溶液
混合溶液の連続希釈によって、水を使用して１．０ｍｇ／Ｌで中間的な標準溶液を調製する。

溶媒中の標準溶液
較正に使用される標準溶液を得るため、希釈装置及び０．５％ギ酸を有するメタノールを使用して、中間的な標準溶液を即座に希釈し、次の濃度：０．２、０．４、０．５、０．７５、１、２、５、１０、及び２０μｇ／Ｌを得る。

較正に使用されるマトリクスに合致させた標準溶液
マトリクス効果の発生をモニターし、両試料材料中のマトリクスに合致させた標準物質を使用して、両化合物の測定を確立する。

中間的な標準溶液から、対照試料の最終的な抽出物である希釈混合物を除き、希釈は溶媒中の標準溶液の調製と同一である。

備考：
・すべての希釈をするのに、最終抽出物の２０ないし２５ｍＬが必要である。

・使用前日に、対照試料の最終抽出物を調製し、冷蔵庫で保存し得る。

２．１．５ 標準溶液の安定性
約５℃の冷蔵庫で遮光保存された原液は、９ヶ月半安定であることがわかった。

２．２ 残留物分析方法論
原法の分析方法と比べて幾つかの改変を導入した。誘導体化及び精製の工程を省略し、分析及び検出モードを変化させ、地表水中のホセチル−Ａｌの場合０．００１ｍｇ／Ｌから、亜リン酸の場合０．００４ｍｇ／Ｌから、飲料水中の亜リン酸の場合０．００２ｍｇ／Ｌから、両試料材料中の各化合物について０．０００１ｍｇ／Ｌまで、原法００９３１の定量化限界（ＬＯＱ）を低下させるために、この報告に記載されている方法改変００９３１／Ｍ００１の妥当性を確認した。

・地表水中のホセチル−Ａｌの場合０．００１ｍｇ／Ｌから、亜リン酸の場合０．００４ｍｇ／Ｌから、飲料水中の亜リン酸の場合０．００２ｍｇ／Ｌから、両試料材料中の各化合物ついて０．０００１ｍｇ／Ｌまで、ＬＯＱを低下させた。

・樹脂処理によって、ＮａＯＨ処理を置換した。

・誘導体化工程を省略した。

・液体−液体分画による精製工程を省略した。

・ＧＣ／ＦＰＤの替わりにＬＣ／ＭＳ／ＭＳによって、定量化を実施した。

すべての改変は、下記に包含した。

方法の流れ図を補遺１に記載する。

注意：分析の間、設定された各試料に関し、試料調製に由来する亜リン酸の夾雑が見られない（３０％未満のＬＯＱ）にするため、水試料をミリＱ水によって置換するブランク試薬を調製することが必要である。

備考：標準的な実験室用ガラス製消耗品は、リン酸塩を含有しない界面活性剤のみで洗浄し、水及びアセトンですすぐべきである。

あらゆる夾雑を回避するため、使い捨ての実験室用消耗品の使用を強く勧める。

回収実験の場合、秤量後及び振とう前に適切な標準溶液を試料材料へ添加することによって試料を強化する。

陽イオン性樹脂の調製
１５．ＡＧ ５０Ｗ−Ｘ８樹脂約２５ｇを１０００ｍＬポリプロピレン瓶へ秤量する。

１６．水約５００ｍＬを添加する。

１７．回転式振とう器を使用して約１０分間振とうする。

１８．上清水を廃棄する。

１９．第２回目の工程２ないし４を実施する。

２０．第３回目の工程２ないし４を実施する。

２１．ポリプロピレン漏斗中に置き、水ですでにすすがれた２つのＧＦ／Ａフィルターを通じて残余水及び樹脂をろ過する。

備考：使用直前又は前もって樹脂を調製し、大気温で保存し、使用直前に再水和させる。

注意：樹脂が上述のように洗浄されていない場合、亜リン酸の干渉が観察され得る。

試料調製：
１．すでに洗浄したＡＧ ５０Ｗ−Ｘ８樹脂０．６ｇを、１２５ｍＬポリプロピレン瓶中に秤量する。

２．使い捨てパスツールピペットを使用して、均質な試料材料２０．０ｇを瓶の中に秤量する。

注意：試料の重量は、変数Ｗ_水として表される残留物算出に使用される。

３．回転式振とう器を使用して試料を１０分間振とうする。これは、抽出物Ａである。

注意：抽出物Ａの重量は、変数Ｗ_抽出物として表される残留物算出に使用される。この場合、抽出はなかった。溶媒を水試料へ添加しなかった。それは、ちょうど樹脂処理であるため、Ｗ_抽出物＝Ｗ_水＝２０ｇであった。

４．使い捨てガラスピペットを使用して、上清５ｍＬの一定分量を、すでに秤量した検査チューブへ転移させる。

注意：一定分量の容積は、変数Ｖ_一定分量として表される残留物算出に使用される。（５ｍＬを転移させる替わりに、５ｇ＝Ｗ_一定分量を秤量することによっても、この分取をなし得る。）
５．約６０℃の温度の試料濃縮器を使用して、窒素流の下で約０．５ｇまで蒸発させる。警告：乾燥状態になるまで蒸発させないこと。

６．使い捨てピペットを使用して、０．５％ギ酸で酸性化した水を使用して、１．０ｇにする。

注意：工程６において使用される酸性化した水中のギ酸の濃度は、決定的な因子である。これは、ＬＣにおいて得られるＨ _３ ＰＯ _３ ピーク形状に対して重要な作用を有する。酸性化された水中のギ酸の０．５％から２％への増加によって、非常に大きなＨ _３ ＰＯ _３ ピークが与えることが可能であり、したがって、感度を喪失させ得る。

７．約５分間超音波処理する。これは、最終抽出物である。

注意：残留物の算出のために最終抽出物の重量が使用され、変数Ｗ_終止として表される、
８．２．３章のＬＣ／ＭＳ／ＭＳ測定へ進む。

注意：較正曲線の外側の濃度であるために、最終抽出物を希釈することが必要である場合、マトリクスに合致させた標準物質が較正に使用されるので、対照試料の最終抽出物を使用する。

２．３ 分析及び機器条件
最終抽出物を高速液体クロマトグラフへ注入し、エレクトロスプレーイオン化を有するタンデム質量分析によって検出する。

マトリクスに合致させた標準物質を使用する外部標準化によって、定量化を実施する。

この方法確認の過程で使用された典型的なＬＣ／ＭＳ／ＭＳ条件を、２．３．１章及び２．３．２章に列挙する。これらの条件を指針として付与し、他のＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳシステムに適応しなければならないことがある。

２．３．１ ＨＰＬＣ条件
機器：二股ポンプＡｇｉｌｅｎｔ １１００
オートサンプラー：ＣＴＣ Ａｎａｌｙｔｉｃｓ ＨＴＣ ＰＡＬ
カラム：Ｈｙｐｅｒｃａｒｂ、１００×２．０ｍｍ、５μｍ
プレカラム：なし
注入容積：５０μＬ
カラム温度：大気温（約２５℃）
移動相：定組成モード：５５／４５（ｖ／ｖ）メタノール＋２％ギ酸／水＋２％ギ酸
流量（カラム）：２００μＬ／分
保持時間：亜リン酸の場合３．１ないし４．１分、ホセチル−Ａｌの場合３．９ないし５．３分
備考：
・濃縮した試料中の保持時間は、溶媒中よりもわずかに短い（地表水中で約０．２分、飲料水中で０．５分）。
・注入前にＨＰＬＣシステムの安定化に約２時間待機することが必要である。試料のセットの間に、両化合物の保持時間のわずかなドリフトを観察することができる。

・Ｈｙｐｅｒｃａｒｂプレカラムは、使用してはならない。

・Ｈｙｐｅｒｃａｒｂカラムの位相バッチに応じて、移動相中のギ酸の百分率は、（０．５％から２％まで）ピークの形状を改善するように適合することができる。

２．３．２ ＭＳ／ＭＳ条件
実施例３を参照されたい。

２．３．３ 確認のための遷移
実施例３を参照されたい。

注意：確証的な遷移を使用することによっても、すべての回収試料を分析した。

結果を補遺６に記載する。

２．４ 検出器の直線性
溶媒中の標準物質及びマトリクスに合致させた標準物質を使用して、ホセチル−Ａｌ及び亜リン酸に対して、使用される検出器の直線性を検査した。

０．２ないし２０μｇ／Ｌの濃度でホセチル−Ａｌ及び亜リン酸の標準物質を注入することによって、直線性を検査した。

２．５ 抽出物の保存安定性
ホセチル−Ａｌ及び亜リン酸を含有する試料抽出物の安定性は、本研究において決定されなかった。

２．６ 算出
２．６．１ 残留物の算出
この場合の評価は、マトリクスに合致させた標準物質を使用する外部標準化に従って実施する。

試料の各セットの分析中に、表１６に記載の９個の標準溶液を１回注入する。機器の反応における全てのわずかな変化も補正するように、試料の間に標準物質を配置すべきである。

各化合物に関して、最小二乗法を用いた、１／ｘの重み付けをした直線回帰によって得られる較正曲線を確立するために、濃度に対してピーク面積をプロットする。

Ａｎａｌｙｓｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（１．４版）を使用して、最終抽出物中の濃度を決定するための対応するモデルを算出する。

標準溶液に関して上述したものと同一の条件を使用して、各最終抽出物を１回注入する。

すでに確立された推定計算モデルを使用して、各化合物のμｇ／Ｌでの最終濃度を各注入に関して決定する。

各化合物に関して、ｍｇ／Ｌで表される残留物Ｒ_１の量を、次式を使用して算出する。

備考（＊）：
・すべての液体試料（水、抽出物）の密度は、室温に対して無関係に１に等しいと考えられる。これにより、液体試料の重量の容積への変換が可能となる。
・ホセチル−Ａｌ均等物中の亜リン酸を表すため、分子量の比を使用しなければならない。

なぜなら、１モルのホセチル−Ａｌ（３５４．１ｇ）は、亜リン酸３モルを付与するからである。

２．６．２ 回収率の算出
２．６．１に従って、回収試料に対して、μｇ／Ｌで表された各化合物の濃度を測定する。パーセント回収率は次式に従って計算される。

２．６．３ 相対的標準偏差（ＲＳＤ）の算出
ＲＳＤを次のとおり算出する。

３ 結果及び考察
３．１ 特異性及び選択性
本方法によって、飲料水及び地表水の試料中のホセチル−Ａ及びその代謝産物（亜リン酸）を測定することができる。

本方法の特異性は、非常に選択的なＭＳ／ＭＳ検出と組み合わせたＨＰＬＣ分離に由来するものであった。

３．２ 対照試料中の見かけの残留物
各試料材料に関して、２つの対照試料を分析した。使用される対照の出所を、表１７に列挙する。

地表水の幾つかの特徴を表１８に記録する。

これらの特徴は、以下によって決定した。

Ｃｅｍａｇｒｅｆ
Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｑｕａｌｉｔｅ ｄｅｓ ｅａｕｘ ｅｔ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｄｅｓ ｐｏｌｌｕｔｉｏｎｓ
Ｇｒｏｕｐｅｍｅｎｔ ｄｅ Ｌｙｏｎ
３ ｂｉｓ ｑｕａｉ Ｃｈａｕｖｅａｕ
６９３３６ Ｌｙｏｎ ｃｅｄｅｘ ０９ − Ｆｒａｎｃｅ
対照試料中の残留物レベルの概算を実施した。結果を表１９に列挙する。すべての対照試料について、見かけの残留物は、各化合物に関してＬＯＱの３０％を下回った。すなわち０．００００３ｍｇ／Ｌ未満であった。

３．３ 検出限界
０．００００５ｍｇ／Ｌで強化された対照試料を分析して、ホセチル−Ａｌ及び亜リン酸の検出限界を検査した。結果を表２０に示す。

３．４ 検出器の直線性及びマトリクス効果
溶媒中の標準物質及びマトリクスに合致させた標準物質を使用して、ホセチル−Ａｌ及び亜リン酸に関して、使用される検出器の直線性を検査した。

０．２ないし２０μｇ／Ｌの濃度でホセチル−Ａｌ及び亜リン酸の標準物質を注入することによって、直線性を検査した。

実験の詳細は、２．４章に見出され得る。

各クロマトグラムにおいて、式
ｙ＝ａｘ＋ｂ（１／ｘで重み付けする）
（式中、ｙ＝ピーク面積
ｘ＝注入された標準溶液中の濃度）
の形式の較正曲線を得るために、各標準溶液中に含有されるホセチル−Ａｌ又は亜リン酸の個々の対応する濃度に対して、ホセチル−Ａｌ又は亜リン酸の測定されたピーク面積をプロットする。

ＬＣ／ＭＳ／ＭＳに関する検出器反応の測定の結果を、表２１に要約する。

溶媒中に調製された標準物質又はマトリクスに合致させた標準物質のいずれかを使用して、両化合物ともに、０．２ないし２０μｇ／Ｌの範囲で標準物質に対して、分析物の注入された量とＬＣ／ＭＳ／ＭＳの検出器反応との間に優れた直線相関が観察された。

マトリクス効果の発生をモニターした。結果を表２２及び表２３に示す。

飲料水において、ホセチル−Ａｌの測定は、マトリクスに合致させた標準物質を使用して確立されなければならない。両試料材料において、亜リン酸に対して、純溶媒中の標準物質を用いて得られる結果は、欧州の必要条件に必ずしも従うとは限らない。そのため、飲料水及び地表水中の量化合物の測定は、マトリクスに合致させた標準物質を使用して確立される。

３．５ 定量化限界及び回収実験
定量化限界（ＬＯＱ）は、７０ないし１１０％の範囲内の平均回収及び２０％以下のＲＳＤが得られ得る場合の最低強化レベルとして定義した。飲料水及び地表水中の各化合物に関して、ＬＯＱを０．０００１ｍｇ／Ｌに設定した。

これらのマトリクスに対して本方法の妥当性を確認するため、分析前に、ホセチル−Ａｌ及び亜リン酸の定義された量で試料を強化した。

３．６ 回収率
得られた詳細な回収結果が、表２４及び表２５に列挙されている。

得られた回収率を、以下の表２６に要約する。合計２０の回収率を各化合物に対して測定した。単一の回収率は、ホセチル−Ａｌの場合７５ないし１１８％の範囲にあり、亜リン酸の場合７２ないし１１７％の範囲にあった。ホセチル−Ａｌの場合、強化レベルあたりの平均回収率は８９ないし９６％の範囲にあり、すべての試料材料にわたる全体的な回収率及び強化レベルは９３％であり、並びに、亜リン酸の場合、強化レベルあたりの平均回収率は９１ないし９３％の範囲にあり、すべての試料材料にわたる全体的な回収率及び強化レベルは９２％であった。

単一の強化レベルに対する相対的標準偏差（ＲＳＤ）は、ホセチル−Ａｌでは９．６ないし１４．３％、亜リン酸では８．８ないし１９．８％の範囲であった（ｎ＝１０）。試料材料あたりの全体的なＲＳＤ値は、ホセチル−Ａｌでは７．５ないし９．７％、亜リン酸では９．３ないし１２．４％であった（ｎ＝１０）。すべての試料にわたるＲＳＤ値は、ホセチル−Ａｌでは１２．７％、亜リン酸では１５．０％であった（ｎ＝２０）。

３．７ 抽出物の保存安定性
ホセチル−Ａｌ及び亜リン酸を含有する試料抽出物の安定性は、本研究では測定しなかった。

４．評価及び考察
飲料水及び地表水中のホセチル−Ａｌ及びその代謝産物（亜リン酸）の残留物のＬＣ／ＭＳ／ＭＳによる測定について、表記の残留物分析方法の改変００９３１／Ｍ００１の妥当性を確認した。

陽イオン性樹脂で試料材料を処理した後、濃縮する。Ｈｙｐｅｒｃａｒｂカラムを使用するＨＰＬＣによって、ホセチル−Ａｌ及びその代謝産物（亜リン酸）の残留物を定量化し、エレクトロスプレーイオン化を使用するタンデム質量分析によって検出する。マトリクスに合致させた標準物質中での外部標準化により、定量化を実施した。

確認のセットは、検出器の直線性の決定、定量化の限界及び方法の正確性を包含した。

溶媒中の標準物質及びマトリクスに合致させた標準物質を使用して、ホセチル−Ａｌ及び亜リン酸に関して、使用される検出器の直線性を検査した。

０．３１ないし８．３μｇ／Ｌ及び３．１ないし８３μｇ／Ｌのコムギ試料の場合を除き、０．１ないし５μｇ／Ｌ及び１ないし５０μｇ／Ｌの個々の濃度で、ホセチル−Ａｌ及び亜リン酸の標準物質を注入することによって、直線性を検査した。検出器の反応は、これらの範囲において直線的であった。

マトリクス効果の発生を観察した。

すべての試料材料において、亜リン酸の測定は、マトリクスに合致させた標準物質を使用して確立されなければならない。そのため、マトリクスに合致させた標準物質を使用して、両化合物の測定を確立する。

すべての対照試料の見かけの残留物は、各化合物について、ＬＯＱの３０％を下回っていた。すなわち、ホセチル−Ａｌの０．００３ｍｇ／ｋｇ未満及び亜リン酸の０．０３ｍｇ／ｋｇ未満であった。

定量化限界（ＬＯＱ）は、７０ないし１１０％の範囲内の平均回収及び２０％以下のＲＳＤが得られ得る場合の最低強化レベルとして定義した。ブドウ（全果実）、オレンジ（全果実）、レタス（頭部）、キュウリ（全果実）、アボカド（全果実）及びコムギ（穀粒）において、ホセチル−Ａｌの場合０．０１ｍｇ／ｋｇ、亜リン酸の場合０．１ｍｇ／ｋｇにＬＯＱを設定した。

方法の正確性は、測定された回収率に基づいて評価できる。単一の回収率は、ホセチル−Ａｌの場合６９ないし１１４％の、亜リン酸の場合６５ないし１１３％の範囲にあった。ホセチル−Ａｌの場合、強化レベルあたりの平均回収率は９３ないし９７％の範囲にあり、すべての試料材料にわたる全体的な回収率及び強化レベルは９５％であり、並びに、亜リン酸の場合、強化レベルあたりの平均回収率は８６ないし９７％の範囲にあり、すべての試料材料にわたる全体的な回収率及び強化レベルは９１％であった。方法の正確性は、各強化レベルに関する平均回収が７０ないし１１０％の範囲であるべきことを要求する残留物分析方法に関する要件を満たす。

方法の正確性及び再現性は、回収率の平均値に対して求められた相対的標準偏差（ＲＳＤ）に基づいて評価できる。

単一の強化レベルに関する相対的標準偏差（ＲＳＤ）は、ホセチル−Ａｌでは７．６ないし１２．３％、亜リン酸では９．５ないし１４．９％の範囲であった（ｎ＝３０）。

単一強化レベルに関する相対的標準偏差（ＲＳＤ）は、ホセチル−Ａｌでは７．６ないし１２．３％、亜リン酸では９．５ないし１４．９％の範囲であった（ｎ＝３０）。試料材料あたりの全体的なＲＳＤ値は、ホセチル−Ａｌでは２．１ないし１０．９％、亜リン酸では６．０ないし１７．８％であった（ｎ＝１０）。すべての試料にわたるＲＳＤ値は、ホセチル−Ａｌでは１０．２％、亜リン酸では１３．７％であった（ｎ＝６０）。すべてのＲＳＤ値は、２０％を十分に下回っていたため、方法の精度及び再現性は許容されると考えることができる。

方法の妥当性確認のすべての結果は、残留物分析方法に関する一般的な要件に従っているため、この方法の改変の妥当性は適切に確認されている。

注意：分析の間、設定された各試料に関し、試料調製に由来する亜リン酸の夾雑が見られない（３０％未満のＬＯＱ）ようにするため、水試料をミリＱ水によって置換するブランク試薬を調製することが必要である。

備考：
・標準的な実験室用ガラス製消耗品は、リン酸塩を含有しない界面活性剤のみで洗浄し、水及びアセトンですすぐべきである。いずれの夾雑も回避するため、使い捨ての実験室用消耗品の使用を強く勧める。

・確認／測定の開始の前に、機器／試薬は、亜リン酸のいずれの残留物に関しても検査すべきである。

・幾らかの夾雑が観察される場合、特殊なＨＰＬＣバイアル（例えば、ポリプロピレンバイアル、Ａｇｉｌｅｎｔ、ａｒｔ．５１８２−０５６７）の使用が、亜リン酸に対するバックグラウンドを低下させるのに役立ち得るかどうかを検証する。

異なるＬＣ条件の評価：
すべての回収試料は、異なるＬＣ条件を使用することによっても分析した。唯一の改変は、移動相であった。

完全な原法のＬＣ条件を、２．３．１に示す。

結果を表２７に示す。

「可」は、結果が、欧州の要件に従うことを意味する。

「不可」は、結果が、欧州の要件に従わないことを意味する。

「純溶媒中の標準物質」の列は、情報として付与されている。

マトリクスに合致させた標準物質を使用する場合、実施された様々な実験により、代替ＬＣ条件が使用すると、地表水については、ＬＯＱ及び１０ＬＯＱでのホセチル−Ａｌの場合にのみ、妥当性が確認できないことが示された。飲料水に関しては、問題が観察されなかった。

飲料水については、検査されるＬＣ条件とは無関係に、マトリクスに合致させた標準物質を使用した場合にのみ、ホセチル−Ａｌ及び亜リン酸に関して、０．１μｇ／Ｌ及びこの限界の１０倍で、欧州の要件（１９９６年７月１６日発令の９６／４６／ＥＣ）に従って、本方法の妥当性を適切に確認した。

地表水については、（特にホセチル−Ａｌの場合）検査されるＬＣ条件に応じて、マトリクスに合致させた標準物質を使用した場合にのみ、ホセチル−Ａｌ及び亜リン酸に関して、０．１μｇ／Ｌ及びこの限界の１０倍で、欧州の要件（１９９６年７月１６日発令の９６／４６／ＥＣ）に従って、本方法妥当性を適切に確認した。

５．変法
飲料水及び地表水に対して、変法の妥当性も確認した。濃縮工程の省略によって、主要な方法の試料調製が著しく簡素化され、濃縮工程の前に２．３．１及び２．３．２に付与されるＨＰＬＣ条件及び検出条件において、すべての回収試料を分析した。

変法の流れ図が、補遺８に記載されている。

結果の要約が表２８に示されており、得られた詳細な回収結果が補遺７に列挙されている。

「可」は、結果が、欧州の要件に従うことを意味する。

「不可」は、結果が、欧州の要件に従わないことを意味する。

「純溶媒中の標準物質」の列は、情報として付与されている。

備考：濃縮されていない水試料を定量化するため、標準溶液の濃度を適合させることが必要である。亜リン酸が、十分に高感度ではないため、この方法によって、０．１μｇ／Ｌの定量化限界での測定を行うことはできない。

マトリクスに合致させた標準物質を使用した場合には、検査されるＬＣ条件とは無関係に、濃縮されていない飲料水及び地表水について、ホセチル−Ａｌでは０．１μｇ／Ｌ及びこの限界の１０倍で、並びに亜リン酸では１μｇ／Ｌで、欧州要件（１９９６年７月１６日発令の９６／４６／ＥＣ）に従って、前記変法の妥当性を適切に確認した。

主要方法に関しては、試料の調製が大幅に簡略化され、時間を大幅に節約できる。

補遺５
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ条件に関する詳細
コメント：
同期化モード：ＬＣ同期化
自動平衡：オフ
獲得時間：１０分１秒
走査数：４５５
ファイル中の時間：１
獲得モジュール：獲得方法
ソフトウェアバージョン Ａｎａｌｙｓｔ１．４
ＭＳ方法特性：
第１期：
期間中の走査：４５５
相対的開始時間：０．００ミリ秒
期間中の実験：１
第１期 実験１：
走査型：ＭＲＭ（ＭＲＭ）
極性：負
走査モード：Ｎ／Ａ
イオン源：ターボスプレー
解像Ｑ１：ユニット
解像Ｑ３：ユニット
強度閾値：０．００ｃｐｓ
設定時間：０．００００ミリ秒
ＭＲポーズ：５．００７０ミリ秒
ＭＣＡ：なし
段階の大きさ：０．００ａｍｕ

パラメータの表（第１期 実験１）：
ＣＡＤ：６．００
ＣＵＲ：２０．００
ＧＳ１：４０．００
ＧＳ２：６０．００
ＴＥＭ：６００．００
ｉｈｅ：オン
ＩＳ：−４５００．００
ＥＰ：−１０．００
Ａｇｉｌｅｎｔ １１００ ＬＣポンプ方法特性：
ポンプモデル：Ａｇｉｌｅｎｔ １１００ ＬＣ二成分ポンプ
最小圧力（ｐｓｉ）：０．０
最大圧力（ｐｓｉ）：５８０１．０
死容積（μＬ）：４０．０
最大流量傾斜（ｍＬ／分 ^２ ）：１００．０
最大圧力傾斜（ｐｓｉ／秒）：２９０．０
工程表：
工程 総時間（分） 流速（μＬ／分） Ａ（％） Ｂ（％）
０ ０．００ ２００ ４５．０ ５５．０
１ １０．００ ２００ ４５．０ ５５．０
左側圧縮率：５０．０
右側圧縮率：１１５．０
左側死容積（μＬ）：４０．０
右側死容積（μＬ）：４０．０
左側拍出量（μＬ）：−１．０
右側拍出量（μＬ）：−１．０
左側溶媒：Ａ２（水＋２％ギ酸）
右側溶媒：Ｂ１（メタノール＋２％ギ酸）
ＣＴＣ ＰＡＬオートサンプラー方法特性：
ループ容積１（μＬ）：５０
ループ容積２（μＬ）：５０
注入容積（μＬ）：２００．０００
方法の記述：
シリンジ：２５０μＬ
Ａｎａｌｙｓｔ ＬＣ−Ｉｎｊ
空気体積（μＬ） ０
溶媒１による前洗浄 ２
溶媒２による前洗浄 １
試料による前洗浄 ０
充填速度（μＬ／秒） ５０
充填拍出量 ０
注入箇所 ＬＣ Ｖｌｖ１
注入速度（μＬ／秒） ５０
注入前遅延（ミリ秒） ５００
注入後遅延（ミリ秒） ５００
溶媒１による後洗浄 ３
溶媒２による後洗浄 ２
溶媒１によるバルブ洗浄 ２
溶媒２によるバルブ洗浄 １

この詳細な実施例は、土壌試料を使用するホセチル−Ａｌ及び亜リン酸の分析に関する。本実施例は、土壌中のホセチル−Ａｌ及びその代謝産物（亜リン酸）の残留物の決定のための分析方法００９７４への改変Ｍ００１である。

データ要件
・委員会指令９６／４６／ＥＣによって修正された欧州連合議会指令９１／４１４／ＥＥＣ
・指令９１／４１４、ＳＡＮＣＯ／３０２９／９９の補遺ＩＩ（Ａ部分、セクション４）及び補遺ＩＩＩ（パートＡ、セクション５）に対する予備登録データ要件を充足する分析方法を作製及び報告するための欧州委員会指針文書
・残留物分析方法、ＳＡＮＣＯ／８２５／００ ｒｅｖ．に関する欧州委員会指針文書
要約
土壌中のホセチル−Ａｌ及びその代謝産物（亜リン酸）の残留物の、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによる測定のために、表記の残留物分析方法の改変００９７４／Ｍ００１の妥当性を確認した
アンモニア緩衝溶液とともに振とうすることによって、ホセチル−Ａｌ及びその代謝産物（亜リン酸）の残留物を土壌試料から抽出する。次に、この抽出物を陽イオン性樹脂で処理し、ＬＣＭＳＭＳによる分析の前に、最終希釈を実施する。Ｈｙｐｅｒｃａｒｂカラムを使用するＨＰＬＣによって残留物を定量化し、エレクトロスプレーイオン化を使用するタンデム質量分析によって検出する。純溶媒中で調製される標準物質を使用する外部標準化によって、定量化を実施した。

確認のセットは、検出器の直線性の決定、定量化の限界及び方法の正確性を包含した。

溶媒中の標準物質及びマトリクスに合致させた標準物質を使用して、ホセチル−Ａｌ及び亜リン酸に関して、使用される検出器の直線性を検査した。

０．２５ないし２５μｇ／Ｌの濃度でホセチル−Ａｌ及び亜リン酸の標準物質を注入することによって、直線性を検査した。

マトリクス効果の発生を観察した。

結論は、
―ホセチル−Ａｌの測定が、溶媒中で調製される標準物質か、又はマトリクスに合致させた標準物質のいずれかを使用して確立されるとき、有意差は観察されず、
―マトリクスに合致させた標準物質の替わりに、溶媒中で調製される標準物質を使用して確立されるとき、亜リン酸の測定がより良好である（より高い平均回収及びより低いＲＳＤが見られる）
ことである。

これらすべての理由のため、溶媒中で調製された標準物質を使用すべきである。

すべての対照試料に対する見かけの残留物は、各化合物についてＬＯＱの２０％を下回っていた。すなわち、０．０１ｍｇ／ｋｇ未満であった。

定量化限界（ＬＯＱ）は、７０ないし１１０％の範囲内の平均回収及び２０％のＲＳＤを取得できる場合の最低強化レベルとして定義した。土壌試料中の各化合物に関して、ＬＯＱを０．０５０ｍｇ／ｋｇに設定した。

方法の正確性は、測定された回収率に基づいて評価できる。単一の回収率は、ホセチル−Ａｌの場合７０ないし８１％の、亜リン酸の場合８０ないし９８％の範囲にあった。すべての平均回収率は、７０ないし１１０％の範囲にあった。方法の正確性は、各強化レベルに対する平均回収が７０ないし１１０％の範囲にあるべきことを要求する残留物分析方法に関する要件を満たす。

方法の精度及び再現性は、回収率の平均値に対して求められた相対的標準偏差（ＲＳＤ）に基づいて評価できる。すべてのＲＳＤは、２０％を十分に下回った。したがって、方法の正確性及び再現性は、許容されると考えることができる。

方法の妥当性確認のすべての結果は、残留物分析方法に関する一般的な要件に従っているため、この方法の改変の妥当性は適切に確認されている。

１ 序論
ホセチル−Ａｌは、殺真菌剤である。

誘導体化の工程を省略し、分析及び検出モードを変化させ、並びにホセチル−Ａｌ及び亜リン酸の場合０．１００ｍｇ／ｋｇから０．０５０ｍｇ／ｋｇまで、原法００９７４の定量化限界（ＬＯＱ）を低下させるために、この報告に記載の方法改変００９７４／Ｍ００１の妥当性を確認した。

１．１ 原法の引用
原法：００９７４
化合物：ホセチル−Ａｌ及びその代謝産物（亜リン酸）
改変に関する理由：
・誘導体化の工程を省略する。

・ＧＣ／ＦＰＤからＬＣ／ＭＳ／ＭＳまで、分析及び検出モードを変化させる。

・ホセチル−Ａｌ及び亜リン酸に関して、ＬＯＱを０．１００ｍｇ／ｋｇから０．０５０ｍｇ／ｋｇへ低下させる。

１．２ 物理的及び化学的特性
実施例３を参照されたい。

２ 実験セクション
２．１．１ 装置
標準的な実験室用ガラス製消耗品は、リン酸塩を含有しない界面活性剤のみで洗浄し、水及びアセトンですすぐべきである。

いずれの夾雑も回避するため、使い捨ての実験室用消耗品の使用を強く勧める。

・平衡：
→正確性±０．１ｍｇ（分析用標準物質）（例えば、Ｍｅｔｔｌｅｒ ＡＴ２６１範囲）
→正確性±０．１ｇ（試料） （例えば、Ｍｅｔｔｌｅｒ ＰＭ２０００）
・希釈装置 （例えば、Ｈａｍｉｌｔｏｎ ＭｉｃｒｏＬａｂ １０００プラス）
・回転式振とう器 （例えば、Ｈｅｉｄｏｌｐｈ ＲＥＡＸ ２）
・遠心分離機 （例えば、Ｈｅｒｍｌｅ Ｚ５１３Ｋ）
（例えば、Ｈｅｔｔｉｃｈ ＥＢＡ１２）
・ＨＰＬＣ （例えば、二股ポンプＡｇｉｌｅｎｔ １１００）
・オートサンプラー （例えば、ＣＴＣ Ａｎａｌｙｔｉｃｓ ＨＴＣ ＰＡＬ）
・三重四極子ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ質量分析器（例えば、Ｓｃｉｅｘ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ， ＡＰＩ４０００システム）
・カラム （例えば、Ｈｙｐｅｒｃａｒｂ、１００×２．０ｍｍ、５μｍ）
３．１．２ 試薬及び支給品
・アセトン （例えば、Ｐｅｓｔｉｐｕｒ（登録商標）ＳＤＳ）
・メタノール （例えば、Ｐｅｓｔｉｐｕｒ（登録商標）ＳＤＳ）
・ギ酸 （例えば、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｒｅａｇｅｎｔ（登録商標）Ｍｅｒｃｋ）
・炭酸水素アンモニウム （例えば、Ｎｏｒｍａｐｕｒ（登録商標）Ｍｅｒｃｋ）
・３２％アンモニア溶液 （例えば、Ｒｅｃｔａｐｕｒ（登録商標）Ｍｅｒｃｋ）
・陽イオン性樹脂（ＡＧ ５０Ｗ−Ｘ８、２０ないし５０メッシュ、水素型）（例えば、Ｂｉｏ Ｒａｄ）
・ＧＦ／Ａフィルター（１２５ｍｍ） （例えば、Ｗｈａｔｍａｎ）
・ポリプロ瓶（１０００ｍＬ、広口） （例えば、Ｎａｌｇｅｎ）
・ポリプロ瓶（２５０ｍＬ、広口） （例えば、Ｎａｌｇｅｎ）
・ポリプロ瓶（１２５ｍＬ、広口） （例えば、Ｎａｌｇｅｎ）
・ポリプロ瓶（６０ｍＬ、広口） （例えば、Ｎａｌｇｅｎ）
・ポリプロ漏斗（６７ｍｍ） （例えば、Ｍａｒｙｌａｎｄｓ Ｐｌａｓｔｉｃｓ）
・コニカル遠心チューブ（１５ｍＬ） （例えば、Ｍｅｒｃｋ）
・希釈のための溶媒： ０．５％ＨＣＯＯＨを有する水
・移動相溶媒： ２％ＨＣＯＯＨを有する水
２％ＨＣＯＯＨを有するメタノール
・アンモニア緩衝溶液：１０００ｍＬメスフラスコ中に水５００ｍＬを注ぎ、炭酸水素アンモニウム２０ｇを添加し、完全に可溶化するまで撹拌器で混合する。３２％アンモニア溶液１５ｍＬを添加し、水で１０００ｍＬにする。

２．１．３ 基準品目
十分に特徴付けられ、保証された品目のみを基準品目として使用した。

基準品目は、Ｂａｙｅｒ ＣｒｏｐＳｃｉｅｎｃｅ ＧｍｂＨ ｐｒｏｄｕｋｔ Ａｎａｌｙｔｉｋ， Ｇ８６４， ｌｎｄｕｓｔｒｉｅｐａｒｋ Ｈｏｃｈｓｔ， Ｄ−６５９２６ Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ−ａｍ−Ｍａｉｎ， Ｇｅｒｍａｎｙによって市販された。

２．１．４ 標準溶液
原液及び標準溶液を約５℃の冷蔵庫で遮光保存した。

原液（１０００ｍｇ／Ｌ）
１００ｍＬの琥珀色のねじキャップ付きフラスコ中に、基準品目２０ないし５０ｍｇを正確に秤量する。ビューレットを使用して、水のある量を添加して、実際に１０００ｍｇ／Ｌの原液を得る。２つの個別の原液は、各化合物に関して調製されなければならない。これら２つの原液の比較後、それらを混合する。

混合溶液
「Ａ＋」クラスのピペットを使用して、各原液５ｍＬをピペットで採取する。「Ａ」クラスの５０ｍＬメスフラスコへ注ぐ。容積を水で調整し、キャップし、振とうによって混合する（各化合物の１００ｍｇ／Ｌ）２つの異なる混合溶液を調製する。

強化標準溶液
１０ＬＯＱレベル（各化合物の１００ｍｇ／Ｌ）での回収のための強化溶液としても使用される混合溶液のうちの一つの水中での希釈によって、ＬＯＱレベル（各化合物の１０ｍｇ／Ｌ）での回収に使用される強化標準溶液を調製する。

中間的な標準溶液
他の混合溶液の連続希釈によって、水を使用して、各化合物の１．０ｍｇ／Ｌでの中間的な標準溶液を調製する。

使用前に、ＬＯＱレベルでの回収に使用される中間的な溶液及び強化標準溶液を比較して、それらの調製を確認する。

較正に使用される溶媒中での標準溶液
較正に使用される標準溶液を得るため、希釈装置（又は異なる方法）及び０．５％ギ酸を有する水を使用して、中間的な標準溶液を即座に希釈し、次の濃度：０．２５、０．４、０．５、１、２．５、５、１０、及び２５μｇ／Ｌを得る。

マトリクスに合致させた標準溶液
マトリクス効果の発生をモニターし、両試料材料においてマトリクスに合致させた標準物質を使用して、両化合物の測定を確立する。

中間的な標準溶液から、対照試料の最終的な抽出物である希釈混合物を除き、希釈は、溶媒中の標準溶液の調製と同一である。

備考：
・最終抽出物２０ないし２５ｍＬが、すべての希釈をするのに必要である。

・Ｈ _３ ＰＯ _３ の幾らかの夾雑を持ち込み得る標準的な実験室用ガラス製消耗品の使用を回避するため、秤量することによって、対照試料抽出物Ｂの希釈を実施する。使い捨て可能なパスツールピペットを使用して、６０ｍＬポリプロピレン瓶へ抽出物３．０ｇを秤量する。別の使い捨て可能なパスツールピペットを使用して、０．５％ギ酸で酸性化した水で３０．０ｇにする。これは、マトリクスに合致させた標準溶液を調製するための希釈混合物として使用される対照試料の最終抽出物である。

２．１．５ 標準溶液の安定性
約５℃の冷蔵庫で遮光保存された原液は、９ヶ月半安定であることがわかった。

２．２ 残留物分析方法論
原法の分析方法と比較した幾つかの改変を導入した。

誘導体化の工程を省略し、分析及び検出モードを変化させ、及び各化合物の場合、０．１００ｍｇ／ｋｇから０．０５０ｍｇ／ｋｇまで、原法００９７４の定量化限界（ＬＯＱ）を低下させるために、この報告に記載の方法改変００９７４／Ｍ００１を確認した。

・ホセチル−Ａｌ及び亜リン酸の場合、定量化限界を０．１００ｍｇ／ｋｇから０．０５０ｍｇ／ｋｇまで低下させた。

・誘導体化工程を省略した。

・ＧＣ／ＦＰＤの替わりにＬＣ／ＭＳ／ＭＳによって、定量化を実施した。

すべての改変は、以下の記載に包含されている。

方法の流れ図は、補遺７に記載されている。

注意：分析の間、設定された各試料に関し、試料調製に由来する亜リン酸の夾雑が見られない（３０％未満のＬＯＱ）ようにするため、土壌試料を含まないブランク試薬を調製することが必要である。

備考：標準的な実験室用ガラス製消耗品は、リン酸塩を含有しない界面活性剤のみで洗浄し、水及びアセトンですすぐべきである。

いずれの夾雑も回避するため、使い捨ての実験室用消耗品の使用を強く勧める。

回収実験の場合、秤量後及び振とう前に適切な標準溶液を試料材料へ添加することによって試料を強化する。

陽イオン性樹脂の調製
１．ＡＧ ５０Ｗ−Ｘ８樹脂約２５ｇを１０００ｍＬポリプロピレン瓶に秤量する。

２．水約５００ｍＬを添加する。

３．回転式振とう器を使用して約１０分間振とうする。

４．上清水を廃棄する。

５．第２回目の工程２ないし４を実施する。

６．第３回目の工程２ないし４を実施する。

７．ポリプロピレン漏斗中に置き、水ですでにすすがれた２つのＧＦ／Ａフィルターを通じて残余水及び樹脂をろ過する。

備考：使用直前に又は事前に、樹脂を調製し、大気温で保存し、使用直前に再水和させる。

注意：樹脂が上述のように洗浄されていない場合、亜リン酸の干渉が観察され得る。

試料調製：
１．均質な試料材料２０．０ｇを１２５ｍＬポリプロピレン瓶に秤量する。

注意：変数重量_試料として、残留物算出のために試料の重量を使用する。

２．アンモニア緩衝溶液３０ｍＬを添加する。

３．回転式振とう器を使用して、大気温で３０分間試料を振とうする。

４．抽出物を約５分間遠心分離する（３６００ｒｐｍ、５℃）。

５．０．５％ギ酸で酸性化された水約１００ｇを、すでに秤量した２５０ｍＬポリプロピレン瓶へ注ぐ。

６．上清を２５０ｍＬポリプロピレン瓶へ添加する。

７．アンモニア緩衝溶液３０ｍＬを底へ添加する。

８．回転式振とう器を使用して、試料を３０分間振とうする。

９．抽出物を約５分間遠心分離する（３６００ｒｐｍ、５℃）。

１０．上清を２５０ｍＬポリプロピレン瓶へ注ぐ。

１１．使い捨て可能なパスツールピペットを使用して、０．５％ギ酸で酸性化した水を使用して、２００ｇにする。これは、抽出物Ａである（情報として、ｐＨは、約６．５である。）。

注意：変数重量_抽出物Ａとして、残留物算出のために試料の重量を使用する。

１２．すでに洗浄したＡＧ ５０Ｗ−Ｘ８樹脂３．０ｇを、コニカル遠心チューブに秤量する。

１３．使い捨て可能なガラスピペットを使用して、抽出物Ａ５ｍＬの一定分量を、遠心チューブへ転移させる。

１４．回転式振とう器を使用して、試料を１０分間振とうする。

１５．試料を約５分間遠心分離する（６０００ｒｐｍ、５℃）。得られた上清は、抽出物Ｂに相当する（情報に関して、ｐＨは、約２．５である。）。

注意：樹脂処理のこの工程は、狭いＨ _３ ＰＯ _３ ピーク形状を得るのに必要である。

１６．希釈装置を使用して（又は異なる方法で）、０．５％ギ酸で酸性化された水を使用して抽出物Ｂを１０倍希釈する。これは、最終抽出物である（情報として、ｐＨは、約２．５である。）。

１７．３．３章のＬＣ／ＭＳ／ＭＳ測定へ進む。

１８．較正曲線の外側の濃度であるために、最終抽出物を希釈することが必要である場合、０．５％ギ酸で酸性化された水を使用する。

２．３ 分析及び機器条件
最終抽出物を高速液体クロマトグラフへ注入し、エレクトロスプレーイオン化を有するタンデム質量分析によって検出する。

溶媒中で調製される標準物質を使用する外部標準化によって、定量化を実施する。この方法確認の過程で使用された典型的なＬＣ／ＭＳ／ＭＳ条件は、３．３．１章及び３．３．２章に列挙されている。これらの条件を指針として付与し、他のＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳシステムに適応しなければならないことがある。

２．３．１ ＨＰＬＣ条件
機器：二股ポンプＡｇｉｌｅｎｔ １１００
オートサンプラー：ＣＴＣ Ａｎａｌｙｔｉｃｓ ＨＴＣ ＰＡＬ
カラム：Ｈｙｐｅｒｃａｒｂ、１００×２．０ｍｍ、５μｍ
プレカラム：なし
注入容積：５０μＬ
カラム温度：大気温（約２５℃）
移動相：定組成モード：５５：４５（ｖ／ｖ）メタノール＋２％ギ酸／水＋２％ギ酸
流量（カラム）：２００μＬ／分
保持時間：亜リン酸の場合約３．１分、ホセチル−Ａｌの場合４．２分
備考：
・注入前にＨＰＬＣシステムの安定化に約２時間待機することが必要である。試料のセットの間に、両化合物の保持時間のわずかなドリフトを観察できる。

・Ｈｙｐｅｒｃａｒｂプレカラムは、使用してはならない。

・Ｈｙｐｅｒｃａｒｂカラムの位相バッチに応じて、ピーク形状を改善するために、移動相中のギ酸の百分率を（０．５％から２％まで）適合させることが可能である。

・対照的に、注入溶媒中のＨＣＯＯＨ割合を増大させないこと。注入溶媒として、０．５％ギ酸の水を使用することが、狭いＨ _３ ＰＯ _３ ピーク形状を保持するために必要である。

２．３．２ ＭＳ／ＭＳ条件
ＭＲＭ（複合反応観察）条件下、負のイオンモードで作動するエレクトロスプレー界面の装備された三重四極子質量分析システムにおいて、実験を実施した。

例えば：
検出器：三重四極子ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ質量分析器、
例えば、Ｓｃｉｅｘ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ＡＰＩ４０００システム
ソース：ＴＩＳ（ターボイオンスプレー）
温度：６５０℃
走査型：ＭＲＭモード（多重反応観察モード）
極性：負のイオンモード
ガス流量：噴霧ガス気体（ＧＳ１）：４０
ターボガス気体（ＧＳ２）：６０
カーテンガスＮ_２（ＣＵＲ）：１５
衝突ガスＮ_２（ＣＡＤ）：６
衝突エネルギー：

注意：幾つかの質量分析器条件は、機器特異的である。質量分析器条件は、分析前に適格な操作者によって最適化されるべきである。

ＭＳ／ＭＳ条件及びＬＣ条件に関する詳細は、補遺８に記載されている。

ホセチル−Ａｌ及び亜リン酸の場合の定量化イオンに関する断片化経路を、図１及び図２に示す。

２．３．３ 確認のための遷移
試料中の幾らかの干渉又は汚染を確認又は排除するため、上述の同一の条件において、次の移行を使用できる。

ホセチル−Ａｌ及び亜リン酸の場合の確証的な移行に関する断片化経路を、図３及び図４に示す。

注意：確認のための遷移を使用することによっても、すべての回収試料を分析した。結果を補遺９に付与する。

２．４ 検出器の直線性
溶媒中の標準物質及びマトリクスに合致させた標準物質を使用して、ホセチル−Ａｌ及び亜リン酸に関して、使用される検出器の直線性を検査した。

０．２５ないし２５μｇ／Ｌの濃度でホセチル−Ａｌ及び亜リン酸の標準物質を注入することによって、直線性を検査した。

２．５ 抽出物の保存安定性
ホセチル−Ａｌ及び亜リン酸を含有する試料抽出物の安定性は、本研究において測定されなかった。

２．６ 算出
２．６．１ 残留物の算出
この場合の評価は、溶媒中で調製される標準物質を使用する外部標準化に従って実施する。試料の各セットの分析中に、表４に記載の８個の標準溶液を１回注入する。標準物質は、機器の反応におけるわずかな変化も補正するために、試料の間に標準物質を配置すべきである。各化合物に関して、最小二乗法用いた、１／ｘの重み付けをした直線回帰によって得られる較正曲線を確立するために、濃度に対してピーク面積をプロットする。Ａｎａｌｙｓｔ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（１．４版）を使用して、最終抽出物中の濃度を決定するための相応のモデルを算出する。標準溶液に関して上述したものと同一の条件を使用して、各最終抽出物を１回注入する。すでに確立された推定計算モデルを使用して、各化合物のμｇ／Ｌでの最終濃度を各注入に関して測定する。各化合物について、次式を使用して、ｍｇ／ｋｇで表される残留物Ｒの量を算出する。

備考：
・試料調製中に使用されるすべての溶液（アンモニア緩衝溶液及び０．５％ＨＣＯＯＨを有するＨ _２ Ｏ）の密度は、室温とは無関係に１に等しいと考えられる。これにより、抽出物の重量を抽出容積に変換することが可能である。

・ホセチル−Ａｌ均等物中の亜リン酸を表すことを要する場合、分子量の比を使用しなければならない。

なぜなら、１モルのホセチル−Ａｌ（３５４．１ｇ）が、亜リン酸３モルを与えるからである。

２．６．２ 回収率の算出
２．６．１に従い、回収試料について、μｇ／Ｌで表した各化合物の濃度を測定する。

次に、回収率の百分率を次のとおり算出する。

２．６．３ 相対的標準偏差（ＲＳＤ）の算出
ＲＳＤを次のとおり算出する。

ＲＳＤ（％）＝標準偏差／平均回収×１００％

３ 結果及び考察
３．１ 特異性及び選択性
本方法によって、土壌試料中のホセチル−Ａ及びその代謝産物（亜リン酸）を測定できる。本方法の特異性は、非常に選択的なＭＳ／ＭＳ検出と組み合わせたＨＰＬＣ分離に起因した。

３．２ 対照試料中の見かけの残留物
２つのドイツの土壌ホッフェン（Ｈｏｆｃｈｅｎ）及びラーヘルホフ（Ｌａａｃｈｅｒ Ｈｏｆ）を使用して、本方法の妥当性確認した。異なる土壌の特徴の起こり得る影響を評価するために、２つの異なる土壌を使用した。ＤＩＮ及び／又はＵＳＤＡ仕様に従って、土壌試料を分類した。使用される土壌の土壌特性を、表３３に要約する。

土壌の完全な特徴付けは、補遺１０に報告されている。

対照試料中の残留物レベルの評価を行った。結果は、表３４に列挙されている。すべての対照試料に関する見かけの残留物は、各化合物に関してＬＯＱの２０％を下回っていた。すなわち０．０１ｍｇ／ｋｇ未満であった。

３．３ 検出器の直線性及びマトリクス効果
溶媒中の標準物質及びマトリクスに合致させた標準物質を使用して、ホセチル−Ａｌ及び亜リン酸に関して、使用される検出器の直線性を検査した。

０．２５ないし２５μｇ／Ｌの濃度でホセチル−Ａｌ及び亜リン酸の標準物質を注入することによって、直線性を検査した。

実験の詳細は、２．４章に見出され得る。

各クロマトグラムにおいて、式
ｙ＝ａｘ＋ｂ（１／ｘで重み付けする）
（式中、ｙ＝ピーク面積
ｘ＝注入された標準物質溶液中の濃度）
の形式の較正曲線を得るために、各標準溶液中に含有されるホセチル−Ａｌ又は亜リン酸の対応する濃度に対して、ホセチル−Ａｌ又は亜リン酸の測定されたピーク面積をプロットする。

ＬＣ／ＭＳ／ＭＳに対する検出器の応答の測定結果が、表３５に要約されている。

溶媒中で調製された標準物質又はマトリクスに合致させた標準物質のいずれかを使用した場合、両化合物ともに、０．２５ないし２５μｇ／Ｌの範囲の標準物質に対して、分析物の注入された量とＬＣ／ＭＳ／ＭＳの検出器反応との間に優れた直線相関が観察された。

マトリクス効果の発生を観察した。

結果を表３６及び表３７に示す。

上述の２つの表３６及び表３７に示されている結果は、以下のことを示す。

―溶媒中で調製される標準物質又はマトリクスに合致させた標準物質のいずれかを使用して、ホセチル−Ａｌの測定を確立する場合、有意差は観察されず、
―マトリクスに合致させた標準物質を使用する替わりに、溶媒中に調製された標準物質を使用して確立する場合、亜リン酸の測定がより良好である（より高い平均回収及びより低いＲＳＤが見られる。）。

これらの理由すべてのために、本発明者らは、溶媒中に調製される標準物質を使用することを勧める。

３．４ 定量化限界及び回収実験
定量化限界（ＬＯＱ）は、７０ないし１１０％の範囲内の平均回収及び□２０％のＲＳＤが得られ得る場合の最低強化レベルとして定義した。土壌試料中の各化合物に対して、ＬＯＱを０．０５０ｍｇ／ｋｇに設定した。

これらのマトリクスに関する方法を確認するため、分析前に、ホセチル−Ａｌ及び亜リン酸の定義された量で対照試料を強化した。

３．５ 回収率
得られた詳細な回収結果を、表３８及び表３９に列挙する。

溶媒中で調製される標準物質及び定量化イオン（３．３．２参照）を使用することによって、表３８及び３９に記載されているすべての結果が得られた。確認のための遷移で得られた結果を補遺９に付与する。

得られた回収率が、以下の表４０に要約されている。

各化合物に対して、計２０の回収率を測定した。

上述の表は、以下のことを示す。

単一の回収率は、ホセチル−Ａｌの場合７０ないし８１％の、亜リン酸の場合８０ないし９８％の範囲にあった。すべての平均回収率は、７０ないし１１０％の範囲にあった。すべてのＲＳＤは、２０％を十分に下回った。

４ 評価及び考察
土壌中のホセチル−Ａｌ及びその代謝産物（亜リン酸）の残留物の、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳによる測定のために、表記の残留物分析方法の改変００９７４／Ｍ００１の妥当性を確認した。

アンモニア緩衝溶液とともに振とうすることによって、ホセチル−Ａｌ及びその代謝産物（亜リン酸）の残留物を土壌試料から抽出する。次に、この抽出物を陽イオン性樹脂で処理し、ＬＣＭＳＭＳによる分析の前に、最終希釈を実施する。Ｈｙｐｅｒｃａｒｂカラムを使用するＨＰＬＣによって残留物を定量化し、エレクトロスプレーイオン化を使用するタンデム質量分析によって検出する。純溶媒中で調製される標準物質を使用する外部標準化によって、定量化を実施した。

確認のセットは、検出器の直線性の決定、定量化の限界及び方法の正確性を包含した。

溶媒中の標準物質及びマトリクスに合致させた標準物質を使用して、ホセチル−Ａｌ及び亜リン酸に関して、使用される検出器の直線性を検査した。

０．２５ないし２５μｇ／Ｌの濃度でホセチル−Ａｌ及び亜リン酸の標準物質を注入することによって、直線性を検査した。検出器の反応は、これらの範囲において直線的であった。

マトリクス効果の発生を観察した。

―ホセチル−Ａｌが、溶媒中で調製される標準物質又はマトリクスに合致させた標準物質のいずれかを使用して確立されるとき、有意差は観察されず、
―マトリクスに合致させた標準物質を使用する替わりに、溶媒中で調製される標準物質を使用して確立するとき、亜リン酸の測定がより良好である（より高い平均回収及びより低いＲＳＤが見られる。）。

これらの理由すべてのために、本発明者らは、溶媒中に調製される標準物質を使用することを勧める。

すべての対照試料に関する見かけの残留物は、各化合物についてＬＯＱの２０％を下回っていた。すなわち０．０１ｍｇ／ｋｇ未満であった。

定量化限界（ＬＯＱ）は、７０ないし１１０％の範囲内の平均回収及び□２０％のＲＳＤが得られ得る場合の最低強化レベルとして定義した。土壌試料中の各化合物に関して、ＬＯＱを０．０５０ｍｇ／ｋｇに設定した。

方法の正確性は、測定された回収率に基づいて査定できる。単一回収率は、ホセチル−Ａｌの場合７０ないし８１％の、亜リン酸の場合８０ないし９８％の範囲にあった。すべての平均回収率は、７０ないし１１０％の範囲にあった。方法の正確性は、各強化レベルに関する平均回収が７０ないし１１０％の範囲にあるべきことを要求する残留物分析方法に関する要件を満たす。

方法の精度及び再現性は、回収率の平均値に対して求められた相対的標準偏差（ＲＳＤ）に基づいて評価できる。すべてのＲＳＤは、２０％を十分に下回った。したがって、方法の正確性及び再現性は、許容されると考えることができる。

方法の妥当性確認のすべての結果は、残留物分析方法に関する一般的な要件に従っているため、この方法の改変の妥当性は適切に確認されている。

注意：分析の間、設定された各試料に関し、試料調製に由来する亜リン酸の夾雑が見られないこと（３０％未満のＬＯＱ）ようにするため、土壌試料を含まないブランク試薬を調製することが必要である。

備考：
標準的な実験室用ガラス製消耗品は、リン酸塩を含有しない界面活性剤のみで洗浄し、水及びアセトンですすぐべきである。

あらゆる夾雑を回避するため、使い捨ての実験室用消耗品の使用を強く勧める。

確認／測定の開始の前に、機器／試薬は、亜リン酸のあらゆる残留物について検査すべきである。

幾らかの夾雑が観察される場合、特殊なＨＰＬＣバイアル（例えば、ポリプロピレンバイアル、Ａｇｉｌｅｎｔ、ａｒｔ．５１８２−０５６７）の使用が、亜リン酸に対するバックグラウンドを低下させるのに役立ち得るかどうかを検証する。

補遺８ ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ条件に関する詳細
コメント：
同期化モード：ＬＣ同期化
自動平衡化：オフ
獲得時間：１０分１秒
走査数：４５５
ファイル中の時間：１
獲得モジュール：獲得方法
ソフトウェアバージョン Ａｎａｌｙｓｔ１．４
ＭＳ方法特性：
第１期：
期間中の走査：４５５
相対的な開始時間：０．００ミリ秒
期間中の実験：１
第１期 実験１：
走査型：ＭＲＭ（ＭＲＭ）
極性：負
走査モード：Ｎ／Ａ
イオン源：ターボスプレー
解像Ｑ１：ユニット
解像Ｑ３：ユニット
強度閾値：０．００ｃｐｓ
設定時間：０．００００ミリ秒
ＭＲポーズ：５．００７０ミリ秒
ＭＣＡ：なし
段階の大きさ：０．００ａｍｕ

パラメータの表（第１期 実験１）：
ＣＡＤ：６．００
ＣＵＲ：１５．００
ＧＳ１：４０．００
ＧＳ２：６０．００
ＴＥＭ：６５０．００
ｉｈｅ：オン
ＩＳ：−４５００．００
ＥＰ −１０．００
Ａｇｉｌｅｎｔ １１００ ＬＣポンプ方法の特性：
ポンプモデル：Ａｇｉｌｅｎｔ １１００ ＬＣ二股ポンプ
最小圧力（ｐｓｉ）：０．０
最大圧力（ｐｓｉ）：５８０１．０
死容積（μＬ）：４０．０
最大流量傾斜（ｍＬ／分 ^２ ）：１００．０
最大圧力傾斜（ｐｓｉ／秒）：２９０．０
段階表：
段階 総時間（分） 流速（μＬ／分） Ａ（％） Ｂ（％）
０ ０．００ ２００ ５５．０ ４５．０
１ １０．００ ２００ ５５．０ ４５．０
左側圧縮率：５０．０
右側圧縮率：１１５．０
左側死容積（μＬ）：４０．０
右側死容積（μＬ）：４０．０
左側拍出量（μＬ）：−１．０
右側拍出量（μＬ）：−１．０
左側溶媒：Ａ１（メタノール＋２％ギ酸）
右側溶媒：Ｂ２（水＋２％ギ酸）
ＣＴＣ ＰＡＬオートサンプラー方法特性：
ループ容積１（μＬ）：５０
ループ容積２（μＬ）：１００
注入容積（μＬ）：１００．０００
方法の記述：
シリンジ：２５０μＬ
Ａｎａｌｙｓｔ ＬＣ−Ｉｎｊ
空気体積（μＬ） ０
溶媒１による前洗浄 ２
溶媒２による前洗浄 １
試料による前洗浄 ０
充填速度（μＬ／秒） ５０
充填拍出 ０
注入箇所 ＬＣ Ｖｌｖ１
注入速度（μＬ／秒） ５０
注入前遅延（ミリ秒） ５００
注入後遅延（ミリ秒） ５００
溶媒１による後洗浄 ３
溶媒２による後洗浄 ２
溶媒１によるバルブ洗浄 ２
溶媒２によるバルブ洗浄 １

確認のための遷移とともに上述で得られたすべての結果は、欧州要件に従う。

Claims (13)

1. 以下の工程：
   −試料の調製、
   −試料の、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）／タンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）による直接的な分析
   を含む、試料の０．００００５ｍｇ／ｋｇ以下の量で存在する亜リン酸及びホセチル−Ａｌを直接同時分析するための方法。
2. 試料が、植物組織、水、土壌、動物生成物又は組織、空気、食用農作物、及びヒトの体液から選択される、請求項１に記載の方法。
3. 試料が、高い水分含有量の植物マトリクス、酸性ｐＨを有する植物マトリクス、乾燥植物マトリクス、脂肪性植物マトリクス、鉱水、地下水、水道水又は地表水、乳、卵、肝臓、腎臓、脂肪、筋肉、変換された食用農作物、及びヒトの体液から選択される、請求項１又は２に記載の方法。
4. 調製が、植物組織、土壌、動物生成物又は組織、及び変換された食用農作物からの抽出、水からの濃縮、並びに空気からの捕捉から選択される、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
5. 調製された試料の希釈の工程を含む、請求項１ないし４のいずれか１項に記載の方法。
6. 希釈が、酸性化され得る水溶性溶媒中で、又は酸性化され得る有機溶媒中で、又はこのような溶媒の混合物中で実施される、請求項１ないし５のいずれか１項に記載の方法。
7. 水溶性溶媒が、ギ酸、酢酸若しくはトリフルオロ酢酸から選択される酸を含むか、又は有機溶媒が、アセトニトリル若しくはメタノールから選択される、請求項６に記載の方法。
8. 高速液体クロマトグラフィーが、２％までのギ酸を含む水（４５％〜６５％(体積／体積)）及びメタノール（３５％〜５５％（体積／体積））からなる移動相を用いて行われ、前記移動相が、イソクラティックモードで用いられる、請求項１ないし７のいずれか１項に記載の方法。
9. 試料が植物組織から選択されるものであり、移動相が０．５％のギ酸を含む水（６５％(体積／体積)）及びメタノール（３５％（体積／体積））から構成されるものである、請求項７に記載の方法。
10. 試料が水又は土壌から選択されるものであり、移動相が２％のギ酸を含む水（４５％(体積／体積)）及び２％のギ酸を含むメタノール（５５％（体積／体積））から構成されるものである、請求項７に記載の方法。
11. 亜リン酸の定量化限界が０．１ｍｇ／ｋｇであり、ホセチル−Ａｌの定量化限界が０．０１ｍｇ／ｋｇである、亜リン酸及びホセチル−Ａｌの直接同時分析のための請求項９に記載の方法。
12. 水試料の場合、亜リン酸の定量化限界が０．０００１ｍｇ／Ｌであり、ホセチル−Ａｌの定量化限界が０．０００１ｍｇ／Ｌである、亜リン酸及びホセチル−Ａｌの直接同時分析のための請求項１０に記載の方法。
13. 土壌試料の場合、亜リン酸の定量化限界が０．０５ｍｇ／ｋｇであり、ホセチル−Ａｌの定量化限界が０．０５ｍｇ／ｋｇである、亜リン酸及びホセチル−Ａｌの直接同時分析のための請求項１０に記載の方法。