KR101276987B1 - 아인산, 포세틸-ａｌ 또는 두 가지 모두의 동시적 분석방법 - Google Patents
아인산, 포세틸-ａｌ 또는 두 가지 모두의 동시적 분석방법 Download PDFInfo
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Abstract
하기 단계를 포함하는, 시료 내에 5 ㎎/㎏ 미만 또는 이와 동일한 양으로 존재하는 하나 이상의 살충 화합물의 분석 방법:
a) 시료의 제조;
b) 제조된 시료의 임의 희석;
c) 임의 희석된 시료의 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)/탄뎀 질량 분석기 (MS/MS) 에 의한 직접 분석.
Description
본 발명은 살충 화합물 분석 분야에 관한 것이다. 이 방법은 상기 살충 화합물을 일단 적용한 후 이들의 거동을 모니터링하는데 유용하며, 이 방법은 또한 상기 살충 화합물에 대한 마케팅 승인 절차 중에 유용하다.
본 발명에 따른 분석 방법을 통해 분석될 수 있는 화합물은 식물의 보호에 유용한 화합물 및 또한 이들 생물학적 활성 화합물의 대사물인 화합물의 일부이다. 이들 대사물 중 일부가 또한 생물학적 활성을 나타낼 수 있다.
살충 화합물의 분석 방법은 공지되어 있다. 특히, 음용수 또는 지표수 내 포세틸-Al 잔류물 및 이의 주요 대사물, 아인산을 측정하기 위한 분석 방법이 알려져 있다.
이러한 알려진 방법은 (트리메틸실릴)디아조메탄 (TMSD) 을 유도체화제로서 사용한다.
일반적으로, 이러한 방법은 하기 단계를 포함한다:
- 물 시료의 농축;
- (트리메틸실릴)디아조메탄을 이용한, 농축 시료 분취량의 유도체화 (메틸 기와 수소 원자의 치환);
- 디클로로메탄을 이용한 액체-액체 분획에 의한 유도체화된 시료의 정제.
분석은 인 (phosphorous) 모드의 불꽃 광도 검출기 (또는 FPD) 를 통해 반-모세관 컬럼 상의 기체 크로마토그래피에 의해 수행하고, 외부 표준을 참고로 하여 정량화한다. 열이온 검출기의 이용 또한 가능하다.
이 공지된 방법은 하기의 반응식 1 에 따라 수행된다:
이 방법에서, 검출 한계 (LOD) 는 다음과 같다:
- 포세틸-Al 의 경우:
- 음용수 (광천수 또는 수돗물 (mains water)) 에 대하여 0.05 ㎍/ℓ;
- 지표수 (강물) 에 대하여 0.05 ㎍/ℓ;
- 아인산의 경우:
- 음용수 (광천수 또는 수돗물) 에 대하여 0.7 ㎍/ℓ;
- 지표수 (강물) 에 대하여 2.5 ㎍/ℓ.
이러한 방법에서, 정량화 한계 (LOQ) 는 다음과 같다:
- 포세틸-Al 의 경우:
- 음용수 (광천수 또는 수돗물) 에 대하여 0.1 ㎍/ℓ;
- 지표수 (강물) 에 대하여 1 ㎍/ℓ;
- 아인산의 경우:
- 음용수 (광천수 또는 수돗물) 에 대하여 2.0 g/ℓ;
- 지표수 (강물) 에 대하여 4.0 g/ℓ.
분석의 이러한 공지된 방법이 다음의 기질 (substrate): 광천수, 수돗물 및 론느강 (Rhone river) 으로부터의 물에 대하여 이용되어 왔다. 상기 분석 방법을 통해 포세틸-Al 및 아인산이 정량화 한계 내지 이들 한계의 10 배까지 풍부화된 비처리 대조군 시료를 분석함으로써 다양한 유형의 물에 대한 상기 방법의 유효성을 검증하였다.
이들 풍부화된 시료를 분석하여 포세틸-Al 또는 아인산에 대한 회수율 값을 수득하고, 이를 기대되는 이론값과 비교한다.
분석의 또다른 공지된 방법으로서, Chazay d'Azergues (프랑스), Goch (독일) 및 Seville (스페인) 에서 취해진 토양 내에 존재하는 포세틸-Al 또는 아인산 잔류물에 대한 분석 방법을 언급할 수 있다.
이 방법 자체도 (트리메틸실릴)디아조메탄을 사용한다. 이것 또한 반응 식 1 에 따라 수행된다.
이 방법의 과정에서 포세틸-Al 및 아인산 잔류물이 암모니아 완충액의 존재 하에서 휘저음에 의해 토양 시료로부터 추출되고, 이후, 존재하는 양이온이 이온 교체 수지를 통해 추출물로부터 제거되고, 물이 시료로부터 증발된다. 최종적으로, 수득된 추출물이 (트리메틸실릴)디아조메탄의 작용에 의해 유도체화된다.
이후, 외부 표준을 갖고서, 불꽃 광도 검출기 (인 모드) 를 이용하는 반-모세관 컬럼 상에서의 기체 크로마토그래피에 의해 정량화를 수행한다.
이 방법의 정량화 한계 (LOQ) 는 화합물의 각각에 대하여 0.100 ㎎/㎏ 이다.
대조군 시료에는 포세틸-Al 또는 아인산이 정량화 한계까지 및 또한 이 한계의 100 배까지 풍부화되었다.
잔류물 분석의 또다른 공지된 방법은 과일 및 채소의 둘 모두로부터 유래되는 식물 시료 내의 포세틸-Al 및 아인산 잔류물의 분석에 관한 것이다.
이 방법 자체도 (트리메틸실릴)디아조메탄을 사용한다. 이것 또한 반응식 1 에 따라 수행된다.
이 방법의 과정에서, 포세틸-Al 및 아인산 잔류물은 물 및 아세토니트릴의 혼합물 내에서의 분쇄 (milling) 에 의해 식물 시료로부터 추출된다. 이후, 추출물을 C18 카트리지를 이용해 정제한 후, (트리메틸실릴)디아조메탄의 작용에 의해 유도체화한다.
이후, 외부 표준을 갖고서, 불꽃 광도 검출기 (인 모드) 를 이용하는 반-모세관 컬럼 상에서의 기체 크로마토그래피에 의해 정량화를 수행한다.
이 공지된 방법의 정량화 한계는 생성물의 각각에 대하여 0.50 ㎎/㎏ 이며, 단 호프 (hop) 의 경우는 예외로서, 여기서 포세틸-Al 에 대한 상기 한계는 2.0 ㎎/㎏ 이고, 아인산에 대하여는 20.0 ㎎/㎏ 이다.
이 방법은 포도 송이, 오렌지, 바나나, 딸기, 상추 및 오이의 시료에 대하여 사용되어 왔다. 대조군 시료는 특히 정량화 한계까지로 풍부화되었다.
잔류물 분석의 또다른 공지된 방법은 동물 조직 또는 동물 기원의 제품, 예컨대 우유, 소고기, 소 신장, 소 간 또는 달걀 내의 포세틸-Al 또는 아인산 잔류물의 분석에 관한 것이다.
이 연구에 따르면, 분석할 화합물의 잔류물이 물/아세토니트릴 혼합물 (우유의 경우, 50/50, 20/80) 내에서의 이중 분쇄에 의해 시료로부터 추출된다.
이후, 추출물의 분취량을 C18 카트리지 (우유의 경우는 예외) 를 통해 정제한다. 이후, 정제된 추출물을, TMSD 의 용액을 이용해 유도체화한다.
이 분석 방법 또한 반응식 1 을 따른다.
정량화는, 인 모드의 불꽃 광도 검출기를 이용하여 DB Wax 컬럼 상의 기체 크로마토그래피에 의해 수행한다.
정량화 한계는 다음과 같다:
- 소 고기, 소 신장, 소 간 및 달걀 내 포세틸-Al 및 아인산에 대하여 0.50 ㎎/㎏;
- 우유 내 포세틸-Al 및 아인산에 대하여 0.10 ㎎/㎏.
이 방법에서, 비처리 대조군 시료는, 정량화 한계 내지 이 한계의 몇 배로 풍부화된 시료와 함께 제조 및 분석했다.
방금 언급한 공지된 분석 방법은 특히 다음의 특징에 관하여 1996 년 유럽 지침 제 46 호의 규정 (1996 년 7 월 16 일의 96/46/EC) 을 따른다:
- 각각의 기질 및 각각의 수준에 대하여:
- 회수율 평균이 70 내지 110 % 여야함;
- 변동 계수로 표현되는 반복성 (당해 시료의 평균에 대한 표준 변동의 비율, 백분율로서 표시) 이 최대 20 % 여야함;
- 각각의 기질에 대하여, 총 변동 계수 (모든 수준 포함) 가 최대 20 % 여야함.
포세틸-Al 분석의 또다른 공지된 방법이 "액체 크로마토그래피/전기분무 탄뎀 질량 분석기에 의한 상추 내 포세틸-Al 잔류물의 신속 측정" 이라 표제된 논문에 기술되어 있다 (Hernandez 등, Journal of AOAC International, 제 86 권, 제 4 호, 2003).
기술된 방법은 상추 유래의 식물 시료 내 포세틸-Al 잔류물의 정량화에 관한 것이다. 상기 방법은 고속 혼합기를 통한 물에 의한 추출, 및 이후 5-배 희석 추출물의 액상 크로마토그래피로의 주입으로 이루어진 단계를 필요로 한다.
그러므로, 포세틸-Al 는, 테트라부틸암모늄 아세테이트를 이온짝 작용제 (ionic pairing agent) 로서 첨가한 후에 전기분무 탄뎀 질량 분석기-결합 액체 크로마토그래피에 의해 정량화한다.
2 및 0.2 ㎎/㎏ 으로 풍부화된 상추 시료의 분석이 보고되었다. 정량화 한계는 0.2 ㎎/㎏ 인 반면, 포세틸-Al 의 검출 한계는 0.05 ㎎/㎏ 이다.
그러나, 이들 공지된 분석 방법 중 다수가 화학적 유도체화 단계를 필요로 한다. 그러한 추가적 단계는 분석을 복잡하게 만들며, 분석 기간을 실질적으로 매우 연장시킨다. 더욱이, 이러한 단계의 시행은 특정 전문 지식을 요구하며, 이들 방법의 재무비용을 증가시킨다.
또한, 그러한 유도체화 단계 도중 사용되는 유도체화제 (TMSD, 디아조메탄 또는 기타 대안적 유도체화제일 수 있음) 는 고가일 뿐 아니라 이들이 사용될 때 상당한 위험을 나타내는 반응물이다. 그러한 유도체화제를 사용할 때 나타날 수 있는 위험 중, 이들의 독성 및 또한 이들의 폭발성이 언급될 수 있다. 그러한 작용제를 이용하는 것은 또한 고비용을 야기한다.
더욱이, 이들 공지된 방법은 많은 취급 단계 (증발, 재-용해, 시료 이송) 를 포함함에 따라 분석할 화합물의 손실 및 산재 (dissemination) 를 증가시킨다. 화합물의 이러한 산재는 또한, 특히 이러한 분석 방법으로부터 유래된 유출물이 퇴거되는 경우, 이의 환경 영향의 문제를 가질 수 있다.
게다가, 이들 공지된 방법은, 특정 화합물에 특이적이지 않다는 큰 단점을 갖는다. 이러한 특이성의 결여는, 보호 및 정량화 특징이 유사한 화합물이 구별되지 않도록 할 수 있다. 기타 공지된 방법에서는, 포세틸-Al 의 단독 분석만이 허용되고, 예를 들어 아인산 동시 분석의 수행이 가능하지 않다는 단점이 있다.
공지된 방법의 일부에서는 오직 특정 기질에 관해서만 기술되어 있는데; 예 를 들어 이미 공지된 한 방법은 상추 유래의 특정 식물 조직에만 관련된다.
마지막으로, 이들 공지된 방법은 어느 정도 더욱 엄격해진 정량화 한계, 특히 최근 규제, 예를 들어 1996 년 7 월 16 일의 지침 96/46/EC 에 뒤이은 정량화 한계를 달성하는 것이 불가능하다.
이제는, 이들 문제에 대한 해결책을 제공할 수 있거나 또는 공지된 방법에 관련된 상기 단점을 방지하는 것이 가능한 분석 방법을 알아내었다.
따라서, 본 발명은 살충 화합물의 잔류물 분석 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 방법은, 살충 화합물이 살진균제, 제초제, 살충제 또는 생장 조절제인지의 여부에 관계없이 이들의 분석에 적절할 것이다.
유리하게는, 본 발명에 따른 분석 방법이 살진균 화합물의 잔류물의 분석에 이용된다.
특히 유리하게는, 본 발명에 따른 분석 방법이 포세틸-Al 잔류물 및 아인산 잔류물의 분석에 이용된다.
포세틸-Al 는 포스폰산 유형의 살진균 화합물로서, 이의 화학명은 에틸 히드로겐 포스폰산 알루미늄 염이며, 하기 화학식을 갖는다:
아인산은 H3PO3 의 화학식을 갖는다.
따라서, 기타 장점 중 특히, 본 발명에 따른 분석 방법의 장점은 매우 간단하다는 것이다. 더욱이, 이 방법은 직접적이며, 분석할 살충 화합물의 정량화 수준을, 이전에는 달성하지 못했던 수준으로 달성하는 것을 가능하게 한다.
본 발명에 따른 방법은 또한 환경적 관점에서 및 또한 경제적인 면에서 특히 유리하다.
전반적으로, 본 발명은 시료 내에 0.00005 ㎎/㎏ 미만 또는 이와 동일한 양, 바람직하게는 0.000005 ㎎/㎏ 미만 또는 이와 동일한 양, 더욱 바람직하게는 0.0000005 ㎎/㎏ 미만 또는 이와 동일한 양으로 존재하는 하나 이상의 살충 화합물의 분석 방법에 관한 것으로, 하기 단계를 포함한다:
- 시료의 제조;
- 제조된 시료의 임의 희석;
- 임의 희석된 시료의 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)/탄뎀 질량 분석기 (MS/MS) 에 의한 직접 분석.
본 발명에 따라 분석할 액체 시료에 대한 정량화 한계는 ㎎/ℓ 로 표시할 수 있다. 당업자는 필요한 환산을 할 수 있다.
본 발명에 따른 분석 방법은 제조된 시료의 희석으로 이루어지는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 분석 방법은 살진균, 제초, 살충 또는 생장-조절 화합물일 수 있는 몇몇 살충 화합물의 동시 분석에 적절하다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 방법이 아인산 또는 이의 유도체; 포스폰산 또는 이의 유도체로부터 선택되는 살진균 화합물의 분석; 바람직하게는 포세틸 또는 이의 하나 이상의 염의 분석; 더욱 바람직하게는 포세틸-Al 또는 아인산의 분석에 이용된다.
특히 유리하게는, 본 발명에 따른 분석 방법이 아인산 및 포세틸-Al 의 동시 분석에 이용된다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 분석 방법이 식물 조직, 바람직하게는 수분 함량이 높은 식물 기질, 산성 pH 의 식물 기질, 건조한 식물 기질, 지방성 식물 기질; 물, 바람직하게는 광천수, 지하수, 수돗물 또는 지표수; 토양; 동물 제품 또는 조직, 바람직하게는 우유, 달걀, 간, 신장, 지방, 근육; 공기; 농식품 제품, 바람직하게는 전환된 것, 및 혈액 및 소변과 같은 인간 체액으로부터 선택되는 시료의 분석에 이용될 수 있다.
본 발명에 따른 분석 방법에 있어서, 제조 단계는 식물 조직; 토양; 동물 제품 또는 조직 및 전환된 농식품 제품 (converted agrofood product) 에 대한 추출; 물에 대한 임의적 농축 및 공기의 트래핑 (trapping) 으로부터 선택될 수 있다.
그러한 농축 단계는 또한 다른 시료에 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 분석 방법에 있어서, 희석 단계는 산성화될 수 있는 수성 용매 (바람직하게는 포름산, 아세트산 또는 트리플루오로아세트산으로부터 선택됨) 내에서; 또는 산성화될 수 있는 유기 용매 (바람직하게는 아세토니트릴 또는 메탄올) 내에서; 또는 대안적으로는 그러한 용매의 혼합물 내에서 수행될 수 있다.
본 발명의 제 1 특정 양태에 따르면, 본 발명은 물 시료 내에 0.005 ㎎/㎏ 미만 또는 이와 동일한 양, 바람직하게는 0.00005 ㎎/㎏ 미만 또는 이와 동일한 양, 더욱 바람직하게는 0.0000005 ㎎/㎏ 미만 또는 이와 동일한 양으로 존재하는 하나 이상의 살충 화합물의 분석 방법에 관한 것으로, 하기 단계를 포함한다:
- 물 시료의 제조;
- 제조된 시료의 임의 희석;
- 임의 희석된 시료의 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)/탄뎀 질량 분석기 (MS/MS) 에 의한 직접 분석.
본 발명에 따른 물 시료의 분석 방법은 제조된 시료의 희석으로 이루어지는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 물 시료의 분석 방법은 살진균, 제초, 살충 또는 생장-조절 화합물일 수 있는 몇몇 살충 화합물의 동시 분석에 적절하다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 물 시료의 분석 방법이 아인산 또는 이의 유도체; 포스폰산 또는 이의 유도체로부터 선택되는 살진균 화합물의 분석; 바람직하게는 포세틸 또는 이의 하나 이상의 염의 분석; 더욱 바람직하게는 포세틸-Al 의 분석에 이용된다.
특히 유리하게는, 본 발명에 따른 물 시료의 분석 방법이 아인산 및 포세틸-Al 의 동시 분석에 이용된다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 물 시료의 분석 방법이 광천수, 지하수, 수돗물 또는 지표수로부터 선택되는 시료의 분석에 이용될 수 있다.
본 발명에 따른 물 시료의 분석 방법에 있어서, 제조 단계는 농축일 수 있다.
본 발명에 따른 물 시료의 분석 방법에 있어서, 희석 단계는 산성화될 수 있는 수성 용매 (바람직하게는 포름산, 아세트산 또는 트리플루오로아세트산으로부터 선택됨) 내에서; 또는 산성화될 수 있는 유기 용매 (바람직하게는 아세토니트릴 또는 메탄올) 내에서; 또는 대안적으로는 그러한 용매의 혼합물 내에서 수행될 수 있다.
본 발명의 제 2 특정 양태에 따르면, 본 발명은 하기 단계를 포함하며, 식물 조직 시료 내에 1 ㎎/㎏ 미만 또는 이와 동일한 양, 바람직하게는 0.01 ㎎/㎏ 미만 또는 이와 동일한 양, 더욱 특히 0.001 ㎎/㎏ 미만 또는 이와 동일한 양으로 존재하는 하나 이상의 살충 화합물의 분석 방법에 관한 것이다:
- 식물 조직 시료의 제조;
- 제조된 시료의 임의 희석;
- 임의 희석된 시료의 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)/탄뎀 질량 분석기 (MS/MS) 에 의한 직접 분석.
본 발명에 따른 식물 조직 시료의 분석 방법은 제조된 시료의 희석으로 이루어지는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 식물 조직 시료의 분석 방법은 살진균, 제초, 살충 또는 생장-조절 화합물일 수 있는 몇몇 살충 화합물의 동시 분석에 적절하다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 식물 조직 시료의 분석 방법이 아인산 또는 이의 유도체; 포스폰산 또는 이의 유도체로부터 선택되는 살진균 화합물의 분석; 바람직하게는 포세틸 또는 이의 하나 이상의 염의 분석; 더욱 바람직하게는 포세틸-Al 의 분석에 이용된다.
특히 유리하게는, 본 발명에 따른 식물 조직 시료의 분석 방법이 아인산 및 포세틸-Al 의 동시 분석에 이용된다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 식물 조직 시료의 분석 방법이 수분 함량이 높은 식물 기질, 산성 pH 의 식물 기질, 건조한 식물 기질 및 지방성 식물 기질로부터 선택되는 시료의 분석에 이용될 수 있다.
본 발명에 따른 분석 방법은 밀, 보리, 감자, 면, 단백질성 작물, 오일-함유 작물, 옥수수, 아마, 벼, 채소 작물, 과일 나무, 포도덩굴 및 근대뿌리로부터 선택되는 식물 시료의 분석에 이용될 수 있다.
본 발명에 따른 식물 조직 시료의 분석 방법에 있어서, 제조 단계는 식물 조직의 추출일 수 있다. 이 제조 단계는 또한 시료의 농축을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 식물 조직 시료의 분석 방법에 있어서, 희석 단계는 산성화될 수 있는 수성 용매 (바람직하게는 포름산, 아세트산 또는 트리플루오로아세트산으로부터 선택됨) 내에서; 또는 산성화될 수 있는 유기 용매 (바람직하게는 아세토니트릴 또는 메탄올) 내에서; 또는 대안적으로는 그러한 용매의 혼합물 내에서 수행될 수 있다.
본 발명에 따른 제 3 특정 양태에 따르면, 본 발명은 토양 시료 내에 5 ㎎/㎏ 미만 또는 이와 동일한 양, 바람직하게는 0.05 ㎎/㎏ 미만 또는 이와 동일한 양, 더욱 특히 0.005 ㎎/㎏ 미만 또는 이와 동일한 양으로 존재하는 하나 이상의 살충 화합물의 분석 방법에 관한 것으로, 하기 단계를 포함한다:
- 토양 시료의 제조;
- 제조된 시료의 임의 희석;
- 임의 희석된 시료의 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)/탄뎀 질량 분석기 (MS/MS) 에 의한 직접 분석.
본 발명에 따른 토양 시료의 분석 방법은 제조된 시료의 희석으로 이루어지는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 토양 시료의 분석 방법은 살진균, 제초, 살충 또는 생장-조절 화합물일 수 있는 몇몇 살충 화합물의 동시 분석에 적절하다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 토양 시료의 분석 방법이 아인산 또는 이의 유도체; 포스폰산 또는 이의 유도체로부터 선택되는 살진균 화합물의 분석; 바람직하게는 포세틸 또는 이의 하나 이상의 염의 분석; 더욱 바람직하게는 포세틸-Al 의 분석에 이용된다.
특히 유리하게는, 본 발명에 따른 토양 시료의 분석 방법이 아인산 및 포세틸-Al 의 동시 분석에 이용된다.
본 발명에 따른 토양 시료의 분석 방법은 임의 유형의 토양, 예를 들어 점토질, 사질 또는 백악질 토양의 분석에 이용될 수 있다.
본 발명에 따른 토양 분석 방법은 경작된 토양 또는 나지 (bare soil) (특히 수확 이전 또는 추수 이후) 에 대하여 이용될 수 있다.
본 발명에 따른 토양 시료의 분석 방법에 있어서, 제조 단계는 토양 시료의 추출일 수 있다. 이러한 제조 단계는 또한 시료의 농축을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 토양 시료의 분석 방법에 있어서, 희석 단계는 산성화될 수 있는 수성 용매 (바람직하게는 포름산, 아세트산 또는 트리플루오로아세트산으로부터 선택됨) 내에서; 또는 산성화될 수 있는 유기 용매 (바람직하게는 아세토니트릴 또는 메탄올) 내에서; 또는 대안적으로는 그러한 용매의 혼합물 내에서 수행될 수 있다.
본 발명에 따른 제 4 특정 양태에 따르면, 본 발명은 공기 시료 내에 0.1 ㎎/m3 미만 또는 이와 동일한 양, 바람직하게는 0.01 ㎎/m3 미만 또는 이와 동일한 양, 더욱 특히 0.001 ㎎/m3 미만 또는 이와 동일한 양으로 존재하는 하나 이상의 살충 화합물의 분석 방법에 관한 것으로, 하기 단계를 포함한다:
- 공기 시료의 제조;
- 제조된 시료의 임의 희석;
- 임의 희석된 시료의 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)/탄뎀 질량 분석기 (MS/MS) 에 의한 직접 분석.
본 발명에 따른 공기 시료의 분석 방법은 제조된 시료의 희석으로 이루어지는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 공기 시료의 분석 방법은 살진균, 제초, 살충 또는 생장-조절 화합물일 수 있는 몇몇 살충 화합물의 동시 분석에 적절하다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 공기 시료의 분석 방법이 아인산 또는 이의 유도체; 포스폰산 또는 이의 유도체로부터 선택되는 살진균 화합물의 분석; 바람직하게는 포세틸 또는 이의 하나 이상의 염의 분석; 더욱 바람직하게는 포세틸-Al 의 분석에 이용된다.
특히 유리하게는, 본 발명에 따른 공기 시료의 분석 방법이 아인산 및 포세틸-Al 의 동시 분석에 이용된다.
본 발명에 따른 공기 시료의 분석 방법에 있어서, 제조 단계는 트래핑일 수 있다.
본 발명에 따른 공기 시료의 분석 방법에 있어서, 희석 단계는 산성화될 수 있는 수성 용매 (바람직하게는 포름산, 아세트산 또는 트리플루오로아세트산으로부터 선택됨) 내에서; 또는 산성화될 수 있는 유기 용매 (바람직하게는 아세토니트릴 또는 메탄올) 내에서; 또는 대안적으로는 그러한 용매의 혼합물 내에서 수행될 수 있다.
본 발명에 따른 제 5 특정 양태에 따르면, 본 발명은 인간 체액의 시료 내에 0.00005 ㎎/㎏ 미만 또는 이와 동일한 양, 바람직하게는 0.000005 ㎎/㎏ 미만 또는 이와 동일한 양, 더욱 바람직하게는 0.0000005 ㎎/㎏ 미만 또는 이와 동일한 양으로 존재하는 하나 이상의 살충 화합물의 분석 방법에 관한 것으로, 하기 단계를 포함한다:
- 인간 체액 시료의 제조;
- 제조된 시료의 임의 희석;
- 임의 희석된 시료의 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)/탄뎀 질량 분석기 (MS/MS) 에 의한 직접 분석.
본 발명에 따른 인간 체액의 시료의 분석 방법은 제조된 시료의 희석으로 이루어지는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 인간 체액의 시료의 분석 방법은 살진균, 제초, 살충 또는 생장-조절 화합물일 수 있는 몇몇 살충 화합물의 동시 분석에 적절하다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 인간 체액의 시료의 분석 방법이 아인산 또는 이의 유도체; 포스폰산 또는 이의 유도체로부터 선택되는 살진균 화합물의 분석; 바람직하게는 포세틸 또는 이의 하나 이상의 염의 분석; 더욱 바람직하게는 포세틸-Al 의 분석에 이용된다.
특히 유리하게는, 본 발명에 따른 인간 체액의 시료의 분석 방법이 아인산 및 포세틸-Al 의 동시 분석에 이용된다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 인간 체액의 시료의 분석 방법이 인간 혈액 및 인간 소변으로부터 선택되는 시료의 분석에 이용될 수 있다.
본 발명에 따른 인간 체액의 시료의 분석 방법에 있어서, 희석 단계는 산성화될 수 있는 수성 용매 (바람직하게는 포름산, 아세트산 또는 트리플루오로아세트산으로부터 선택됨) 내에서; 또는 산성화될 수 있는 유기 용매 (바람직하게는 아세토니트릴 또는 메탄올) 내에서; 또는 대안적으로는 그러한 용매의 혼합물 내에서 수행될 수 있다.
본 발명에 따른 제 6 특정 양태에 따르면, 본 발명은 동물 제품 또는 조직의 시료 내에 1 ㎎/㎏ 미만 또는 이와 동일한 양, 바람직하게는 0.01 ㎎/㎏ 미만 또는 이와 동일한 양, 더욱 바람직하게는 0.001 ㎎/㎏ 미만 또는 이와 동일한 양으로 존재하는 하나 이상의 살충 화합물의 분석 방법에 관한 것으로, 하기 단계를 포함한다:
- 동물 제품 또는 조직의 시료의 제조;
- 제조된 시료의 임의 희석;
- 임의 희석된 시료의 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)/탄뎀 질량 분석기 (MS/MS) 에 의한 직접 분석.
본 발명에 따른 동물 제품 또는 조직의 시료의 분석 방법은 제조된 시료의 희석으로 이루어지는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 동물 제품 또는 조직의 시료의 분석 방법은 살진균, 제초, 살충 또는 생장-조절 화합물일 수 있는 몇몇 살충 화합물의 동시 분석에 적절하다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 동물 제품 또는 조직의 시료의 분석 방법이 아인산 또는 이의 유도체; 포스폰산 또는 이의 유도체로부터 선택되는 살진균 화합물의 분석; 바람직하게는 포세틸 또는 이의 하나 이상의 염의 분석; 더욱 바람직하게는 포세틸-Al 의 분석에 이용된다.
특히 유리하게는, 본 발명에 따른 동물 제품 또는 조직의 시료의 분석 방법이 아인산 및 포세틸-Al 의 동시 분석에 이용된다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 동물 제품 또는 조직의 시료의 분석 방법이 우유, 달걀, 간, 신장, 지방 및 근육으로부터 선택되는 시료의 분석에 이용될 수 있다.
본 발명에 따른 동물 제품 또는 조직의 시료의 분석 방법에 있어서, 희석 단계는 산성화될 수 있는 수성 용매 (바람직하게는 포름산, 아세트산 또는 트리플루오로아세트산으로부터 선택됨) 내에서; 또는 산성화될 수 있는 유기 용매 (바람직하게는 아세토니트릴 또는 메탄올) 내에서; 또는 대안적으로는 그러한 용매의 혼합물 내에서 수행될 수 있다.
본 발명에 따른 동물 제품 또는 조직의 시료의 분석 방법에 있어서, 제조 단계는 동물 제품 또는 조직의 추출일 수 있다. 이러한 제조 단계는 또한 시료의 농축을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 제 7 특정 양태에 따르면, 본 발명은 전환된 농식품 제품 시료에 존재하는 하나 이상의 살충 화합물의 분석 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 전환된 농식품 제품 시료의 분석 방법은 본 발명에 따른 식물 제품 시료의 분석 방법과 유사한 것으로, 여기서 식물 제품 시료가, 전환된 농식품 제품 시료로 대체된다.
다양한 단계 및 선호 사항이 또한 유사하다.
본 발명의 다양한 양태에 있어서, 분석 단계에서는, 사용되는 외부 표준이 분석할 시료와 동일한 성질의 기질의 존재 하에서 제조된다.
하기 실시예는 본 발명의 다양한 양태의 설명을 위해 제공된다. 이들 실시예는 본 발명의 범주를 제한하지 않는다. 특히, 당업자는 본 발명에 따른 분석 방법 단계의 일부를, 이들이 직면할 구체적 필요에 따라 개조 또는 수정할 수 있을 것이다. 그러한 수정 또는 개조는 본 발명의 범주의 일부이다.
실시예 1:
이 실시예는 식물 조직 시료를 이용한 포세틸-Al 및 아인산의 분석에 관한 것이다. 식물 기질은 다음 작물 유래이다: 오이, 오렌지, 상추, 포도 및 아보카도.
본 발명에 따른 분석 방법의 이용 절차:
1. 20.O g 의 균질화된 식물 기질 시료를 계량하며 125 ㎖ 폴리프로필렌 플라스크에 담는다.
2. 80 ㎖ 의 물/아세토니트릴 (50/50, 부피/부피) 혼합물을 첨가한다.
3. IKA T25-유형 분쇄기 이용해 5 분 동안 시료를 분쇄한다.
4. 5 분 동안 3600 rpm 으로 5 ℃ 에서 원심분리한다.
5. 상청액을 200 ㎖ 부피 플라스크에 옮긴다.
6. 펠릿을 80 ㎖ 의 물/아세토니트릴 (50/50, 부피/부피) 혼합물에 용해시킨다.
7. 시료를 다시 5 분 동안 분쇄한다.
8. 5 분 동안 3600 rpm 으로 5 ℃ 에서 원심분리한다.
9. 상청액을 200 ㎖ 부피 플라스크에 옮긴다.
10. 메탄올을 이용해 200 ㎖ 가 되도록 조정한다.
11. 대략 10 ㎖ 의 분취량을 10 분 동안 6000 rpm 으로 상온에서 원심분리한다.
12. 상청액을 PTFE 여과기 (Acrodisc CR 25 ㎜, 0.45 ㎛ 유형) 를 통해 여과한다.
13. 0.5 % 포름산으로 산성화한 메탄올을 사용하여 여액을 5 배 희석한다.
14. 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)/탄뎀 질량 분석기 (MS/MS), 또는 LC/MS/MS 분석에 의해 분석한다.
분석을 시행하기 위해, 외부 표준화에 의해 검정을 수행했다. 사용되는 표준은, 구체적 분석의 대상체인 시료와 동일한 성질의 기질 내에서 제조해야 한다.
단계 14 를 위한 분석 조건:
▷ 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 조건:
컬럼: Hypercarb, 100 × 3.0 ㎜, 5 ㎛
예비컬럼: Phenomenex C18 ODS, 4 × 2.0 ㎜
이동상: 0.5 % 포름산으로 산성화한 물/메탄올 (65/35, 부피/부피), 일정용매 조성법 (isocratic mode)
유속: 400 ㎕/분
컬럼 온도: 상온
주입 부피: 20 ㎕
분석 전에 크로마토그래픽 시스템을 대략 2 시간 동안 방치하여 안정화시켰 다.
▷ 탄뎀 질량 분석기 (MS/MS) 조건:
검출기: 삼중 사중극자, API4000 Sciex Instrument 유형
인터페이스: TIS (터보 이온 분무)
스캔 유형: MRM (다중 반응 모니터링) 모드
극성: 네거티브
기체 주입 압력: 질소: 4 바
공기: 7.5 바
공기 (배기): 4 바
기체 유속: 분무화 (nebulizing) 기체 (공기, GS1): 40
터보 기체 (공기, GS2): 60
보호 기체 (질소, CUR): 20
충돌 기체 (질소, CAD): 6
고압 TIS (IS): -4500 V
근원 온도: 600 ℃
입구 전위 (EP): -10 V
충돌 에너지:
본 발명에 따른 분석 방법이 이용될 때, 단계 1 내지 12 는 시료의 제조에 관한 것이고, 단계 13 은 희석에 관한 것이다. 이리 하여, 단계 14 는, 미리 제조한 후 희석한 식물 기질 시료의 LC/MS/MS 분석에 관한 것이다.
다양한 식물 기질의 분석으로부터 얻어진 결과가 하기 표에 상세히 제공되는데, 여기서 CV 값은 변동 계수를 나타낸다. 본 발명에 따르면, CV 값이 또한 RSD 값에 상응할 수 있다.
이들 결과는, 포세틸-Al 및 아인산이 정량화 한계 (아인산에 대하여는 0.1 ㎎/㎏, 그리고, 포세틸-Al 에 대하여는 0.01 ㎎/㎏) 내지 이들 한계의 10 배까지로 풍부화된 대조군 시료로부터 얻었다.
실시예 2;
이 실시예 또한 식물 조직 시료를 이용한 포세틸-Al 및 아인산의 분석에 관한 것이다. 식물 기질은 밀 작물 유래이다.
이 실시예는 단계 9 까지 실시예 1 의 조건을 반복한 후, 실시예 1 의 단계 10 내지 14 는 하기 단계로 대체했다:
10. 1 ㎖ 의 순수 포름산을 첨가하고, 메탄올을 이용하여 200 ㎖ 가 되도록 조정한다.
11. 대략 10 ㎖ 의 분취량을 10 분 동안 6000 rpm 으로 상온 온도에서 원심분리한다.
12. 0.5 % 포름산으로 산성화한 메탄올을 이용하여 상청액을 2 배 희석한다.
13. PTFE 여과기 (유형 Acrodisc CR 25 ㎜, 0.45 ㎛) 를 통해 여과한다.
14. 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)/탄뎀 질량 분석기 (MS/MS), 또는 LC/MS/MS 분석에 의해 분석한다.
나머지에 대하여는, 이 실시예와 실시예 1 이 동일하다.
밀 시료의 분석으로부터 얻어진 결과가 하기 표에 상세히 제공되는데, 여기서 CV 는 변동 계수를 나타낸다.
이들 결과는, 포세틸-Al 및 아인산이 정량화 한계 (아인산에 대하여는 0.1 ㎎/㎏, 그리고, 포세틸-Al 에 대하여는 0.01 ㎎/㎏) 내지 이들 한계의 10 배까지로 풍부화된 대조군 시료로부터 얻었다.
상기 두 실시예에 있어서, 얻어진 결과는 규제 조항 (1996 년 7 월 16 일의 96/46/EC) 에 따른다.
게다가, 이들 결과는 이전에 공지된 방법으로 가능했던 한계보다 낮은 정량화 한계에 도달하는 것을 가능하게 만들었다.
이들 실시예는 또한 본 발명에 따른 방법의 간단함 및 더 나은 안정성을 증명해준다.
실시예 3:
이 상세 실시예는 식물 조직 시료를 이용한 포세틸-Al 및 아인산의 분석에 관한 것이다. 이 실시예는 포도, 오렌지, 상추, 오이, 아보카도 및 밀 내/상에서의 포세틸-Al 및 이의 대사물 (아인산) 의 잔류물의 LC/MS/MS 에 의한 측정을 위한 분석 방법 00861 에 대한 수정안 M001 이다.
설명 (Description):
데이터 요건:
EU 이사회 지침 91/414/EEC (위원회 지침 96/68/EC 에 의한 개정본)
지침 91/414 의 부록 II (A 항, 제 4 호) 및 부록 III (A 항, 제 5 호) 에서의 사전-등록 데이터 요건을 지지하는 분석 방법의 생성 및 보고를 위한 유럽 이사회 기술 요령집, SANCO/3029/99
잔류물 분석 방법에 대한 유럽 이사회 기술 요령집, SANCO/825/00
요약:
제시되는 잔류물 분석 방법 수정안 00861/M001 은 포도 (과일 전체), 오렌지 (과일 전체), 상추 (헤드), 오이 (과일 전체), 아보카도 (과일 전체) 및 밀 (낟알) 에서의 포세틸-Al 및 이의 대사물 (아인산) 의 LC/MS/MS 에 의한 측정용으로 유효성이 검증되었다.
포세틸-Al 및 이의 대사물 (아인산) 은 아세토니트릴/물 (50/50) 의 혼합물을 이용하여 시료 물질로부터 추출했다. 시료 물질의 원심 분리 및 희석 후, 전기분무 이온화 탄뎀 질량 분석기에 의해 검출하고 Hypercarb 컬럼을 이용하는 HPLC 에 의해 잔류물을 정량화했다. 정량화는 기질 짝지은 표준 (matrix matched standard) 으로 외부 표준화에 의해 수행했다.
유효성 검증용 세트 (validation set) 는 검출기 선형성의 측정, 정량화 한계, 방법의 정확성 및 시료 최종 추출물의 저장 안정성을 포함했다.
사용된 검출기의 선형성은 기질 짝지은 표준 및 용매 내 표준을 이용하여 포세틸-Al 및 아인산에 대하여 시험했다.
포세틸-Al 및 아인산의 표준을 각각 0.1 내지 5 ㎍/ℓ 및 1 내지 50 ㎍/ℓ 의 농도 (예외적으로, 밀 시료에 대하여는 0.31 내지 8.3 ㎍/ℓ 및 3.1 내지 83 ㎍/ℓ) 로 주입함으로써 선형성을 시험했다.
기질 효과의 발생을 모니터링했다. 모든 시료 물질에서, 아인산의 측정은 기질 짝지은 표준을 이용하여 확립되어야 한다. 그래서, 두 화합물의 측정을 기질 짝지은 표준을 이용하여 확립했다.
모든 대조군 시료에서 외견상의 잔류물이 각각의 화합물에 대한 LOQ 의 30 % 미만, 즉, 포세틸-Al 에 대하여는 0.003 ㎎/㎏ 미만, 그리고, 아인산에 대하여는 0.03 ㎎/㎏ 미만이었다.
정량화 한계 (LOQ) 는, 70 내지 110 % 범위 내의 평균 회수와 20 % 이하의 RSD 를 얻을 수 있는 최저 강화 수준 (lowest fortification level) 으로 정의했다. LOQ 는 포도 (과일 전체), 오렌지 (과일 전체), 상추 (헤드), 오이 (과일 전체), 아보카도 (과일 전체) 및 밀 (낟알) 에서 포세틸-Al 에 대하여는 0.01 ㎎/㎏, 그리고, 아인산에 대하여는 0.1 ㎎/㎏ 으로 정해졌다.
방법의 정확성은 측정된 회수율을 근거로 평가할 수 있었다. 단일 회수율은 포세틸-Al 에 대하여 69 내지 114 %, 그리고, 아인산에 대하여 65 내지 113 % 의 범위였다. 강화 수준당 평균 회수율은, 포세틸-Al 의 경우, 95 % 의 강화 수준 및 모든 시료 물질에 대한 전체 회수율에 대하여 93 내지 97 %, 그리고, 아인산의 경우, 91 % 의 강화 수준 및 모든 시료 물질에 대한 전체 회수율에 대하여 86 내지 97 % 의 범위였다. 측정의 정확성은, 각각의 강화 수준에 대한 평균 회수가 70 ~ 110 % 범위여야 함을 요구하는 잔류물 분석 방법을 위한 요건을 충족시켰다.
측정의 정밀성 및 반복성은, 회수율의 평균값에 대하여 측정된 상대적 표준 변동 (RSD) 을 근거로 평가할 수 있었다. 단일 강화 수준에 대한 상대적 표준 변동 (RSD) 은 포세틸-Al 에 대하여는 7.6 내지 12.3 %, 그리고, 아인산에 대하여는 9.5 내지 14.9 % 의 범위였다 (n=30).
단일 강화 수준에 대한 상대적 표준 변동 (RSD) 은 포세틸-Al 에 대하여는 7.6 내지 12.3 %, 그리고, 아인산에 대하여는 9.5 내지 14.9 % 의 범위였다 (n=30). 시료 물질당 전체 RSD 값은 포세틸-Al 에 대하여는 2.1 내지 10.9 %, 그리고, 아인산에 대하여는 6.0 내지 17.8 % 였다 (n=10). 모든 시료에 대한 RSD 값은 포세틸-Al 에 대하여는 10.2 %, 그리고, 아인산에 대하여는 13.7 % 였다 (n=60).
시료 물질 당 전체 RSD 값은 포세틸-Al 에 대하여는 2.1 내지 10.9 %, 그리고, 아인산에 대하여는 6.0 내지 17.8 % 였다 (n=10). 모든 시료에 대한 RSD 값은 포세틸-Al 에 대하여는 10.2 %, 그리고, 아인산에 대하여는 13.7 % 였다 (n=60). 모든 RSD 값은 20 % 보다 꽤 낮아서, 방법의 정밀성 및 반복성이 허용될 수 있었다.
상기 방법의 유효성 검증의 모든 결과는 잔류물 분석 방법의 일반적 요건을 따랐고, 이에 따라 이 방법 수정안의 유효성이 성공적으로 검증되었다.
1. 도입 (Introduction)
포세틸-Al 는 살진균제이다.
이 보고에 제시된 방법 수정안 00861/M001 은, 세정 및 유도체화의 단계를 삭제하고, 분석 및 검출 모드를 변경하고, 원 방법 00861 의 정량화 한계 (LOQ) 를 포세틸-Al 에 대하여는 0.5 ㎎/㎏ 에서 0.01 ㎎/㎏ 으로, 그리고, 아인산에 대하여는 0.1 ㎎/㎏ 으로 감소시키는 것으로 그 유효성이 검증되었다.
[표 1]: LOQ 및 분석 측정의 원리
i: 유효성이 검증된 최저 강화 수준으로서 정의됨.
1.1 원 방법의 설명 ( citation )
원 방법: 00861
화합물: 포세틸-Al 및 이의 대사물 (아인산)
수정 이유:
1.2 물리적 및 화학적 특징
물질명 포세틸-Al
물질 코드 AE F053616
화학명 알루미늄-트리스-(에틸포스포네이트)
실험식 C6H18AlO9P3
구조식 
상대분자질량 354.1 g/mol
모노이소트로픽 질량 354.0 g/mol
용해도 물: 120 g/ℓ (20 ℃)
아세토니트릴: 5 ㎎/ℓ (20 ℃)
물질명 아인산
물질 코드 AE 0540099
화학명 포스폰산
실험식 H3PO3
구조식 
상대분자질량 82.0 g/mol
모노이소트로픽 질량 82.0 g/mol
2. 실험부
2.1 물질
2.1.1 장치
2.1.2 시약 및 공급품
2.1.3 기준 재료 ( Reference item )
충분히 분석되고 검증된 재료만을 기준 재료로 사용했다.
기준 재료는 [Bayer Cropcience GmbH produkt Analytik, G864, lndustriepark Hochst, D-65926 Frankfurt-am-Main, Germany] 사로부터 구입가능했다.
[표 2]: 기준 재료 데이터
2.1.4 표준 용액
스톡 및 표준 용액을 약 5 ℃ 의 냉장고 내에서 빛으로부터 보호하면서 저장했다.
스톡
용액 (1000 ㎎/ℓ)
100 ㎖ 앰버 스크류-캡 플라스크에 20 내지 50 ㎎ 의 기준 재료를 정확히 계량하며 담았다. 뷰렛을 이용하여, 다량의 물을 첨가하여 스톡 용액을 정확히 1000 ㎎/ℓ 로 얻었다. 완전히 용해될 때까지 자석 교반기를 이용해 철저히 혼합했다. 각각의 화합물에 대하여 두 별도의 스톡 용액을 제조해야 한다. 이들 두 스톡 용액을 비교한 후, 이들을 혼합했다.
혼합물 용액
먼저, 물을 이용해 포세틸-Al 스톡 용액을 10 배 희석했다. 이후, 이의 5 ㎖ 및 아인산 스톡 용액의 5 ㎖ 를 "A+" 등급 피펫을 이용해 피펫팅했다. "A+" 등급 50 ㎖ 부피 플라스크에 부었다. 물을 이용해 부피를 조정하고, 캡을 씌우고, 혼합물 용액 (10 ㎎/ℓ 포세틸-Al - 100 ㎎/ℓ 아인산) 을 진탕에 의해 혼합했다.
강화 표준 용액
혼합물 용액은 또한 10LOQ 수준에서의 회수를 위한 강화 표준 용액으로서 사용했다. 물을 이용해 이를 10 배 희석하여 LOQ 수준에서의 회수를 위해 사용되는 강화 표준 용액을 수득했다.
용매 내 표준 용액
LOQ 수준 (1 ㎎/ℓ 포세틸-Al - 10 ㎎/ℓ 아인산) 에서의 회수를 위해 사용되는 강화 용액을, 0.5 % 포름산이 혼합된 메탄올을 이용해 적당히 희석하여 0.05 ㎎/ℓ 의 포세틸-Al 및 0.5 ㎎/ℓ 의 아인산의 중간 표준 용액을 제조했다.
용매 내 표준 용액
검정에 사용되는 표준 용액을 수득하기 위해, 희석기 및 0.5 % 포름산이 혼합된 메탄올을 이용하여 중간 표준 용액을 즉석 희석하여 하기 농도를 수득했다: 0.1 ㎍/ℓ 포세틸-Al - 1 ㎍/ℓ 아인산, 0.2 ㎍/ℓ 포세틸-Al - 2 ㎍/ℓ 아인산, 0.5 ㎍/ℓ 포세틸-Al - 5 ㎍/ℓ 아인산, 1 ㎍/ℓ 포세틸-Al - 10 ㎍/ℓ 아인산, 2 ㎍/ℓ 포세틸-Al - 20 ㎍/ℓ 아인산 및 5 ㎍/ℓ 포세틸-Al - 50 ㎍/ℓ 아인산.
밀 시료만에 대하여는, 희석기 및 0.5 % 포름산이 혼합된 메탄올을 이용하여 중간 표준 용액을 즉석 희석하여 하기 농도를 수득했다: 0.31 ㎍/ℓ 포세틸-Al - 3.1 ㎍/ℓ 아인산, 0.5 ㎍/ℓ 포세틸-Al - 5 ㎍/ℓ 아인산, 0.83 ㎍/ℓ 포세틸-Al - 8.3 ㎍/ℓ 아인산, 1 ㎍/ℓ 포세틸-Al - 10 ㎍/ℓ 아인산, 2.5 ㎍/ℓ 포세틸-Al - 25 ㎍/ℓ 아인산, 5 ㎍/ℓ 포세틸-Al - 50 ㎍/ℓ 아인산 및 8.3 ㎍/ℓ 포세틸-Al - 83 ㎍/ℓ 아인산.
검정에 이용되는 기질 짝지은 표준 용액
기질 효과의 발생을 모니터링했고, 두 화합물의 측정을 모든 시료 물질에서 기질 짝지은 표준을 이용하여 확립했다.
중간 표준 용액으로부터의 희석은 용매 내 표준 용액의 제조에서와 동일했다 (대조군 시료의 최종 추출물인 희석 혼합물은 제외).
비고: 모든 희석의 수행에서 20 내지 25 ㎖ 의 최종 추출물이 필요했다.
여과의 단계가 어려운 경우, 다수의 여과기가 사용될 수 있었다.
2.1.5 표준 용액의 안정성
약 5 ℃ 의 냉장고 내에서 빛으로부터 보호하면서 저장한 스톡 용액은 4 개월 반 동안 안정했다.
약 5 ℃ 의 냉장고 내에서 빛으로부터 보호하면서 저장한 강화 표준 용액는 2 개월 반 동안 안정했다.
2.2 잔류물 분석 방법론
원 분석 방법과 비교되는 일부 수정안을 도입했다:
이 보고에 제시된 방법 수정안 00861/M001 은, 세정 및 유도체화의 단계를 삭제하고, 분석 및 검출 모드를 변경하고, 원 방법 00861 의 정량화 한계 (LOQ) 를 포세틸-Al 에 대하여는 0.5 ㎎/㎏ 에서 0.01 ㎎/㎏ 으로, 그리고, 아인산에 대하여는 0.1 ㎎/㎏ 으로 감소시키는 것으로 그 유효성이 검증되었다.
모든 수정 사항은 하기한 바에 포함되었다.
상기 방법의 흐름도가 부록 1 에 제공된다.
회수 실험을 위해, 계량 후 및 추출 전에 시료 물질에 적당한 표준 용액을 첨가함으로써 시료를 강화했다.
추출
1. 20.0 g 의 균질한 시료 물질을 125 ㎖ 폴리프로필렌 병에 계량하며 담는다.
주: 시료의 중량을 잔류물 계산에 사용함 (변수 G 로 표시).
2. 80 ㎖ 의 아세토니트릴/물 (50/50, v/v) 을 첨가한다.
3. 고속 블렌더 (IKA 또는 동급물) 를 이용하여 대략 5 분 동안 시료를 블랜딩한다.
4. 추출물을 대략 5 분 동안 원심분리한다 (3600 rpm - 5 ℃).
5. 상청액을 200 ㎖ 부피 플라스크에 붓는다.
6. 80 ㎖ 의 아세토니트릴/물 (50/50, v/v) 을 기저부에서 첨가한다.
7. 고속 블렌더 (IKA 또는 동급물) 를 이용하여 대략 5 분 동안 시료를 블랜딩한다.
8. 추출물을 대략 5 분 동안 원심분리한다 (3600 rpm - 5 ℃).
9. 상청액을 부피 플라스크에 붓는다.
10. 200 ㎖ 가 되도록 메탄올을 보충한다. 이것이 추출물 A 이다.
주: 추출물 A 의 부피를 잔류물 계산에 사용함 (변수 V 로 표시).
11. 추출물 A 의 분취량 약 10 ㎖ 를 대략 10 분 동안 원심분리한다 (6000 rpm - 상온).
12. Acrodisc CR 25 ㎜ PTFE 여과기 (0.45 ㎛) 를 통해 상청액을 여과한다.
13. 포름산 0.5 % 로 산성화한 메탄올을 이용하여 추출물을 5 배 희석한다. 이것이 최종 추출물이다.
14. LC/MS/MS 측정을 시작한다, 2.3 장.
비고: 단계 10 으로부터의 밀 시료에 대하여는, 하기와 같은 제조법을 따랐다.
10. 1 ㎖ 의 농축 포름산을 첨가하고, 200 ㎖ 가 되도록 메탄올을 보충한다. 이것이 추출물 A 이다.
주: 추출물 A 의 부피를 잔류물 계산에 사용함 (변수 V 로 표시).
11. 추출물 A 의 분취량 약 10 ㎖ 를 대략 10 분 동안 원심분리한다 (6000 rpm - 상온).
12. 희석기를 이용하고, 포름산 0.5 % 가 혼합된 메탄올로 상청액을 2 배 희석한다.
13. Acrodisc CR 25 ㎜ PTFE 여과기 (0.45 ㎛) 를 통해 추출물을 여과한다. 이것이 최종 추출물이다.
14. LC/MS/MS 측정을 시작한다, 2.3 장.
2.3 분석 및 장비 조건
최종 추출물을 고성능 액체 크로마토그래피에 주입하고, 전기분무 이온화 탄뎀 질량 분석기에 의해 검출했다.
기질 짝지은 표준을 이용하여 외부 표준화에 의해 정량화를 수행했다.
이 방법의 유효성 검증의 과정에 이용되는 예시적 LC/MS/MS 조건은 2.3.1 장 및 2.3.2 장에 열거된다. 이들 조건은 요령집으로서 제공되며, 기타 HPLC-MS/MS 시스템에 채택되어야할 것이다.
2.3.1 HPLC 조건
장비: Binary pump Agilent 1100
Quaternary pump Agilent 1100 (보충 용매)
자동 시료 주입기: CTC Analytics HTC PAL
컬럼: Hypercarb, 10O × 3.0 ㎜, 5 ㎛
예비컬럼: Phenomenex C18 ODS, 4 × 2.0 ㎜
주입 부피: 20 ㎕
컬럼 온도: 상온 (약 25 ℃)
이동상: 이소크라틱 모드: 35/65 (v/v) 메탄올/물 + 0.5 % 포름산
흐름 (컬럼): 400 ㎕/분
체류 시간: 아인산에 대하여 4 내지 6 분, 그리고, 포세틸-Al 에 대하여 7 내지 10 분.
다이버트 밸브: 분석 컬럼 및 MS/MS 시스템 사이에 위치한 밸브. 이 밸브는 이온 공급원을 오염으로부터 보호하고, 이온 억제 발생의 위험을 감소시키기 위해 사용했고, 시행의 첫 1 분부터의 용리액은 폐기물로 처리했고, LC 용리액 흐름을 질량 분석계로 되돌린 후 이온 공급원을 안정화시켜야할 필요성을 없애기 위해 보충 흐름을 사용했다.
보충 용매: 50/50 (v/v) 메탄올/물
다이버트 흐름: 200 ㎕/분
비고:
2.3.2 MS / MS 조건
MRM (다중 반응 모니터링) 조건 하에서 네거티브 이온 모드로 작동되는 전기분무 인터페이스가 장착된 삼중-사중극자 질량 분석계 시스템상에서 실험을 수행했다.
예를 들어:
검출기: 삼중 사중극자 HPLC-MS/MS 질량 분석계, 예를 들어 Sciex Instruments, API 4000 시스템
공급원: TIS (터보 이온 분무)
온도: 600 ℃
스캔 유형: MRM-모드 (다중 반응 모니터링 모드)
극성: 네거티브 이온 모드
기체 흐름: 분무화 (Nebulization) 기체 공기 (GS1): 40
터보 기체 공기 (GS2): 60
커튼 기체 N2 (CUR): 20
충돌 기체 N2 (CAD): 6
충돌 에너지:
[표 3]: 사용된 수량자 이온을 위한 질량 분석계 스캔 매개변수. 사용된 상세 장비 세팅이 2.3.1 장 및 2.3.2 장에 제공된다. 장비 시스템 또는 장비 매개변수를 다양하게 하면 상이한 이온 변환 및 상이한 상대적 강도가 야기될 수 있다.
주: 질량 분석계 조건의 일부는 장비 특징이다. 분석 전에 분광계 조건을 유능한 작업자에 의해 최적화해야 한다.
MS/MS 및 LC 조건에 대한 세부사항이 부록 2 에 제공된다.
포세틸-Al 및 아인산에 대한 수량자 이온의 단편화 반응 경로가 도 1 및 도 2 에 도시된다.
[도 1]: 포세틸-Al 에 대하여 제안된 단편화 반응 경로.
[도 2]: 아인산에 대하여 제안된 단편화 반응 경로.
2.3.3 확인적 변환
시료 내에서의 일부 간섭 또는 오염을 확인 또는 배제하기 위해, 상기된 바와 동일한 조건에서 하기의 변환을 이용할 수 있었다:
포세틸-Al 및 아인산에 대한 확인적 변환을 위한 단편화 반응경로가 도 3 및 도 4 에 도시된다.
[도 3]: 포세틸-Al 에 대하여 제안된 단편화 반응 경로.
[도 4]: 아인산에 대하여 제안된 단편화 반응 경로.
주: 모든 회수 시료를 또한 확인적 변환을 이용하여 분석했다. 결과가 부록 3 에 제공된다.
2.4 검출기의 선형성
사용된 검출기의 선형성은 기질 짝지은 표준 및 용매 내 표준을 이용하여 포세틸-Al 및 아인산에 대하여 시험했다.
포세틸-Al 및 아인산의 표준을 각각 0.1 내지 5 ㎍/ℓ 및 1 내지 50 ㎍/ℓ 의 농도 (예외적으로, 밀 시료에 대하여는 0.31 내지 8.3 ㎍/ℓ 및 3.1 내지 83 ㎍/ℓ) 로 주입함으로써 선형성을 시험했다.
[표 4]: 검출기 선형성의 측정을 위해 준비된 표준 농도. LOQ 에 해당하는 농도는 표의 두 번째 컬럼에 제공됨.
[표 5]: 검출기 선형성의 측정을 위해 준비된, 밀 시료용으로 이용되는 표준 농도. LOQ 에 해당하는 농도는 표의 두 번째 컬럼에 제공됨.
2.5 추출물의 저장 안정성
포세틸-Al 및 아인산을 포함하는 시료 추출물의 안정성을 각각의 시료 물질에 대하여 측정했다.
이러한 목적을 위해, 회수 시료의 최종 추출물을 초기 분석 후에 약 10 ℃ 로 자동온도조절되는 자동 시료 주입기 래크 내에 저장하고, 며칠의 저장 기간 후에 재분석했다.
2.6 계산
2.6.1 잔류물의 계산
이 경우의 평가는, 기질 짝지은 표준을 이용하여 외부 표준화에 따라 수행했다.
각각의 시료 세트의 분석시, 표 4 에 언급된 6 개 (또는 밀 시료에 대하여는 7 개) 의 표준 용액을 일시에 주입했다. 장비 반응에서의 임의의 소폭 변화를 보상하기 위해 시료로 표준에 변화를 주어야 한다.
각각의 화합물에 대하여, 피크 영역을 농도에 대하여 플로팅하여 1/x 가중 최소자승법의 선형 회귀에 의해 얻어지는 검정 곡선을 확립했다.
최종 추출물 내 농도를 측정하기 위한 상응 모델을 분석자 소프트웨어 (버전 1.4) 를 이용하여 계산했다.
각각의 최종 추출물을, 표준 용액에 대하여 앞서 기술한 바와 동일한 조건을 이용하여 일시에 주입했다.
미리 확립된 예측 수학 모델을 이용하여, 각각의 화합물의 최종 농도 (㎍/ℓ) 를 각각의 주입에 대하여 측정했다.
각각의 화합물에 대하여, 하기 화학식을 이용해 잔류물의 양 R (mg/㎏ 으로 표시) 을 계산했다:
식 중:
R: 포세틸-Al 또는 아인산 잔류물의 측정량 (mg/㎏),
C: 분석된 추출물 내에서 발견된 포세틸-Al 또는 아인산의 농도 (㎍/ℓ),
V: 추출물 A 의 부피 (㎖), 여기서는 200 ㎖,
D: 최종 추출물을 수득하기 위한 희석 인자, 여기서는 5 (또는 밀 시료에 대하여는 2),
G: 분석 시료의 시료 중량 (g), 여기서는 20 g.
2.6.2 회수율의 계산
각각의 화합물의 농도 (㎍/ℓ) 를 상기 2.6.1 장에 따라 회수 시료에 대하여 측정했다.
이후, 회수율의 백분율을 다음과 같이 계산했다:
식 중:
Rec: 강화된 시료 내에서 발견된 회수량 (%),
C: 분석된 추출물 내에서 발견된 포세틸-Al 또는 아인산의 농도 (㎍/ℓ),
A: 포세틸-Al 또는 아인산의 강화량 (㎍/ℓ).
2.6.3. 상대적 표준 변동 ( RSD ) 의 계산
RSD 를 다음과 같이 계산했다:
RSD (%) = S.D./평균 회수 × 100 %
Ri: 회수,
Rm: 평균 회수,
n: 회수의 횟수.
3 결과 및 토의
3.1 특이성 및 선택도
상기 방법은 포도, 오렌지, 상추, 오이, 아보카도 및 밀 내/상에서의 포세틸-Al 및 이의 대사물 (아인산) 을 측정해준다.
상기 방법의 특이성은 매우 선택적인 MS/MS 검출과 병용된 HPLC 분리의 결과이다.
3.2 대조군 시료 내에서의 외견상의 잔류물
각각의 시료 물질에 대하여 두 대조군 시료를 분석했다. 사용된 대조군 물질의 공급처가 표 6 에 열거된다.
[표 6]: 비처리 대조군 시료의 공급처
| 시료 물질 | 공급처 |
| 포도 (과일 전체) | Mr. Lusson - Angers - France |
| 오렌지 (과일 전체) | 유기농 전문 시장 - France |
| 상추 (헤드) | 유기농 전문 시장 - France |
| 오이 (과일 전체) | 유기농 전문 시장 - France |
| 아보카도 (과일 전체) | Bayer CropScience 사의 대조군 시료- Monheim - Germany |
| 밀 (낟알) | Bayer CropScience 사의 대조군 시료- Monheim - Germany |
대조군 시료 내에서의 잔류물 수준 추산을 수행했다. 결과가 표 7 에 열거된다. 모든 대조군 시료에서의 외견상의 잔류물이 각각의 화합물에 대한 LOQ 의 30 % 미만, 즉 포세틸-Al 에 대하여는 0.003 ㎎/㎏ 미만, 그리고, 아인산에 대하여는 0.03 ㎎/㎏ 미만이었다.
[표 7]: 비처리 대조군 시료 내 포세틸-Al 및 아인산에 대한 외견상의 잔류믈
| 시료 물질 |
대조군 시료 |
LOQ [mg/㎏] | 외견상의 잔류물 [mg/㎏] | ||
| 포세틸-Al | 아인산 | 포세틸-Al | 아인산 | ||
| 포도 (과일 전체) |
Mr. Lusson - Angers - France |
0.01 | 0.1 | < 0.003 | < 0.03 |
| 오렌지 (과일 전체) |
유기농 전문 시장 - France |
0.01 | 0.1 | < 0.003 | < 0.03 |
| 상추 (헤드) |
유기농 전문 시장 - France |
0.01 | 0.1 | < 0.003 | < 0.03 |
| 오이 (과일 전체) |
유기농 전문 시장 - France |
0.01 | 0.1 | < 0.003 | < 0.03 |
| 아보카도 (과일 전체) |
Bayer CropScience 사의 대조군 시료 - Monheim - Germany |
0.01 | 0.1 | < 0.003 | < 0.03 |
| 밀 (낟알) | Bayer CropScience 사의 대조군 시료 - Monheim - Germany |
0.01 | 0.1 | < 0.003 | < 0.03 |
3.3 검출기의 선형성 및 기질 효과
사용된 검출기의 선형성은 기질 짝지은 표준 및 용매 내 표준을 이용하여 포세틸-Al 및 아인산에 대하여 시험했다.
포세틸-Al 및 아인산의 표준을 각각 0.1 내지 5 ㎍/ℓ 및 1 내지 50 ㎍/ℓ 의 농도 (예외적으로, 밀 시료에 대하여는 0.31 내지 8.3 ㎍/ℓ 및 3.1 내지 83 ㎍/ℓ) 로 주입함으로써 선형성을 시험했다.
실험의 세부 사항은 2.4 장에서 볼 수 있다.
각각의 크로마토그램에서, 포세틸-Al 또는 아인산의 측정된 피크 영역을 각각의 표준 용액에 함유된 포세틸-Al 또는 아인산의 해당 농도에 대하여 각각 플로팅하여, 다음과 같은 형태의 검정 곡선을 얻었다:
y =
ax
+ b (1/x 가중)
식 중:
y = 피크 영역,
x = 주입된 표준 용액 내 농도.
LC/MS/MS 에 있어서의 검출기 반응의 측정의 결과가 표 8 에 요약된다.
[표 8]: LC/MS/MS 에 있어서의 검출기 선형성의 측정의 요약
| 검출 | 매개변수 | 포세틸-Al | 아인산 |
| LC/MS/MS |
선형 범위 [㎍/ℓ] | 0.1 ~ 5 (또는 밀에 대하여는 0.31 ~ 8.3) |
1 ~ 50 (또는 밀에 대하여는 3.1 ~ 83) |
| 농축 횟수 | 6 (또는 밀에 대하여는 7) |
6 (또는 밀에 대하여는 7) |
|
| 주입 횟수 | 1 | 1 | |
| 모델 | 1/x 가중 선형 회귀 | 1/x 가중 선형 회귀 | |
| 용매 내 제조된 표준에 대한 상관 계수 (R) | > 0.9990 | > 0.9900 | |
| 기질 짝지은 표준에 대한 상관 계수 (R) |
> 0.9990 | > 0.9985 |
용매 내 제조된 표준 또는 기질 짝지은 표준을 이용할 때, 포세틸-Al 대하여는 0.1 내지 5 ㎍/ℓ (또는 밀에 대하여는 0.31 내지 8.3 ㎍/ℓ) 의 범위 및 아인산에 대하여는 1 내지 50 ㎍/ℓ (또는 밀에 대하여는 3.1 내지 83 ㎍/ℓ) 의 범위의 표준에서, 분석대상물의 주입 양과 LC/MS/MS 의 검출기 반응 사이의 우수한 선형 상관관계가 관찰되었다.
기질 효과의 발생을 모니터링했다. 결과가 표 9 및 표 10 에 제공된다.
[표 9]: 포세틸-Al 에 대한 기질 효과 평가, FL: 강화 수준
[표 10]: 아인산에 대한 기질 효과 평가, FL: 강화 수준
모든 시료 물질에서, 아인산의 측정은 기질 짝지은 표준을 이용하여 확립해야 한다. 그래서, 두 화합물의 측정을 기질 짝지은 표준을 이용하여 확립했다.
3.4 정량화 한계 및 회수 실험
정량화 한계 ( LOQ ) 는, 70 내지 110 % 범위 내의 평균 회수와 20 % 이하의 RSD 를 얻을 수 있는 최저 강화 수준으로 정의했다. LOQ 는 포도 (과일 전체), 오렌지 (과일 전체), 상추 (헤드), 오이 (과일 전체), 아보카도 (과일 전체) 및 밀 (낟알) 에서 포세틸-Al 에 대하여는 0.01 ㎎/㎏, 그리고, 아인산에 대하여는 0.1 ㎎/㎏ 으로 정해졌다.
이들 기질을 위한 방법의 유효성을 검증하기 위해, 분석 전에 시료를 정해진 양의 포세틸-Al 및 아인산으로 강화했다.
3.5 회수율
얻어진 상세 회수 결과가 표 11 및 표 12 에 열거된다.
[표 11]: 포세틸-Al 에 대하여 얻어진 회수율, FL: 강화 수준, RSD: 상대적 표준 변동
[표 12]: 아인산에 대하여 얻어진 회수율, FL: 강화 수준, RSD: 상대적 표준 변동
얻어진 회수율이 하기 표 13 에 요약된다.
각각의 화합물에 대하여 회수율을 총 60 회 측정했다. 단일 회수율은 포세틸-Al 에 대하여는 69 내지 114 %, 그리고, 아인산에 대하여는 65 내지 113 % 의 범위였다. 강화 수준당 평균 회수율은, 포세틸-Al 의 경우, 95 % 의 강화 수준 및 모든 시료 물질에 대한 전체 회수율에 대하여 93 내지 97 %, 그리고, 아인산의 경우, 91 % 의 강화 수준 및 모든 시료 물질에 대한 전체 회수율에 대하여 86 내지 97 % 의 범위였다.
단일 강화 수준에 대한 상대적 표준 변동 (RSD) 은 포세틸-Al 에 대하여는 7.6 내지 12.3 %, 그리고, 아인산에 대하여는 9.5 내지 14.9 % 의 범위였다 (n=30). 시료 물질당 전체 RSD 값은 포세틸-Al 에 대하여는 2.1 내지 10.9 %, 그리고, 아인산에 대하여는 6.0 내지 17.8 % 였다 (n=10). 모든 시료에 대한 RSD 값은 포세틸-Al 에 대하여는 10.2 %, 그리고, 아인산에 대하여는 13.7 % 였다 (n=60).
[표 13]: 정확성 및 반복성 측정에서의 회수 데이터의 요약; RSD: 상대적 표준 변동
| 매개변수 | 포세틸-Al | 아인산 | |
| 정확성 |
단일 회수 [%] | 69 ~ 114 | 65 ~ 113 |
| 강화 수준당 평균 회수 [%] | 93 ~ 97 | 86 ~ 97 | |
| 시료 물질당 평균 회수 [%] | 80 ~ 106 | 87 ~ 101 | |
| 전체 평균 [%] | 95 | 91 | |
| n 값의 수 | 60 | 60 | |
| 반복성 |
강화 수준당 RSD [%] | 7.6 ~ 12.3 | 9.5 ~ 14.9 |
| 시료 물질당 RSD [%] | 2.1 ~ 10.9 | 6.0 ~ 17.8 | |
| 전체 RSD [%] | 10.2 | 13.7 |
3.6 추출물의 저장 안정성
포세틸-Al 및 이의 대사물 아인산을 포함하는 최종 추출물의 안정성을 측정했다. 이러한 목적을 위해, 회수 시료의 최종 추출물을 초기 분석 후에 약 10 ℃ 로 자동온도조절되는 자동 시료 주입기 래크 내에 두고, 며칠의 저장 기간 후에 재분석했다.
저장 안정성의 결과가 표 14 에 제공된다.
[표 14]: 약 10 ℃ 의 자동 시료 주입기 레크 내에서 최종 추출물이 안정한 기간
| 시료 물질 | 안정한 기간 (일) |
| 포도 (과일 전체) | 7 일 |
| 오렌지 (과일 전체) | 4 일 |
| 상추 (헤드) | 8 일 |
| 오이 (과일 전체) | 8 일 |
| 아보카도 (과일 전체) | 4 일 |
| 밀 (낟알) | 3 일 |
4 평가 및 토의
제시되는 잔류물 분석 방법 수정안 00861/M001 은 포도 (과일 전체), 오렌지 (과일 전체), 상추 (헤드), 오이 (과일 전체), 아보카도 (과일 전체) 및 밀 (낟알) 에서의 포세틸-Al 및 이의 대사물 (아인산) 의 LC/MS/MS 에 의한 측정용으로 유효성이 검증되었다.
포세틸-Al 및 이의 대사물 (아인산) 은 아세토니트릴/물 (50/50) 의 혼합물을 이용하여 시료 물질로부터 추출했다. 시료 물질의 원심 분리 및 희석 후, 전기분무 이온화 탄뎀 질량 분석기에 의해 검출하고 Hypercarb 컬럼을 이용하는 HPLC 에 의해 잔류물을 정량화했다. 정량화는 기질 짝지은 표준으로 외부 표준화에 의해 수행했다.
유효성 검증용 세트는 검출기 선형성의 측정, 정량화 한계, 방법의 정확성 및 시료 최종 추출물의 저장 안정성을 포함했다.
사용된 검출기의 선형성은 기질 짝지은 표준 및 용매 내 표준을 이용하여 포세틸-Al 및 아인산에 대하여 시험했다.
포세틸-Al 및 아인산의 표준을 각각 0.1 내지 5 ㎍/ℓ 및 1 내지 50 ㎍/ℓ 의 농도 (예외적으로, 밀 시료에 대하여는 0.31 내지 8.3 ㎍/ℓ 및 3.1 내지 83 ㎍/ℓ) 로 주입함으로써 선형성을 시험했다. 검출기 반응은 이러한 범위에서 직선형이었다.
기질 효과의 발생을 모니터링했다.
모든 시료 물질에서, 아인산의 측정은 기질 짝지은 표준을 이용하여 확립되어야 한다. 그래서, 두 화합물의 측정을 기질 짝지은 표준을 이용하여 확립했다.
모든 대조군 시료에서 외견상의 잔류물이 각각의 화합물에 대한 LOQ 의 30 % 미만, 즉, 포세틸-Al 에 대하여는 0.003 ㎎/㎏ 미만, 그리고, 아인산에 대하여는 0.03 ㎎/㎏ 미만이었다.
정량화 한계 (LOQ) 는, 70 내지 110 % 범위 내의 평균 회수와 20 % 이하의 RSD 를 얻을 수 있는 최저 강화 수준으로 정의했다. LOQ 는 포도 (과일 전체), 오렌지 (과일 전체), 상추 (헤드), 오이 (과일 전체), 아보카도 (과일 전체) 및 밀 (낟알) 에서 포세틸-Al 에 대하여는 0.01 ㎎/㎏, 그리고, 아인산에 대하여는 0.1 ㎎/㎏ 으로 정해졌다.
방법의 정확성은 측정된 회수율을 근거로 평가할 수 있었다. 단일 회수율은 포세틸-Al 에 대하여 69 내지 114 %, 그리고, 아인산에 대하여 65 내지 113 % 의 범위였다. 강화 수준당 평균 회수율은, 포세틸-Al 의 경우, 95 % 의 강화 수준 및 모든 시료 물질에 대한 전체 회수율에 대하여 93 내지 97 %, 그리고, 아인산의 경우, 91 % 의 강화 수준 및 모든 시료 물질에 대한 전체 회수율에 대하여 86 내지 97 % 의 범위였다. 측정의 정확성은, 각각의 강화 수준에 대한 평균 회수가 70 ~ 110 % 범위여야 함을 요구하는 잔류물 분석 방법을 위한 요건을 충족시켰다.
방법의 정밀성 및 반복성은, 회수율의 평균값에 대하여 측정된 상대적 표준 변동 (RSD) 을 근거로 평가할 수 있었다. 단일 강화 수준에 대한 상대적 표준 변동 (RSD) 은 포세틸-Al 에 대하여는 7.6 내지 12.3 %, 그리고, 아인산에 대하여는 9.5 내지 14.9 % 의 범위였다 (n=30).
시료 물질당 전체 RSD 값은 포세틸-Al 에 대하여는 2.1 내지 10.9 %, 그리고, 아인산에 대하여는 6.0 내지 17.8 % 였다 (n=10). 모든 시료에 대한 RSD 값은 포세틸-Al 에 대하여는 10.2 %, 그리고, 아인산에 대하여는 13.7 % 였다 (n=60).
시료 물질 당 전체 RSD 값은 포세틸-Al 에 대하여는 2.1 내지 10.9 %, 그리고, 아인산에 대하여는 6.0 내지 17.8 % 였다 (n=10). 모든 시료에 대한 RSD 값은 포세틸-Al 에 대하여는 10.2 %, 그리고, 아인산에 대하여는 13.7 % 였다 (n=60). 모든 RSD 값은 20 % 보다 꽤 낮아서, 방법의 정밀성 및 반복성이 허용될 수 있었다.
상기 방법의 유효성 검증의 모든 결과는 잔류물 분석 방법의 일반적 요건을 따랐고, 이에 따라 이 방법 수정안의 유효성이 성공적으로 검증되었다.
부록 1
잔류물 방법 00861/M001 의 흐름도
1. 20.0 g 의 균질한 시료 물질을 125 ㎖ 폴리프로필렌 병에 계량하며 담는다.
2. 80 ㎖ 의 아세토니트릴/물 (50/50, v/v) 을 첨가한다.
3. 고속 블렌더 (IKA 또는 동급물) 를 이용하여 대략 5 분 동안 시료를 블랜딩한다.
4. 추출물을 대략 5 분 동안 원심분리한다 (3600 rpm - 5 ℃).
5. 상청액을 200 ㎖ 부피 플라스크에 붓는다.
6. 80 ㎖ 의 아세토니트릴/물 (50/50, v/v) 을 기저부에서 첨가한다.
7. 고속 블렌더 (IKA 또는 동급물) 를 이용하여 대략 5 분 동안 시료를 블랜딩한다.
8. 추출물을 대략 5 분 동안 원심분리한다 (3600 rpm - 5 ℃).
9. 상청액을 부피 플라스크에 붓는다.
10. 200 ㎖ 가 되도록 메탄올을 보충한다. 이것이 추출물 A 이다.
11. 추출물 A 의 분취량 약 10 ㎖ 를 대략 10 분 동안 원심분리한다 (6000 rpm - 상온).
12. Acrodisc CR 25 ㎜ PTFE 여과기 (0.45 ㎛) 를 통해 추출물을 여과한 다.
13. 포름산 0.5 % 로 산성화한 메탄올을 이용하여 추출물을 5 배 희석한다. 이것이 최종 추출물이다.
비고: 밀 시료에 대하여는, 단계 10 부터 하기의 제조법을 따른다.
10. 1 ㎖ 의 농축 포름산을 첨가하고, 200 ㎖ 가 되도록 메탄올을 보충한다. 이것이 추출물 A 이다.
11. 추출물 A 의 분취량 약 10 ㎖ 를 대략 10 분 동안 원심분리한다 (6000 rpm - 상온).
12. 희석기를 이용하고, 포름산 0.5 % 가 혼합된 메탄올을 이용하여 상청액을 2 배 희석한다.
13. Acrodisc CR 25 ㎜ PTFE 여과기 (0.45 ㎛) 를 통해 추출물을 여과한다. 이것이 최종 추출물이다.
부록 2
LC-MS/MS 조건의 세부 사항
코멘트:
동기화 모드: LC Sync
자동-평형: Off
수집 시간: 11 분 59 초
스캔 횟수: 888
기록 기간 (Periods In File): 1
수집 모듈: Acquisition Method
소프트웨어 버전: Analyst 1.4
MS 방법 특성:
기간 1:
---------
기간 내 스캔: 888
상대적 시작 시간: 0.00 밀리초
기간 내 실험: 1
기간 1 실험 1:
-------------------
스캔 유형: MRM (MRM)
극성: 네거티브
스캔 모드: N/A
이온 공급원: 터보 분무
해상도 Q1: 유닛
해상도 Q3: 유닛
세기 한계값: 0.00 cps
안정 시간: 0.0000 밀리초
MR 중단: 5.0070 밀리초
MCA: 무
단계 크기: 0.00 amu
수량자 변환:
| Q1 질량 (amu) |
Q3 질량 (amu) |
체류 (밀리초) |
매개변수 | 시작 | 정지 |
| 80.90 | 62.90 | 600.00 | DP | -55.00 | -55.00 |
| (아인산) | CE | -38.00 | -38.00 | ||
| Q1 질량 (amu) |
Q3 질량 (amu) |
체류 (밀리초) |
매개변수 | 시작 | 정지 |
| 109.00 | 80.90 | 200.00 | DP | -45.00 | -45.00 |
| (포세틸-Al) | CE | -16.00 | -16.00 | ||
매개변수 표 (기간 1 실험 1):
CUR: 20.00
GS1: 40.00
GS2: 60.00
IS: -4500.00
TEM: 600.00
ihe: ON
CAD: 6.00
EP -10.00
CXP -1.00
확인적 변환:
| Q1 질량 (amu) |
Q3 질량 (amu) |
체류 (밀리초) |
매개변수 | 시작 | 정지 |
| 80.90 | 78.90 | 600.00 | DP | -55.00 | -55.00 |
| (아인산) | CE | -22.00 | -22.00 | ||
| Q1 질량 (amu) |
Q3 질량 (amu) |
체류 (밀리초) |
매개변수 | 시작 | 정지 |
| 109.00 | 63.00 | 200.00 | DP | -45.00 | -45.00 |
| (포세틸-Al) | CE | -38.00 | -38.00 | ||
매개변수 표 (기간 1 실험 1):
CUR: 20.00
GS1: 40.00
GS2: 60.00
IS: -4500.00
TEM: 600.00
ihe: ON
CAD: 6.00
EP -10.00
CXP -5.00
Agilent 1100 LC Pump 방법 특성:
펌프 모델: Agilent 1100 LC Binary Pump
최소 압력 (psi): 0.0
최대 압력 (psi): 5801.0
무용 부피 (㎕): 40.0
최대 흐름 램프 (㎖/분2):100.0
최대 압력 램프 (psi/초):290.0
단계표:
| 단계 | 총 시간 (분) | 유속 (㎕/분) | A (%) | B (%) |
| 0 | 0.00 | 400 | 65.0 | 35.0 |
| 1 | 10.00 | 400 | 65.0 | 35.0 |
좌측 압축성: 50.0
우측 압축성: 115.0
좌측 무용 부피 (㎕): 40.0
우측 무용 부피 (㎕): 40.0
좌측 스트로크 부피 (㎕): -1.0
우측 스트로크 부피 (㎕): -1.0
좌측 용매: A2 (물 + 0.5 % 포름산)
우측 용매: B2 (메탄올)
CTC PAL Autosampler 방법 특성:
루프 부피l (㎕): 100
루프 부피2 (㎕): 20
주입 부피 (㎕): 50.000
방법 설명:
시린지: 25O ㎕
Analyst LC-Inj
공기 부피 (㎕) 0
용매 1 로 전(前) 세정 () 2
용매 2 로 전 세정 () 1
시료로 전 세정 () 0
충전 속도 (㎕/s) 50
충전 스트로크 () 0
주입 위치 LC Vlv2
주입 속도 (㎕/s) 50
전 주입 지연 (ms) 500
후(後) 주입 지연 (ms) 500
용매 1 로 후 세정 () 3
용매 2 로 후 세정 () 2
용매 1 로 밸브 세정 () 2
용매 2 로 밸브 세정 () 1
Agilent 1100 LC Pump 방법 특성:
펌프 모델: Agilent 1100 LC Quaternary Pump
최소 압력 (psi): 0.0
최대 압력 (psi): 5801.0
압축성: 100.0
무용 부피 (㎕): 40.0
스트로크 부피 (㎕): -1.0
최대 흐름 램프 (㎖/분2):100.0
최대 압력 램프 (psi/초):290.0
단계표:
| 단계 |
총 시간 | 유속 | A (%) | B (%) | C (%) | D (%) | TE#1 | TE#2 | TE#3 | TE#4 |
| (분) | (㎕/분) | (물) | (메탄올) | |||||||
| 0 | 0.00 | 200 | 50.0 | 50.0 | 0.0 | 0.0 | 오픈 | 오픈 | 오픈 | 오픈 |
| 1 | 10.00 | 200 | 50.0 | 50.0 | 0.0 | 0.0 | 오픈 | 오픈 | 오픈 | 오픈 |
1 차 유속 (㎕/분): 200.0
흐름 센서 검정 표 색인: 0
Valco 밸브 방법 특성
| Valco 밸브 | 총 시간 (분) | 다이버터 | 위치 |
| 1 | 0.0 | B | 폐기물 |
| 2 | 3.0 | A | 스펙트로 |
| 가스 압력 |
자동 시료 주입기 CTC 분석 HTS Pal (no 1303) |
||
| N2 | 4 바 | 펠티에 레크 | 10 ℃ |
| 공기 가스 | 7.5 바 | 루프 | 20 ㎕ |
| 공기 배스 가스 | 4 바 | 용매 1 | H2O + 0.5 % HCOOH |
| 용매 2 | MeOH | ||
| Oven Agilent G1316A (no 1294) |
|||
| 온도 | 비 이용 | ||
| Valco 밸브 | 컬럼 선택자 | ||
| C2-0000EP V1C1 (no 1289) |
C5-0006EMTD (no 1290) |
||
| 10 개의 포트 | 6 곳의 위치 | ||
| 2 곳의 위치 | 비 이용 | ||
| A = MS B = 폐기물 | |||
| 펌프 | 공급원 no 1291 |
프로브 터보이온분무 no 1288 |
|
| Binary pump Agilent 1100 G1312A (no 1297) |
133 바 | ||
| 흐름 | 0.4 ㎖/분 | 수평 위치 | 7 (x 축) |
| A2 = H2O + 0.5 % 포름산 | 65 % | 수직 위치 | 7 (y 축) |
| B2 = MeOH | 35 % | 모세관 출구 | 1 ㎜ |
| 이소크라틱 | |||
| 질량 분광계 API 4000 | |||
| Device GLP no 1292 | |||
| Quaternary pump Agilent 1100 G1354A (no 1298) |
|||
| 흐름 | 0.2 ㎖/분 | 컬럼 | |
| A = H2O | 50 % | 예비컬럼 | SMPREA1 |
| B = MeOH | 50 % | 컬럼 | SMAR 69-1 |
| C = | - | Thermo Hypercarb 100 ×3.0 ㎜ 5 ㎛ | |
| D = | - | (상온) | |
| 이소크라틱 모드 | |||
부록 3
확인적 변환으로 얻어진 결과
FL: 강화 수준
실시예 4:
이 상세 실시예는 물 시료를 이용한 포세틸-Al 및 아인산의 분석에 관한 것이다. 이 실시예는 음용수 및 지표수 내/상에서의 포세틸-Al 및 이의 대사물 (아인산) 의 잔류물의 LC/MS/MS 에 의한 측정을 위한 분석 방법 00931 에 대한 수정안 M001 이다.
제시되는 잔류물 분석 방법 수정안 00931/M001 은 음용수 및 지표수에서의 포세틸-Al 및 이의 대사물 (아인산) 의 잔류물의 LC/MS/MS 에 의한 측정용으로 유효성이 검증되었다.
시료 물질을 양이온 수지로 처리한 후, 농축했다. 전기분무 이온화 탄뎀 질량 분석기에 의해 검출하고 Hypercarb 컬럼을 이용하는 HPLC 에 의해 포세틸-Al 및 이의 대사물 (아인산) 의 잔류물을 정량화했다. 정량화는 기질 짝지은 표준으로 외부 표준화에 의해 수행했다.
유효성 검증용 세트는 검출기 선형성의 측정, 정량화 한계 및 방법의 정확성을 포함했다.
사용된 검출기의 선형성은 기질 짝지은 표준 및 용매 내 표준을 이용하여 포세틸-Al 및 아인산에 대하여 시험했다.
포세틸-Al 및 아인산의 표준을 0.2 내지 20 ㎍/ℓ 의 농도로 주입함으로써 선형성을 시험했다.
기질 효과의 발생을 모니터링했다. 음용수에서, 포세틸-Al 의 측정은 기질 짝지은 표준을 이용하여 확립되어야 한다. 두 시료 물질 내 아인산에 대하여, 순수 용매 내 표준을 이용하여 얻은 결과는 유럽 요구 사항을 항상 따르지는 못했다. 그래서, 음용수 및 지표수 내 두 화합물의 측정을 기질 짝지은 표준을 이용하여 확립했다.
모든 대조군 시료에서 외견상의 잔류물이 각각의 화합물에 대한 LOQ 의 30 % 미만, 즉, 0.00003 ㎎/ℓ 미만이었다.
정량화 한계 (LOQ) 는, 70 내지 110 % 범위 내의 평균 회수와 20 % 의 RSD 를 얻을 수 있는 최저 강화 수준으로 정의했다. LOQ 는 음용수 및 지표수 내 각각의 화합물에 대하여 0.0001 ㎎/㎖ 으로 정해졌다.
방법의 정확성은 측정된 회수율을 근거로 평가할 수 있었다. 단일 회수율은 포세틸-Al 에 대하여 75 내지 118 %, 그리고, 아인산에 대하여 72 내지 117 % 의 범위였다. 강화 수준당 평균 회수율은, 포세틸-Al 의 경우, 93 % 의 강화 수준 및 모든 시료 물질에 대한 전체 회수율에 대하여 89 내지 96 %, 그리고, 아인 산의 경우, 92 % 의 강화 수준 및 모든 시료 물질에 대한 전체 회수율에 대하여 91 내지 93 % 의 범위였다. 방법의 정확성은, 각각의 강화 수준에 대한 평균 회수가 70 ~ 110 % 범위여야 함을 요구하는 잔류물 분석 방법을 위한 요건을 충족시켰다.
방법의 정밀성 및 반복성은, 회수율의 평균값에 대하여 측정된 상대적 표준 변동 (RSD) 을 근거로 평가할 수 있었다. 단일 강화 수준에 대한 상대적 표준 변동 (RSD) 은 포세틸-Al 에 대하여는 9.6 내지 14.3 %, 그리고, 아인산에 대하여는 8.8 내지 19.8 % 였다 (n=10).
시료 물질 당 전체 RSD 값은 포세틸-Al 에 대하여는 7.5 내지 9.7 %, 그리고, 아인산에 대하여는 9.3 내지 12.4 % 였다 (n=10). 모든 시료에 대한 RSD 값은 포세틸-Al 에 대하여는 12.7 %, 그리고, 아인산에 대하여는 15.0 % 였다 (n=20). 모든 RSD 값은 20 % 보다 꽤 낮아서, 방법의 정밀성 및 반복성이 허용될 수 있었다.
상기 방법의 유효성 검증의 모든 결과는 잔류물 분석 방법의 일반적 요건을 따랐고, 이에 따라 이 방법 수정안의 유효성이 성공적으로 검증되었다.
변형 방법은 또한 음용수 및 지표수에 대하여 유효성이 검증되었다. 주된 방법의 시료 제조는 농축 단계의 삭제에 의해 매우 간단해졌다. 변형 방법은, 포세틸-Al 가 0.1 ㎍/ℓ 내지 포세틸-Al 에 대한 이 한계의 10 배이고, 아인산이 1 ㎍/ℓ 인 비농축된 음용수 및 지표수에 대하여, 시험된 LC 조건에 독립적으로, 유럽 요구 사항 (1996 년 7 월 16 일의 96/46/EC) 에 따라 성공적으로 유효성 이 검증되었다 (이는 기질 짝지은 표준이 이용된 경우임).
주된 방법에서는, 시료 제조가 매우 단순화되었고, 시간이 많이 단축되었다.
1. 도입
포세틸-Al 는 살진균제이다.
이 보고에 제시된 방법 수정안 00931/M001 은, 세정 및 유도체화의 단계를 삭제하고, 분석 및 검출 모드를 변경하고, 원 방법 00931 의 정량화 한계 (LOQ) 를, 지표수 내 포세틸-Al 에 대한 0.001 ㎎/ℓ 및 아인산에 대한 0.004 ㎎/ℓ, 그리고, 음용수 내 아인산에 대한 0.002 ㎎/ℓ 로부터 두 시료 물질 내 각각의 화합물에 대하여 0.0001 ㎎/ℓ 로 감소시키는 것으로 그 유효성이 검증되었다.
[표 15]: LOQ 및 분석 측정의 원리
1.1 원 방법의 설명
원 방법: 00931
화합물: 포세틸-Al 및 이의 대사물 (아인산)
저자: L. Baudet - R. Diot - M. Guillet - J. L. Kieken
Aventis CropScience Centre de Recherche de la Dargoire 14/20 rue Pierre Baizet 69009 Lyon - France
설명: Agredoc Number: R011760 및 R011761, 2000 년 5 월 22 일
수정 이유:
1.2. 물리적 및 화학적 특징
실시예 3 참조.
2. 실험부
2.1 물질
2.1.1 장치
표준 실험실 유리 소모품은 포스페이트를 포함하지 않는 세제로만 세정하고, 물 및 아세톤으로 헹구어내야 한다.
어떠한 오염도 피하기 위해서는, 1 회용 실험실 소모품을 사용하는 것이 매우 권장된다.
2.1.2 시약 및 공급품
2 % HCOOH 가 혼합된 물
2.1.3. 기준 재료
실시예 3 참조.
2.1.4. 표준 용액
스톡 및 표준 용액을 약 5 ℃ 의 냉장고 내에서 빛으로부터 보호하면서 저장했다.
스톡
용액 (1000 ㎎/ℓ)
100 ㎖ 앰버 스크류-캡 플라스크에 20 내지 50 ㎎ 의 기준 재료를 정확히 계량하며 담았다. 뷰렛을 이용하여, 다량의 물을 첨가하여 스톡 용액을 정확히 1000 ㎎/ℓ 로 얻었다. 완전히 용해될 때까지 자석 교반기를 이용해 철저히 혼 합했다. 각각의 화합물에 대하여 두 별도의 스톡 용액을 제조해야 한다. 이들 두 스톡 용액을 비교한 후, 이들을 혼합했다.
혼합물 용액
각각의 스톡 용액의 5 ㎖ 를 "A+" 등급 피펫을 이용해 피펫팅했다. "A+" 등급 50 ㎖ 부피 플라스크에 부었다. 물을 이용해 부피를 조정하고, 캡을 씌우고, 진탕에 의해 혼합했다 (각각의 화합물의 100 ㎎/ℓ).
강화 표준 용액
혼합물 용액을 물에 연속 희석함으로써, 10LOQ 수준 (각각의 화합물의 0.1 ㎎/ℓ) 에서의 회수를 위해 사용되는 강화 표준 용액, 및 LOQ 수준 (각각의 화합물의 0.01 ㎎/ℓ) 에서의 회수를 위해 사용되는 강화 표준 용액을 제조했다.
중간 표준 용액
물을 이용하여 혼합물 용액을 연속 희석함으로써, 1.0 ㎎/ℓ 의 중간 표준 용액을 제조했다.
용매 내 표준 용액
검정에 사용되는 표준 용액을 수득하기 위해, 희석기 및 0.5 % 포름산이 혼합된 메탄올을 이용하여 중간 표준 용액을 즉석 희석하여 하기 농도를 수득했다: 0.2, 0.4, 0.5, 0.75, 1, 2, 5, 10 및 20 ㎍/ℓ.
검정에 이용되는 기질 짝지은 표준 용액
기질 효과의 발생을 모니터링했고, 두 화합물의 측정을 두 시료 물질에 대한 기질 짝지은 표준을 이용하여 확립했다.
중간 표준 용액으로부터의 희석은 용매 내 표준 용액의 제조에서와 동일했다 (대조군 시료의 최종 추출물인 희석 혼합물은 제외).
비고:
2.1.5 표준 용액의 안정성
약 5 ℃ 의 냉장고 내에서 빛으로부터 보호하면서 저장한 스톡 용액은 9 개월 반 동안 안정했다.
2.2 잔류물 분석 방법론
원 분석 방법과 비교되는 일부 수정안을 도입했다:
이 보고에 제시된 방법 수정안 00931/M001 은, 세정 및 유도체화의 단계를 삭제하고, 분석 및 검출 모드를 변경하고, 원 방법 00931 의 정량화 한계 (LOQ) 를, 지표수 내 포세틸-Al 에 대한 0.001 ㎎/ℓ 및 아인산에 대한 0.004 ㎎/ℓ, 그리고, 음용수 내 아인산에 대한 0.002 ㎎/ℓ 로부터 두 시료 물질 내 각각의 화합물에 대하여 0.0001 ㎎/ℓ 로 감소시키는 것으로 그 유효성이 검증되었다.
모든 수정 사항은 하기한 바에 포함되었다.
상기 방법의 흐름도가 부록 1 에 제공된다.
주: 분석 도중, 각각의 시료 세트에 대하여, 블랭크 시약 (물 시료가 Milli Q 물로 대체됨) 에서 시료 제조에 기인한 아인산 오염이 확실히 발견되지 않도록 하는 것이 요구된다 (LOQ 의 30 % 미만).
비고: 표준 실험실 유리 소모품은 포스페이트를 포함하지 않는 세제로만 세정하고, 물 및 아세톤으로 헹구어내야 한다.
어떠한 오염도 피하기 위해서는, 1 회용 실험실 소모품을 사용하는 것이 매우 권장된다.
회수 실험을 위해, 계량 후 및 진탕 전에 시료 물질에 적당한 표준 용액을 첨가함으로써 시료를 강화했다.
양이온 수지의 제조:
15. 약 25 g 의 AG 50W-X8 수지를 1000 ㎖ 폴리프로필렌 병에 계량하며 담는다.
16. 약 500 ㎖ 의 물을 첨가한다.
17. 회전식 진탕기를 이용해 약 10 분 동안 진탕한다.
18. 상청액 물을 폐기한다.
19. 단계 2 내지 4 를 두 번째 시행한다.
20. 단계 2 내지 4 를 세 번째 시행한다.
21. 두 GF/A 여과기를 통과한 여액 잔류 물 및 수지를 폴리프로필렌 깔때기에 붓고, 사전에 물로 헹군다.
비고: 수지는 사용 바로 전 또는 미리 제조하고, 상온에서 저장하고, 사용 바로 전에 재-수화시켰다.
주의: 수지를 상기한 바와 같이 세정하지 않으면, 아인산 간섭이 관찰될 수 있다.
시료 제조:
1. 미리 세정한 AG 50W-X8 수지 0.6 g 를 계량하며 125 ㎖ 폴리프로필렌 병에 담는다.
2. 1 회용 파스퇴르 피펫을 이용하여, 20.0 g 의 균질한 시료 물질을 계량하며 병에 담는다.
주: 시료의 중량을 잔류물 계산에 사용함 (변수 W물 로 표시).
3. 회전식 진탕기를 이용하여 10 분 동안 시료를 진탕한다. 이것이 추출물 A 이다.
주: 추출물 A 의 중량을 잔류물 계산에 사용함 (변수 W추출물 로 표시).
이 경우, 추출하지 않았고: 어떠한 용매도 물 시료에 첨가하지 않았고; 이는 단지 수지 처리여서, W추출물 = W물 = 20 g 였다.
4. 1 회용 유리 피펫을 이용하여, 상청액의 분취량 5 ㎖ 를 미리 계량해둔 시험관에 이동시킨다.
주: 분취량의 부피를 잔류물 계산에 사용함 (변수 V분취량 으로 표시).
(5 ㎖ 를 이동시키는 것 대신, 이 분취량은 5 g = W분취량 을 계량함으로써도 이루어질 수 있었음)
5. 질소 흐름 하에서 시료 농축기를 이용하여 약 60 ℃ 의 온도에서 대략 0.5 g 이 되도록 증발시킨다. 건조될 정도로 증발시키지 않도록 주의한다.
6. 1 회용 피펫을 이용하여, 포름산 0.5 % 으로 산성화한 물을 이용해 1.0 g 이 되도록 보충한다.
주: 단계 6 에서 사용된 산성화한 물 내 포름산의 농도는 중요한 매개변수로서: 이는 LC 에서 얻어지는 H3PO3 피크 형상에 중요한 작용을 갖는다. 산성화한 물 내 포름산을 0.5 % 포름산에서 2 % 포름산으로 증가시키면 매우 큰 H3PO3 피크가 얻어져서, 이에 따라 감도가 떨어질 수 있다.
7. 약 5 분 동안 초음파처리한다. 이것이 최종 추출물이다.
주: 최종 추출물의 중량을 잔류물 계산에 사용함 (변수 W최종 으로 표시).
8. LC/MS/MS 측정을 시작한다, 2.3 장.
주: 검정 곡선 밖의 농도에 기인하여 최종 추출물을 희석시킬 필요가 있는 경우: 대조군 시료의 최종 추출물을 이용하는데, 이는 기질 짝지은 표준이 검정에 이용되기 때문이다.
2.3 분석 및 장비 조건
최종 추출물을 고성능 액체 크로마토그래피에 주입하고, 전기분무 이온화 탄뎀 질량 분석기에 의해 검출했다.
기질 짝지은 표준을 이용하여 외부 표준화에 의해 정량화를 수행했다.
이 방법의 유효성 검증의 과정에 이용되는 예시적 LC/MS/MS 조건은 2.3.1 장 및 2.3.2 장에 열거된다. 이들 조건은 요령집으로서 제공되며, 기타 HPLC-MS/MS 시스템에 채택되어야할 것이다.
2.3.1 HPLC 조건
장비: Binary pump Agilent 1100
자동 시료 주입기: CTC Analytics HTS PAL
컬럼: Hypercarb, 10O × 2.0 ㎜, 5 ㎛
예비컬럼: 무
주입 부피: 50 ㎕
컬럼 온도: 상온 (약 25 ℃)
이동상: 이소크라틱 모드: 55/45 (v/v) 메탄올 + 2 % 포름산/물 + 2 % 포름산
흐름 (컬럼): 200 ㎕/분
체류 시간: 아인산에 대하여 3.1 내지 4.1 분, 그리고, 포세틸-Al 에 대하여 3.9 내지 5.3 분.
비고:
2.3.2 MS / MS 조건
실시예 3 참조.
2.3.3. 확인적 변환
실시예 3 참조.
주: 모든 회수 시료를 또한 확인적 변환을 이용하여 분석했다. 결과가 부록 6 에 제공된다.
2.4 검출기의 선형성
사용된 검출기의 선형성은 기질 짝지은 표준 및 용매 내 표준을 이용하여 포세틸-Al 및 아인산에 대하여 시험했다.
포세틸-Al 및 아인산의 표준을 0.2 내지 20 ㎍/ℓ 의 농도로 주입함으로써 선형성을 시험했다.
표 16: 검출기 선형성의 측정을 위해 준비된 표준 농도. LOQ 에 해당하는 농도는 표의 세 번째 컬럼에 제공된다.
2.5 추출물의 저장 안정성
이 연구에서는 포세틸-Al 및 아인산을 포함하는 시료 추출물의 안정성을 측정하지 않았다.
2.6 계산
2.6.1 잔류물의 계산
이 경우의 평가는, 기질 짝지은 표준을 이용하여 외부 표준화에 따라 수행했다.
각각의 시료 세트의 분석시, 표 16 에 언급된 9 개의 표준 용액을 일시에 주입했다. 장비 반응에서의 임의의 소폭 변화를 보상하기 위해 시료로 표준에 변화를 주어야 한다.
각각의 화합물에 대하여, 피크 영역을 농도에 대하여 플로팅하여 1/x 가중 최소자승법의 선형 회귀에 의해 얻어지는 검정 곡선을 확립했다.
최종 추출물 내 농도를 측정하기 위한 상응 모델을 분석자 소프트웨어 (버전 1.4) 를 이용하여 계산했다.
각각의 최종 추출물을, 표준 용액에 대하여 앞서 기술한 바와 동일한 조건을 이용하여 일시에 주입했다.
미리 확립된 예측 수학 모델을 이용하여, 각각의 화합물의 최종 농도 (㎍/ℓ) 를 각각의 주입에 대하여 측정했다.
각각의 화합물에 대하여, 하기 화학식을 이용해 잔류물의 양 R (mg/ℓ 로 표 시) 을 계산했다:
식 중:
R: 포세틸-Al 또는 아인산 잔류물의 측정량 (mg/ℓ),
C: 최종 추출물 내에서 발견된 포세틸-Al 또는 아인산의 농도 (㎍/ℓ),
V최종: 최종 추출물의 부피 (㎖), 여기서: V최종 = W최종 × 밀도- 1 임, 식 중, W최종 = 최종 추출물의 중량 (g), 여기서는 1 g, 및 밀도-1 = 1 ㎖/g (*),
V추출물: 추출물 A 의 부피 (㎖), 여기서: V추출물 = W추출물 × 밀도- 1 임, 식 중, W추출물 = 추출물의 중량 (g), 여기서는 20 g, 및 밀도-1 = 1 ㎖/g (*), 이 경우, 추출하지 않았고: 어떠한 용매도 물 시료에 첨가하지 않았고; 이는 단지 수지 처리여서, W추출물 = W물 = 20 g 였음,
V물: 분석 시료의 부피 (㎖), 여기서: V물 = W물 × 밀도- 1 임, 식 중, W물 = 물의 중량 (g), 여기서는 20 g, 및 밀도-1 = 1 ㎖/g (*),
V분취량: 증발 전에 사용된 (추출물 A 의) 분취량 (㎖), 여기서는 5 mL. 분취량이 계량된 경우, V분취량 = W분취량 × 밀도- 1 임, 식 중, W분취량 = 분취량의 중량 (g), 여기서는 5 g 및 밀도-1 = 1 ㎖/g (*).
비고 (*):
2.6.2 회수율의 계산
각각의 화합물의 농도 (㎍/ℓ) 를 상기 2.6.1 장에 따라 회수 시료에 대하여 측정했다.
이후, 회수율의 백분율을 다음과 같이 계산했다:
식 중:
Rec: 강화된 시료 내에서 발견된 회수량 (%),
C: 분석된 추출물 내에서 발견된 포세틸-Al 또는 아인산의 농도 (㎍/ℓ),
A: 포세틸-Al 또는 아인산의 강화량 (㎍/ℓ).
2.6.3. 상대적 표준 변동 ( RSD ) 의 계산
RSD 를 다음과 같이 계산했다:
RSD (%) = S.D./평균 회수 × 100 %
Ri: 회수,
Rm: 평균 회수,
n: 회수의 횟수.
3 결과 및 토의
3.1 특이성 및 선택도
상기 방법은 음용수 및 지표수 시료 내에서의 포세틸-Al 및 이의 대사물 (아인산) 을 측정해준다.
상기 방법의 특이성은 매우 선택적인 MS/MS 검출과 병용된 HPLC 분리의 결과이다.
3.2 대조군 시료 내에서의 외견상의 잔류물
각각의 시료 물질에 대하여 두 대조군 시료를 분석했다. 사용된 대조군 물질의 공급처가 표 17 에 열거된다.
[표 17]: 비처리 대조군 시료의 공급처
| 시험 시스템 | 공급처 |
| 음용수 | BCS - CRLD -lab D221 로부터의 수돗물 - Lyon - France |
| 지표수 | St Agnan en Vercors - France |
지표수의 일부 특징을 표 18 에 기록했다.
[표 18]: 지표수의 특징
이들 특징은 하기에 의해 측정된다:
대조군 시료 내에서의 잔류물 수준 추산을 수행했다. 결과가 표 19 에 열거된다. 모든 대조군 시료에서의 외견상의 잔류물이 각각의 화합물에 대한 LOQ 의 30 % 미만, 즉, 0.00003 ㎎/ℓ 미만이었다.
[표 19]: 비처리 대조군 시료 내 포세틸-Al 및 아인산에 대한 외견상의 잔류 물
3.3. 검출 한계
포세틸-Al 및 아인산의 검출 한계를 시험하기 위해, 0.00005 ㎎/ℓ 로 강화된 대조군 시료를 분석했다. 결과가 표 20 에 제공된다.
[표 20]: 0.05 ㎍/ℓ 강화 수준에서 포세틸-Al 및 아인산에 대해 수득한 회수율
3.4 검출기의 선형성 및 기질 효과
사용된 검출기의 선형성은 기질 짝지은 표준 및 용매 내 표준을 이용하여 포세틸-Al 및 아인산에 대하여 시험했다.
포세틸-Al 및 아인산의 표준을 0.2 내지 20 ㎍/ℓ 의 농도로 주입함으로써 선형성을 시험했다.
실험의 세부 사항은 2.4 장에서 볼 수 있다.
각각의 크로마토그램에서, 포세틸-Al 또는 아인산의 측정된 피크 영역을 각각의 표준 용액에 함유된 포세틸-Al 또는 아인산의 해당 농도에 대하여 각각 플로팅하여, 다음과 같은 형태의 검정 곡선을 얻었다:
y =
ax
+ b (1/x 가중)
식 중:
y = 피크 영역,
x = 주입된 표준 용액 내 농도.
LC/MS/MS 에 있어서의 검출기 반응의 측정의 결과가 표 21 에 요약된다.
[표 21]: LC/MS/MS 에 있어서의 검출기 선형성의 측정의 요약
| 검출 | 변수 | 포세틸-Al | 아인산 |
| LC/MS/MS |
직선형 범위 [㎍/ℓ] | 0.2 ~ 20 | 0.2 ~ 20 |
| 농축 횟수 | 9 | 9 | |
| 주입 횟수 | 1 | 1 | |
| 모델 | 1/x 가중 선형 회귀 | 1/x 가중 선형 회귀 | |
| 용매 내 제조된 표준을 위한 상관 계수 (R) |
> 0.9993 | > 0.9991 | |
| 기질 짝지은 표준을 위한 상관 계수 (R) |
> 0.9981 | > 0.9990 |
용매 내 제조된 표준 또는 기질 짝지은 표준을 이용할 때, 두 화합물에 대하 여 0.2 내지 20 ㎍/ℓ 범위의 표준에서, 분석대상물의 주입 양과 LC/MS/MS 의 검출기 반응 사이의 우수한 선형 상관관계가 관찰되었다.
기질 효과의 발생을 모니터링했다. 결과가 표 22 및 표 23 에 도시된다.
[표 22]: 포세틸-Al 에 대한 기질 효과 평가, FL: 강화 수준
[표 23]: 아인산에 대한 기질 효과 평가, FL: 강화 수준
음용수에서, 포세틸-Al 의 측정은 기질 짝지은 표준을 이용하여 확립해야 한 다. 두 시료 물질 내 아인산에 대하여, 순수 용매 내 표준을 이용하여 얻은 결과는 유럽 요구 사항을 항상 따르지는 못했다. 그래서, 음용수 및 지표수 내 두 화합물의 측정을 기질 짝지은 표준을 이용하여 확립했다.
3.5 정량화 한계 및 회수 실험
정량화 한계 (LOQ) 는, 70 내지 110 % 범위 내의 평균 회수와 20 % 이하의 RSD 를 얻을 수 있는 최저 강화 수준으로 정의했다. LOQ 는 음용수 및 지표수 내 각각의 화합물에 대하여 0.0001 ㎎/ℓ 로 정해졌다.
이들 기질을 위한 방법의 유효성을 검증하기 위해, 분석 전에 시료를 정해진 양의 포세틸-Al 및 아인산으로 강화했다.
3.6 회수율
얻어진 상세 회수 결과가 표 24 및 표 25 에 열거된다.
[표 24]: 포세틸-Al 에 대하여 얻어진 회수율, RSD: 상대적 표준 변동
[표 25]: 아인산에 대하여 얻어진 회수율, RSD: 상대적 표준 변동
얻어진 회수율이 하기 표 26 에 요약된다.
각각의 화합물에 대하여 회수율을 총 20 회 측정했다.
단일 회수율은 포세틸-Al 에 대하여는 75 내지 118 %, 그리고, 아인산에 대하여는 72 내지 117 % 의 범위였다. 강화 수준당 평균 회수율은, 포세틸-Al 의 경우, 93 % 의 강화 수준 및 모든 시료 물질에 대한 전체 회수율에 대하여 89 내지 96 %, 그리고, 아인산의 경우, 92 % 의 강화 수준 및 모든 시료 물질에 대한 전체 회수율에 대하여 91 내지 93 % 의 범위였다.
단일 강화 수준에 대한 상대적 표준 변동 (RSD) 은 포세틸-Al 에 대하여는 9.6 내지 14.3 %, 그리고, 아인산에 대하여는 8.8 내지 19.8 % 였다 (n=10). 시료 물질당 전체 RSD 값은 포세틸-Al 에 대하여는 7.5 내지 9.7 %, 그리고, 아인 산에 대하여는 9.3 내지 12.4 % 였다 (n=10). 모든 시료에 대한 RSD 값은 포세틸-Al 에 대하여는 12.7 %, 그리고, 아인산에 대하여는 15.0 % 였다 (n=20).
[표 26]: 정확성 및 반복성 측정에서의 회수 데이터의 요약; RSD: 상대적 표준 변동
| 매개변수 | 포세틸-Al | 아인산 | |
| 정확성 |
단일 회수 [%] | 75 ~ 118 | 72 ~ 117 |
| 강화 수준당 평균 회수 [%] | 89 ~ 96 | 91 ~ 93 | |
| 시료 물질당 평균 회수 [%] | 84 ~ 101 | 82 ~ 101 | |
| 전체 평균 [%] | 93 | 92 | |
| n 값의 수 | 20 | 20 | |
| 반복성 |
강화 수준당 RSD [%] | 9.6 ~ 14.3 | 8.8 ~ 19.8 |
| 시료 물질당 RSD [%] | 7.5 ~ 9.7 | 9.3 ~ 12.4 | |
| 전체 RSD [%] | 12.7 | 15.0 |
3.7. 추출물의 저장 안정성
이 연구에서는 포세틸-Al 및 아인산을 포함하는 시료 추출물의 안정성을 측정하지 않았다.
4. 평가 및 논의
제시되는 잔류물 분석 방법 수정안 00931/M001 은 음용수 및 지표수에서의 포세틸-Al 및 이의 대사물 (아인산) 의 잔류물의 LC/MS/MS 에 의한 측정용으로 유효성이 검증되었다.
시료 물질을 양이온 수지로 처리한 후, 농축했다. 전기분무 이온화 탄뎀 질량 분석기에 의해 검출하고 Hypercarb 컬럼을 이용하는 HPLC 에 의해 포세틸-Al 및 이의 대사물 (아인산) 의 잔류물을 정량화했다. 정량화는 기질 짝지은 표준 으로 외부 표준화에 의해 수행했다.
유효성 검증용 세트는 검출기 선형성의 측정, 정량화 한계 및 방법의 정확성을 포함했다.
사용된 검출기의 선형성은 기질 짝지은 표준 및 용매 내 표준을 이용하여 포세틸-Al 및 아인산에 대하여 시험했다.
포세틸-Al 및 아인산의 표준을 각각 0.1 내지 5 ㎍/ℓ 및 1 내지 50 ㎍/ℓ 의 농도 (예외적으로, 밀 시료에 대하여는 0.31 내지 8.3 ㎍/ℓ 및 3.1 내지 83 ㎍/ℓ) 로 주입함으로써 선형성을 시험했다. 검출기 반응은 이러한 범위에서 직선형이었다.
기질 효과의 발생을 모니터링했다.
모든 시료 물질에서, 아인산의 측정은 기질 짝지은 표준을 이용하여 확립되어야 한다. 그래서, 두 화합물의 측정을 기질 짝지은 표준을 이용하여 확립했다.
모든 대조군 시료에서 외견상의 잔류물이 각각의 화합물에 대한 LOQ 의 30 % 미만, 즉, 포세틸-Al 에 대하여는 0.003 ㎎/㎏ 미만, 그리고, 아인산에 대하여는 0.03 ㎎/㎏ 미만이었다.
정량화 한계 (LOQ) 는, 70 내지 110 % 범위 내의 평균 회수와 20 % 이하의 RSD 를 얻을 수 있는 최저 강화 수준으로 정의했다. LOQ 는 포도 (과일 전체), 오렌지 (과일 전체), 상추 (헤드), 오이 (과일 전체), 아보카도 (과일 전체) 및 밀 (낟알) 에서 포세틸-Al 에 대하여는 0.01 ㎎/㎏, 그리고, 아인산에 대하여는 0.1 ㎎/㎏ 으로 정해졌다.
방법의 정확성은 측정된 회수율을 근거로 평가할 수 있었다. 단일 회수율은 포세틸-Al 에 대하여 69 내지 114 %, 그리고, 아인산에 대하여 65 내지 113 % 의 범위였다. 강화 수준당 평균 회수율은, 포세틸-Al 의 경우, 95 % 의 강화 수준 및 모든 시료 물질에 대한 전체 회수율에 대하여 93 내지 97 %, 그리고, 아인산의 경우, 91 % 의 강화 수준 및 모든 시료 물질에 대한 전체 회수율에 대하여 86 내지 97 % 의 범위였다. 방법의 정확성은, 각각의 강화 수준에 대한 평균 회수가 70 ~ 110 % 범위여야 함을 요구하는 잔류물 분석 방법을 위한 요건을 충족시켰다.
방법의 정밀성 및 반복성은, 회수율의 평균값에 대하여 측정된 상대적 표준 변동 (RSD) 을 근거로 평가할 수 있었다.
단일 강화 수준에 대한 상대적 표준 변동 (RSD) 은 포세틸-Al 에 대하여는 7.6 내지 12.3 %, 그리고, 아인산에 대하여는 9.5 내지 14.9 % 의 범위였다 (n=30).
단일 강화 수준에 대한 상대적 표준 변동 (RSD) 은 포세틸-Al 에 대하여는 7.6 내지 12.3 %, 그리고, 아인산에 대하여는 9.5 내지 14.9 % 의 범위였다 (n=30). 시료 물질당 전체 RSD 값은 포세틸-Al 에 대하여는 2.1 내지 10.9 %, 그리고, 아인산에 대하여는 6.0 내지 17.8 % 였다 (n=10). 모든 시료에 대한 RSD 값은 포세틸-Al 에 대하여는 10.2 %, 그리고, 아인산에 대하여는 13.7 % 였다 (n=60). 모든 RSD 값은 20 % 보다 꽤 낮아서, 방법의 정밀성 및 반복성이 허용 될 수 있었다.
상기 방법의 유효성 검증의 모든 결과는 잔류물 분석 방법의 일반적 요건을 따랐고, 이에 따라 이 방법 수정안의 유효성이 성공적으로 검증되었다.
주: 분석 도중, 각각의 시료 세트에 대하여, 블랭크 시약 (물 시료가 Milli Q 물로 대체됨) 에서 시료 제조에 기인한 아인산 오염이 확실히 발견되지 않도록 하는 것이 요구된다 (LOQ 의 30 % 미만).
비고:
어떠한 오염도 피하기 위해서는, 1 회용 실험실 소모품을 사용하는 것이 매우 권장된다.
상이한
LC
조건의 평가:
모든 회수 시료는 또한 상이한 LC 조건을 이용하여 분석했다. 오직 이동상만 수정했다.
| LC 조건 | 원안 | 대체안 |
| 이동상 조성물 내 변화 | 이소크라틱 모드: 55/45 (v/v) 메탄올 + 2 % HCOOH / 물 + 2 % HCOOH |
이소크라틱 모드: 35/65 (v/v) 메탄올/물 + 2 % HCOOH |
| 체류 시간 | 아인산에 대하여는 3.1 내지 4.1 분, 그리고 포세틸-Al 에 대하여는 3.9 내지 5.3 분 |
아인산에 대하여는 약 3.2 분, 그리고 포세틸-Al 에 대하여는 5.2 분 |
본래의 LC 조건 전부가 상기 2.3.1 장에 기록되었다.
결과는 표 27 에 나타낸다.
[표 27]: 대체안의 LC 조건에서 얻어진 결과의 요약
| 시험 시스템 |
화합물 |
LC 조건 |
검정 곡선 | |
| 순수 용매 내 표준 | 기질 짝지은 표준 | |||
| 음용수 | 포세틸-Al |
원안 | (LOQ 및 10LOQ): No | (LOQ 및 10LOQ): OK |
| 대체안 | (LOQ 및 10LOQ): No | (LOQ 및 10LOQ): OK | ||
| H3PO3 |
원안 | LOQ: OK 10LOQ: No |
(LOQ 및 10LOQ): OK | |
| 대체안 | (LOQ 및 10LOQ): No | (LOQ 및 10LOQ): OK | ||
| 지표수 |
포세틸-Al | 원안 | (LOQ 및 10LOQ): OK | (LOQ 및 10LOQ): OK |
| 대체안 | (LOQ 및 10LOQ): No | (LOQ 및 10LOQ): No | ||
| H3PO3 |
원안 | LOQ: No 10LOQ: OK |
(LOQ 및 10LOQ): OK | |
| 대체안 | LOQ: No 10LOQ: OK |
(LOQ 및 10LOQ): OK | ||
| "OK" 는 결과가 유럽 요구 사항에 응함을 의미한다. "No" 는 결과가 유럽 요구 사항에 응하지 않음을 의미한다. "순수 용매 내 표준" 컬럼은 참고로서 제공된다. |
||||
기질 짝지은 표준이 이용된 경우, 수행된 상이한 실험들은 지표수에 있어서 대체안의 LC 조건이 이용된 경우 LOQ 및 10LOQ 에서의 포세틸-Al 만 유효성 검증이 실패했다는 것을 보여주었다. 음용수에 대하여는, 어떠한 문제도 관찰되지 않았다.
상기 방법은, 포세틸-Al 및 아인산이 0.1 ㎍/ℓ 및 이 한계의 10 배인 음용 수에 대하여, 시험된 LC 조건에 독립적으로, 유럽 요구 사항 (1996 년 7 월 16 일의 96/46/EC) 에 따라 성공적으로 유효성이 검증되었다 (이는 오직 기질 짝지은 표준이 이용된 경우임).
상기 방법은, 포세틸-Al 및 아인산이 0.1 ㎍/ℓ 및 이 한계의 10 배인 지표수에 대하여, 시험된 LC 조건에 의존적으로 (특히, 포세틸-Al 의 경우), 유럽 요구 사항 (1996 년 7 월 16 일의 96/46/EC) 에 따라 성공적으로 유효성이 검증되었다 (이는 오직 기질 짝지은 표준이 이용된 경우임).
5. 변형 방법
변형 방법은 또한 음용수 및 지표수에 대하여 유효성이 검증되었다. 주된 방법의 시료 제조는 농축 단계의 삭제에 의해 매우 간단해졌고, 모든 회수 시료는 농축 단계 전에 2.3.1 장 및 2.3.2 장에 제공된 검출 조건 및 HPLC 로 분석했다.
변형 방법의 흐름도가 부록 8 에 제공된다.
결과의 요약이 표 28 에 제공되고, 얻어진 상세 회수 결과가 부록 7 에 열거된다.
[표 28]: 변형 방법에서 얻어진 결과의 요약
| 시험 시스템 |
화합물 |
LC 조건 |
검정 곡선 | |
| 순수 용매 내 표준 | 기질 짝지은 표준 | |||
| 음용수 | 포세틸-Al |
원안 | (LOQ 및 10LOQ): OK | (LOQ 및 10LOQ): OK |
| 대체안 | (LOQ 및 10LOQ): No | (LOQ 및 10LOQ): OK | ||
| H3PO3 |
원안 | LOQ: No 10LOQ: OK |
LOQ: No 10LOQ: OK |
|
| 대체안 | (LOQ 및 10LOQ): No | LOQ: No 10LOQ: OK |
||
| 지표수 |
포세틸-Al | 원안 | (LOQ 및 10LOQ): OK | (LOQ 및 10LOQ): OK |
| 대체안 | (LOQ 및 10LOQ): OK | (LOQ 및 10LOQ): OK | ||
| H3PO3 |
원안 | LOQ: No 10LOQ: OK |
LOQ: No 10LOQ: OK |
|
| 대체안 | LOQ: No 10LOQ: OK |
LOQ: No 10LOQ: OK |
||
| "OK" 는 결과가 유럽 요구 사항에 응함을 의미한다. "No" 는 결과가 유럽 요구 사항에 응하지 않음을 의미한다. "순수 용매 내 표준" 컬럼은 참고로서 제공된다. |
||||
비고: 비 농축된 물 시료를 정량화하기 위해, 표준 용액 농도를 채택하는 것이 필요하다. 아인산은 충분히 민감하지 않기 때문에, 이 방법은 O.1 ㎍/ℓ 의 정량화 한계에서 이를 측정하지 못했다.
변형 방법은, 포세틸-Al 가 0.1 ㎍/ℓ 내지 포세틸-Al 에 대한 이 한계의 10 배이고, 아인산이 1 ㎍/ℓ 인 비농축된 음용수 및 지표수에 대하여, 시험된 LC 조건에 독립적으로, 유럽 요구 사항 (1996 년 7 월 16 일의 96/46/EC) 에 따라 성공적으로 유효성이 검증되었다 (이는 기질 짝지은 표준이 이용된 경우임).
주된 방법에서는, 시료 제조가 매우 단순화되었고, 시간이 많이 단축되었다.
부록 4
잔류물 방법 00931/M001 의 흐름도
[주요 포인트: 각각의 시료 세트에 대하여, 블랭크 시약 (물 시료가 H20 milli Q 로 대체됨) 에서 시료 제조에 기인한 H3PO3 오염이 확실히 발견되지 않도록 하는 것이 요구됨 (LOQ 의 30 % 미만)]
0.6 g 의 세정된 AG 50W-X8 수지
(1 회용 날진 병 PP 내).
+
20.0 g 의 물 시료
(1 회용 파스퇴르 피펫 이용)
(여기에, LOQ 회수를 위한 강화 용액 200 ㎕ 또는 10LOQ 회수를 위한 강화 용액 200 ㎕ 를 희석기를 이용하여 첨가함).
↓
상온에서의 기계적 휘저음 (10 분): 추출물 A 에 해당함.
↓
5 ㎖ 의 추출물을 계량된 1 회용 유리 시험관에 부음
(1 회용 유리 피펫 이용).
↓
질소 흐름 하의 60 ℃ 에서 약 0.5 g 이 되도록 증발시킴.
건조되지 않도록 주의
↓
물 + 포름산 0.5 % 를 이용해 1 g 이 되도록 보충함
(1 회용 파스퇴르 피펫 이용).
↓
초음파 처리:
최종 추출물에 해당함.
↓
[전기분무 MS/MS 검출이 병용되는 HPLC 측정]
검정 곡선 밖의 농도에 기인하여 최종 추출물을 희석시킬 필요가 있는 경우: 대조군 시료의 최종 추출물을 이용함 (이는 기질 짝지은 표준이 검정에 이용되기 때문임).
부록 5
LC-MS/MS 조건의 세부 사항
코멘트:
동기화 모드: LC Sync
자동-평형: Off
수집 시간: 10 분 1 초
스캔 횟수: 455
기록 기간: 1
수집 모듈: Acquisition Method
소프트웨어 버전: Analyst 1.4
MS 방법 특성:
기간 1:
---------
기간 내 스캔: 455
상대적 시작 시간: 0.00 밀리초
기간 내 실험: 1
기간 1 실험 1:
-------------------
스캔 유형: MRM (MRM)
극성: 네거티브
스캔 모드: N/A
이온 공급원: 터보 분무
해상도 Q1: 유닛
해상도 Q3: 유닛
세기 한계값: 0.00 cps
안정 시간: 0.0000 밀리초
MR 중단: 5.0070 밀리초
MCA: No
단계 크기: 0.00 amu
수량자 변환:
| Q1 질량 (amu) |
Q3 질량 (amu) |
체류 (밀리초) |
매개변수 | 시작 | 정지 |
| 80.90 | 78.90 | 400.00 | DP | -55.00 | -55.00 |
| (아인산) |
CE | -22.00 | -22.00 | ||
| CXP | -5.00 | -5.00 | |||
| Q1 질량 (amu) |
Q3 질량 (amu) |
체류 (밀리초) |
매개변수 | 시작 | 정지 |
| 108.90 | 80.90 | 200.00 | DP | -45.00 | -45.00 |
| (포세틸-Al) |
CE | -16.00 | -16.00 | ||
| CXP | -1.00 | -1.00 | |||
확인적 변환:
| Q1 질량 (amu) |
Q3 질량 (amu) |
체류 (밀리초) |
매개변수 | 시작 | 정지 |
| 80.90 | 62.90 | 400.00 | DP | -55.00 | -55.00 |
| (아인산) |
CE | -38.00 | -38.00 | ||
| CXP | -1.00 | -1.00 | |||
| Q1 질량 (amu) |
Q3 질량 (amu) |
체류 (밀리초) |
매개변수 | 시작 | 정지 |
| 108.90 | 62.90 | 300.00 | DP | -45.00 | -45.00 |
| (포세틸-Al) |
CE | -38.00 | -38.00 | ||
| CXP | -5.00 | -5.00 | |||
매개변수 표 (기간 1 실험 1):
CAD: 6.00
CUR: 20.00
GS1: 40.00
GS2: 60.00
TEM: 600.00
ihe: ON
IS: -4500.00
EP -10.00
Agilent 1100 LC Pump 방법 특성:
펌프 모델: Agilent 1100 LC Binary Pump
최소 압력 (psi): 0.0
최대 압력 (psi): 5801.0
무용 부피 (㎕): 40.0
최대 흐름 램프 (㎖/분2):100.0
최대 압력 램프 (psi/초):290.0
단계표:
| 단계 | 총 시간 (분) | 유속 (㎕/분) | A (%) | B (%) |
| 0 | 0.00 | 200 | 45.0 | 55.0 |
| 1 | 10.00 | 200 | 45.0 | 55.0 |
좌측 압축성: 50.0
우측 압축성: 115.0
좌측 무용 부피 (㎕): 40.0
우측 무용 부피 (㎕): 40.0
좌측 스트로크 부피 (㎕): -1.0
우측 스트로크 부피 (㎕): -1.0
좌측 용매: A2 (물 + 2 % 포름산)
우측 용매: B1 (메탄올 + 2 % 포름산)
CTC PAL Auto sampler 방법 특성:
루프 부피l (㎕): 50
루프 부피2 (㎕): 50
주입 부피 (㎕): 200.000
방법 설명:
시린지: 25O ㎕
Analyst LC-Inj
공기 부피 (㎕) 0
용매 1 로 전 세정 () 2
용매 2 로 전 세정 () 1
시료로 전 세정 () 0
충전 속도 (㎕/s) 50
충전 스트로크 () 0
주입 위치 LC Vlv1
주입 속도 (㎕/s) 50
전 주입 지연 (ms) 500
후 주입 지연 (ms) 500
용매 1 로 후 세정 () 3
용매 2 로 후 세정 () 2
용매 1 로 밸브 세정 () 2
용매 2 로 밸브 세정 () 1
| 가스 압력 |
자동 시료 주입기 CTC 분석 HTS Pal (no 1303) |
||
| N2 | 4 바 | 펠티에 레크 | 10 ℃ |
| 공기 가스 | 7.5 바 | 루프 | 50 ㎕ |
| 공기 배스 가스 | 4 바 | 용매 1 | H2O + 0.5 % HCOOH |
| 용매 2 | MeOH | ||
| Oven Agilent G1316A (no 1294) |
|||
| 온도 | 비 이용 | ||
| Valco 밸브 | 컬럼 선택자 | ||
| C2-0000EP V1C1 (no 1289) |
C5-0006EMTD (no 1290) |
||
| 10 개의 포트 | 6 곳의 위치 | ||
| 2 곳의 위치 | 비 이용 | ||
| 비 이용 | |||
| 펌프 | 공급원 no 1291 |
프로브 터보이온분무 no 1288 |
|
| Binary pump Agilent 1100 G1312A (no 1297) |
1400 바 | ||
| 흐름 | 0.2 ㎖/분 | 수평 위치 | 7 (x 축) |
| A2 = H2O + 2 % 포름산 | 45 % | 수직 위치 | 7 (y 축) |
| B1 = MeOH + 2 % 포름산 | 55 % | 모세관 출구 | 1 ㎜ |
| 이소크라틱 | |||
| 질량 분광계 API 4000 | |||
| Device GLP no 1292 | |||
| Quaternary pump Agilent 1100 G1312A (no 1296) |
비 이용 | ||
| 흐름 | - | 컬럼 | |
| A = | - | 예비컬럼 | 무 |
| B = | - | 컬럼 | SMAR 68-1 |
| 이소크라틱 모드 | Thermo Hypercarb 100 ×2.0 ㎜ 5 ㎛ | ||
| (상온) | |||
부록 6
확인적 변환으로 얻어진 결과
부록 7
대체안의 LC 조건으로 얻어진 결과
음용수
지표수
부록 8
변형 방법의 흐름도
[주요 포인트: 각각의 시료 세트에 대하여, 블랭크 시약 (물 시료가 H20 milli Q 로 대체됨) 에서 시료 제조에 기인한 H3PO3 오염이 확실히 발견되지 않도록 하는 것이 요구됨 (LOQ 의 30 % 미만)]
0.6 g 의 세정된 AG 50W-X8 수지
(1 회용 날진 병 PP 내).
+
20.0 g 의 물 시료
(1 회용 파스퇴르 피펫 이용)
(여기에, LOQ 회수를 위한 강화 용액 200 ㎕ 또는 10LOQ 회수를 위한 강화 용액 200 ㎕ 를 희석기를 이용하여 첨가함).
↓
상온에서의 기계적 휘저음 (10 분): 추출물 A 가 최종 추출물에 해당함.
↓
[전기분무 MS/MS 검출이 병용되는 HPLC 측정]
검정 곡선 밖의 농도에 기인하여 최종 추출물을 희석시킬 필요가 있는 경우: 대조군 시료의 최종 추출물을 이용함 (이는 기질 짝지은 표준이 검정에 이용되기 때문임).
부록 9
변형 방법으로 얻어진 결과
음용수
지표수
실시예 5:
이 상세 실시예는 토양 시료를 이용한 포세틸-Al 및 아인산의 분석에 관한 것이다. 이 실시예는 토양 내 포세틸-Al 및 이의 대사물 (아인산) 의 잔류물의 측정을 위한 분석 방법 00974 에 대한 수정안 M001 이다.
데이터 요건:
요약
제시되는 잔류물 분석 방법 수정안 00974/M001 은 토양 내 포세틸-Al 및 이의 대사물 (아인산) 의 잔류물의 LC/MS/MS 에 의한 측정용으로 유효성이 검증되었다.
포세틸-Al 및 이의 대사물 (아인산) 의 잔류물은 암모니아 완충액과 진탕함으로써 토양 시료로부터 추출했다. 이후, 이 추출물을 양이온 수지로 처리하고, LC/MS/MS 에 의한 분석 전에 최종 희석했다. 전기분무 이온화 탄뎀 질량 분석기에 의해 검출하고 Hypercarb 컬럼을 이용하는 HPLC 에 의해 잔류물을 정량화했다. 정량화는, 순수 용매 내 제조된 표준을 이용하여 외부 표준화에 의해 수행했다.
유효성 검증용 세트는 검출기 선형성의 측정, 정량화 한계 및 방법의 정확성을 포함했다.
사용된 검출기의 선형성은 기질 짝지은 표준 및 용매 내 표준을 이용하여 포세틸-Al 및 아인산에 대하여 시험했다.
포세틸-Al 및 아인산의 표준을 0.25 내지 25 ㎍/ℓ 의 농도로 주입함으로써 선형성을 시험했다.
기질 효과의 발생을 모니터링했다.
결론은 다음과 같다:
- 포세틸-Al 의 측정은, 용매 내에서 제조된 표준이 이용되어 확립된 경우, 또는 기질 짝지은 표준이 이용되어 확립된 경우에서 큰 차이가 관찰되지 않았다;
- 아인산의 측정은, 기질 짝지은 표준이 이용된 경우 대신 용매 내에서 제조된 표준이 이용되어 확립된 경우가 더 개선되었다 (더 높은 평균 회수 및 더 낮은 RSD 확인).
이러한 모든 이유로 인해, 용매 내에서 제조된 표준이 이용되어야 한다.
모든 대조군 시료에서 외견상의 잔류물은 각각의 화합물에 대한 LOQ 의 20 % 미만, 즉, 0.01 ㎎/㎏ 미만이었다.
정량화 한계 (LOQ) 는, 70 내지 110 % 범위 내의 평균 회수와 20 % 의 RSD 를 얻을 수 있는 최저 강화 수준으로 정의했다. LOQ 는 토양 시료 내 각각의 화합물에 대하여 0.050 ㎎/㎏ 으로 정해졌다.
방법의 정확성은 측정된 회수율을 근거로 평가할 수 있었다.
단일 회수율은 포세틸-Al 에 대하여 70 내지 81 %, 그리고, 아인산에 대하여 80 내지 98 % 의 범위였다. 모든 평균 회수율은 70 내지 110 % 의 범위였다. 방법의 정확성은, 각각의 강화 수준에 대한 평균 회수가 70 ~ 110 % 범위여야 함을 요구하는 잔류물 분석 방법을 위한 요건을 충족시켰다.
방법의 정밀성 및 반복성은, 회수율의 평균값에 대하여 측정된 상대적 표준 변동 (RSD) 을 근거로 평가할 수 있었다. 모든 RSD 는 20 % 보다 꽤 낮았다. 따라서, 방법의 정밀성 및 반복성이 허용될 수 있었다.
상기 방법의 유효성 검증의 모든 결과는 잔류물 분석 방법의 일반적 요건을 따랐고, 이에 따라 이 방법 수정안의 유효성이 성공적으로 검증되었다.
1. 도입
포세틸-Al 는 살진균제이다.
이 보고에 제시된 방법 수정안 00974/M001 은, 유도체화의 단계를 삭제하고, 분석 및 검출 모드를 변경하고, 원 방법 00974 의 정량화 한계 (LOQ) 를 포세틸-Al 및 아인산에 대하여 0.100 ㎎/㎏ 에서 0.050 ㎎/㎏ 으로 감소시키는 것으로 그 유효성이 검증되었다.
[표 29]: LOQ 및 분석 측정의 원리
i: 유효성이 검증된 최저 강화 수준으로서 정의됨.
1.1 원 방법의 설명
원 방법: 00974
화합물: 포세틸-Al 및 이의 대사물 (아인산)
수정 이유:
1.2 물리적 및 화학적 특징
실시예 3 참조.
2. 실험부
2.1 물질
2.1.1 장치
표준 실험실 유리 소모품은 포스페이트를 포함하지 않는 세제로만 세정하고, 물 및 아세톤으로 헹구어내야 한다.
어떠한 오염도 피하기 위해서는, 1 회용 실험실 소모품을 사용하는 것이 매우 권장된다.
회전식 진탕기 (예, Heidolph REAX 2)
2.1.2 시약 및 공급품
2 % HCOOH 가 혼합된 물
2.1.3 기준 재료
충분히 분석되고 검증된 재료만을 기준 재료로 사용했다.
기준 재료는 [Bayer Cropcience GmbH produkt Analytik, G864, lndustriepark Hochst, D-65926 Frankfurt-am-Main, Germany] 사로부터 구입가능했 다.
[표 30]: 기준 재료 데이터
2.1.4 표준 용액
스톡 및 표준 용액을 약 5 ℃ 의 냉장고 내에서 빛으로부터 보호하면서 저장했다.
스톡
용액 (1000 ㎎/ℓ)
100 ㎖ 앰버 스크류-캡 플라스크에 20 내지 50 ㎎ 의 기준 재료를 정확히 계량하며 담았다. 뷰렛을 이용하여, 다량의 물을 첨가하여 스톡 용액을 정확히 1000 ㎎/ℓ 로 얻었다. 완전히 용해될 때까지 자석 교반기를 이용해 철저히 혼합했다. 각각의 화합물에 대하여 두 별도의 스톡 용액을 제조해야 한다. 이들 두 스톡 용액을 비교한 후, 이들을 혼합했다.
혼합물 용액
각각의 스톡 용액의 5 ㎖ 를 "A+" 등급 피펫을 이용해 피펫팅했다. "A" 등급 50 ㎖ 부피 플라스크에 부었다. 물을 이용해 부피를 조정하고, 캡을 씌우고, 진탕에 의해 혼합했다 (각각의 화합물의 100 ㎎/ℓ). 두 상이한 혼합물 용 액을 제조했다.
강화 표준 용액
혼합물 용액 (이는 또한 10LOQ 수준 (각각의 화합물의 100 ㎎/ℓ) 에서의 회수를 위해 사용되는 강화 표준 용액임) 중 하나를 물에 희석함으로써, LOQ 수준 (각각의 화합물의 10 ㎎/ℓ) 에서의 회수를 위해 사용되는 강화 표준 용액을 제조했다.
중간 표준 용액
물을 이용하여 다른 혼합물 용액을 연속 희석함으로써, 각각의 화합물의 1.0 ㎎/ℓ 로 중간 표준 용액을 제조했다.
이용 전에, LOQ 수준에서의 회수를 위해 사용되는 중간 용액 및 강화 표준 용액을, 이들 제조의 유효성 검증을 위해 비교했다.
검정에 사용되는 용매 내 표준 용액
검정에 사용되는 표준 용액을 수득하기 위해, 0.5 % 포름산이 혼합된 물 및 희석기를 이용해 (또는 상이한 방식으로) 즉석 희석하여, 중간 표준 용액을 하기 농도로 수득했다: 0.25, 0.4, 0.5, 1, 2.5, 5, 10 및 25 ㎍/ℓ.
기질 짝지은 표준 용액
기질 효과의 발생을 모니터링했고, 두 화합물의 측정을 두 시료 물질에 대한 기질 짝지은 표준을 이용하여 확립했다.
중간 표준 용액으로부터의 희석은 용매 내 표준 용액의 제조에서와 동일했다 (대조군 시료의 최종 추출물인 희석 혼합물은 제외).
비고:
2.1.5 표준 용액의 안정성
약 5 ℃ 의 냉장고 내에서 빛으로부터 보호하면서 저장한 스톡 용액은 9 개월 반 동안 안정했다.
2.2 잔류물 분석 방법론
원 분석 방법과 비교되는 일부 수정안을 도입했다:
이 보고에 제시된 방법 수정안 00974/M001 은, 유도체화의 단계를 삭제하고, 분석 및 검출 모드를 변경하고, 원 방법 00974 의 정량화 한계 (LOQ) 를, 각각의 화합물에 대해 0.100 ㎎/㎏ 에서 0.050 ㎎/㎏ 으로 감소시키는 것으로 그 유효성이 검증되었다.
모든 수정 사항은 하기한 바에 포함되었다.
상기 방법의 흐름도가 부록 7 에 제공된다.
주: 분석 도중, 각각의 시료 세트에 대하여, 토양 시료가 없는 블랭크 시약에서 시료 제조에 기인한 아인산 오염이 확실히 발견되지 않도록 하는 것이 요구된다 (LOQ 의 30 % 미만).
비고: 표준 실험실 유리 소모품은 포스페이트를 포함하지 않는 세제로만 세정하고, 물 및 아세톤으로 헹구어내야 한다.
어떠한 오염도 피하기 위해서는, 1 회용 실험실 소모품을 사용하는 것이 매우 권장된다.
회수 실험을 위해, 계량 후 및 진탕 전에 시료 물질에 적당한 표준 용액을 첨가함으로써 시료를 강화했다.
양이온 수지의 제조:
1. 약 25 g 의 AG 50W-X8 수지를 1000 ㎖ 폴리프로필렌 병에 계량하며 담는다.
2. 약 500 ㎖ 의 물을 첨가한다.
3. 회전식 진탕기를 이용해 약 10 분 동안 진탕한다.
4. 상청액 물을 폐기한다.
5. 단계 2 내지 4 를 두 번째 시행한다.
6. 단계 2 내지 4 를 세 번째 시행한다.
7. 두 GF/A 여과기를 통과한 여액 잔류 물 및 수지를 폴리프로필렌 깔때기에 붓고, 사전에 물로 헹군다.
비고: 수지는 사용 바로 전 또는 미리 제조하고, 상온에서 저장하고, 사용 바로 전에 재-수화시켰다.
주의: 수지를 상기한 바와 같이 세정하지 않으면, 아인산 간섭이 관찰될 수 있다.
시료 제조:
1. 20.0 g 의 균질한 시료 물질을 계량하며 125 ㎖ 폴리프로필렌 병에 담는다.
주: 시료의 중량을 잔류물 계산에 사용함 (변수 중량시료 로 표시).
2. 30 ㎖ 의 암모니아 완충액을 첨가한다.
3. 회전식 진탕기를 이용하여 30 분 동안 상온에서 시료를 진탕한다.
4. 추출물을 대략 5 분 동안 원심분리한다 (3600 rpm - 5 ℃).
5. 포름산 0.5 % 로 산성화한 물 약 100 g 을 미리 계량해두었던 250 ㎖ 폴리프로필렌 병에 붓는다.
6. 상청액을 250 ㎖ 폴리프로필렌 병에 첨가한다.
7. 30 ㎖ 의 암모니아 완충액을 기저부에서 첨가한다.
8. 회전식 진탕기를 이용해 시료를 30 분 동안 진탕한다.
9. 추출물을 대략 5 분 동안 원심분리한다 (3600 rpm - 5 ℃).
10. 상청액을 250 ㎖ 폴리프로필렌 병에 붓는다.
11. 1 회용 파스퇴르 피펫을 이용해, 포름산 0.5 % 으로 산성화한 물로 200 g 이 되도록 보충한다. 이것이 추출물 A 이다 (참고로, pH 는 약 6.5 임).
주: 추출물 A 의 중량을 잔류물 계산에 사용함 (변수 중량추출물A 로 표시).
12. 미리 세정한 AG 50W-X8 수지의 3.0 g 를 계량하며 원뿔형 원심분리기 튜브에 담는다.
13. 1 회용 유리 피펫을 이용해, 추출물 A 의 분취량 5 ㎖ 를 원심분리기 튜브에 이동시킨다.
14. 회전식 진탕기를 이용해 시료를 10 분 동안 진탕한다.
15. 시료를 대략 5 분 동안 원심분리한다 (6000 rpm - 상온): 수득한 상청액은 추출물 B 에 해당한다 (참고로, pH 는 약 2.5 임).
주의: 상기 수지 처리의 단계는 좁은 H3PO3 피크 형상을 얻기 위해 필요하다.
16. 희석기를 이용해 (또는 상이한 방식으로) 포름산 0.5 % 으로 산성화한 물을 이용하여 추출물 B 를 10 배 희석한다. 이것이 최종 추출물이다 (참고로, pH 는 약 2.5 임).
17. LC/MS/MS 측정을 시작한다, 3.3 장.
18. 검정 곡선 밖의 농도에 기인하여 최종 추출물을 희석시킬 필요가 있는 경우: 포름산 0.5 % 으로 산성화한 물을 이용한다.
2.3 분석 및 장비 조건
최종 추출물을 고성능 액체 크로마토그래피에 주입하고, 전기분무 이온화 탄뎀 질량 분석기에 의해 검출했다.
용매 내 제조된 표준을 이용하여 외부 표준화에 의해 정량화를 수행했다.
이 방법의 유효성 검증의 과정에 이용되는 예시적 LC/MS/MS 조건은 3.3.1 장 및 3.3.2 장에 열거된다. 이들 조건은 요령집으로서 제공되며, 기타 HPLC-MS/MS 시스템에 채택되어야할 것이다.
2.3.1 HPLC 조건
장비: Binary pump Agilent 1100
자동 시료 주입기: CTC Analytics HTS PAL
컬럼: Hypercarb, 10O × 2.0 ㎜, 5 ㎛
예비컬럼: 무
주입 부피: 50 ㎕
컬럼 온도: 상온 (약 25 ℃)
이동상: 이소크라틱 모드: 55/45 (v/v) 메탄올 + 2 % 포름산/물 + 2 % 포름산
흐름 (컬럼): 200 ㎕/분
체류 시간: 아인산에 대하여 3.1 분, 그리고, 포세틸-Al 에 대하여 4.2 분.
비고:
2.3.2 MS / MS 조건
MRM (다중 반응 모니터링) 조건 하에서 네거티브 이온 모드로 작동되는 전기분무 인터페이스가 장착된 삼중-사중극자 질량 분석계 시스템상에서 실험을 수행했다.
예를 들어:
검출기: 삼중 사중극자 HPLC-MS/MS 질량 분석계, 예를 들어 Sciex Instruments, API 4000 시스템
공급원: TIS (터보 이온 분무)
온도: 650 ℃
스캔 유형: MRM-모드 (다중 반응 모니터링 모드)
극성: 네거티브 이온 모드
기체 흐름: 분무화 기체 공기 (GS1): 40
터보 기체 공기 (GS2): 60
커튼 기체 N2 (CUR): 15
충돌 기체 N2 (CAD): 6
충돌 에너지:
[표 31]: 사용된 수량자 이온을 위한 질량 분석계 스캔 매개변수. 사용된 상세 장비 세팅이 3.3.1 장 및 3.3.2 장에 제공된다. 장비 시스템 또는 장비 매개변수를 다양하게 하면 상이한 이온 변환 및 상이한 상대적 강도가 야기될 수 있다.
주: 질량 분석계 조건의 일부는 장비 특징이다. 분석 전에 분광계 조건을 유능한 작업자에 의해 최적화해야 한다.
MS/MS 및 LC 조건에 대한 세부사항이 부록 8 에 제공된다.
포세틸-Al 및 아인산에 대한 수량자 이온의 단편화 반응 경로가 도 1 및 도 2 에 도시된다.
[도 1]: 포세틸-Al 에 대하여 제안된 단편화 반응 경로.
[도 2]: 아인산에 대하여 제안된 단편화 반응 경로.
2.3.3 확인적 변환
시료 내에서의 일부 간섭 또는 오염을 확인 또는 배제하기 위해, 상기된 바와 동일한 조건에서 하기의 변환을 이용할 수 있었다:
포세틸-Al 및 아인산에 대한 확인적 변환을 위한 단편화 반응경로가 도 3 및 도 4 에 도시된다.
[도 3]: 포세틸-Al 에 대하여 제안된 단편화 반응 경로.
[도 4]: 아인산에 대하여 제안된 단편화 반응 경로.
주: 모든 회수 시료를 또한 확인적 변환을 이용하여 분석했다. 결과가 부록 9 에 제공된다.
2.4 검출기의 선형성
사용된 검출기의 선형성은 기질 짝지은 표준 및 용매 내 표준을 이용하여 포세틸-Al 및 아인산에 대하여 시험했다.
포세틸-Al 및 아인산의 표준을 0.25 내지 25 ㎍/ℓ 의 농도로 주입함으로써 선형성을 시험했다.
[표 32]: 검출기 선형성의 측정을 위해 준비된 표준 농도. LOQ 에 해당하는 농도는 진한 숫자로 제공된다.
2.5 추출물의 저장 안정성
이 연구에서는 포세틸-Al 및 아인산을 포함하는 시료 추출물의 안정성을 측정하지 않았다.
2.6 계산
2.6.1 잔류물의 계산
이 경우의 평가는, 용매 내 제조된 표준을 이용하여 외부 표준화에 따라 수행했다.
각각의 시료 세트의 분석시, 표 4 에 언급된 8 개의 표준 용액을 일시에 주입했다. 장비 반응에서의 임의의 소폭 변화를 보상하기 위해 시료로 표준에 변화를 주어야 한다.
각각의 화합물에 대하여, 피크 영역을 농도에 대하여 플로팅하여 1/x 가중 최소자승법의 선형 회귀에 의해 얻어지는 검정 곡선을 확립했다.
최종 추출물 내 농도를 측정하기 위한 상응 모델을 분석자 소프트웨어 (버전 1.4) 를 이용하여 계산했다.
각각의 최종 추출물을, 표준 용액에 대하여 앞서 기술한 바와 동일한 조건을 이용하여 일시에 주입했다.
미리 확립된 예측 수학 모델을 이용하여, 각각의 화합물의 최종 농도 (㎍/ℓ) 를 각각의 주입에 대하여 측정했다.
각각의 화합물에 대하여, 하기 화학식을 이용해 잔류물의 양 R (mg/㎏ 으로 표시) 을 계산했다:
식 중:
R: 토양 시료 내 포세틸-Al 또는 아인산 잔류물의 측정량 (mg/㎏),
C: 분석된 추출물 내에서 발견된 포세틸-Al 또는 아인산의 농도 (㎍/ℓ),
중량추출물A: 추출물 A 의 중량 (g), 여기서는 200 g,
밀도-1: 1 ㎖/g,
D: 최종 추출물을 수득하기 위한 희석 인자, 여기서는 10,
중량시료: 분석 시료의 시료 중량 (g), 여기서는 20 g.
비고:
2.6.2 회수율의 계산
각각의 화합물의 농도 (㎍/ℓ) 를 상기 2.6.1 장에 따라 회수 시료에 대하여 측정했다.
이후, 회수율의 백분율을 다음과 같이 계산했다:
식 중:
Rec: 강화된 시료 내에서 발견된 회수량 (%),
C: 분석된 추출물 내에서 발견된 포세틸-Al 또는 아인산의 농도 (㎍/ℓ),
A: 포세틸-Al 또는 아인산의 강화량 (㎍/ℓ).
2.6.3. 상대적 표준 변동 ( RSD ) 의 계산
RSD 를 다음과 같이 계산했다:
RSD (%) = S.D./평균 회수 × 100 %
Ri: 회수,
Rm: 평균 회수,
n: 회수의 횟수.
3 결과 및 토의
3.1 특이성 및 선택도
상기 방법은 토양 시료 내에서의 포세틸-Al 및 이의 대사물 (아인산) 을 측정해준다.
상기 방법의 특이성은 매우 선택적인 MS/MS 검출과 병용된 HPLC 분리의 결과이다.
3.2 대조군 시료 내에서의 외견상의 잔류물
German 토양 
및 Laacher Hof 의 두 가지를 이용하여 방법의 유효성을 검증했다.
두 상이한 토양을 사용하여, 상이한 토양 특징의 가능한 영향을 평가했다. 토양 시료를 DIN 및/또는 USDA 명세서에 따라 분류했다. 사용된 토양의 토양 특징이 표 33 에 요약된다.
토양 특징 전부가 부록 10 에 보고된다.
[표 33]: 토양 유형
| 토양 | 토성 (Texture of Soil) | 유기물 [%] |
 |
미사질양토 (USDA) | 1.58 |
| Laacher Hof | 사양토 (USDA) | 2.06 |
대조군 시료 내에서의 잔류물 수준 추산을 수행했다. 결과가 표 34 에 열거된다. 모든 대조군 시료에서의 외견상의 잔류물이 각각의 화합물에 대한 LOQ 의 20 % 미만, 즉, 0.01 ㎎/㎏ 미만이었다.
[표 34]: 비처리 대조군 시료 내 포세틸-Al 및 아인산에 대한 외견상의 잔류물
| 시료 물질 |
LOQ [mg/㎏] | 외견상의 잔류물 | ||
| 포세틸-Al | 아인산 | 포세틸-Al | 아인산 | |
 |
0.05 | 0.05 | < 10 % LOQ | < 20 % LOQ |
| Laacher Hof | 0.05 | 0.05 | < 10 % LOQ | < 10 % LOQ |
3.3 검출기의 선형성 및 기질 효과
사용된 검출기의 선형성은 기질 짝지은 표준 및 용매 내 표준을 이용하여 포세틸-Al 및 아인산에 대하여 시험했다.
포세틸-Al 및 아인산의 표준을 0.25 내지 25 ㎍/ℓ 의 농도로 주입함으로써 선형성을 시험했다.
실험의 세부 사항은 2.4 장에서 볼 수 있다.
각각의 크로마토그램에서, 포세틸-Al 또는 아인산의 측정된 피크 영역을 각각의 표준 용액에 함유된 포세틸-Al 또는 아인산의 해당 농도에 대하여 각각 플로팅하여, 다음과 같은 형태의 검정 곡선을 얻었다:
y =
ax
+ b (1/x 가중)
식 중:
y = 피크 영역,
x = 주입된 표준 용액 내 농도.
LC/MS/MS 에 있어서의 검출기 반응의 측정의 결과가 표 35 에 요약된다.
[표 35]: LC/MS/MS 에 있어서의 검출기 선형성의 측정의 요약.
| 검출 | 변수 | 포세틸-Al | 아인산 |
| LC/MS/MS |
직선형 범위 [㎍/ℓ] | 0.25 ~ 25 | 0.25 ~ 25 |
| 농축 횟수 | 7 또는 8 | 7 또는 8 | |
| 주입 횟수 | 1 | 1 | |
| 모델 | 1/x 가중 선형 회귀 | 1/x 가중 선형 회귀 | |
| 용매 내 표준을 위한 상관 계수 (R) |
0.9999 | ≥0.9996 | |
| 기질 짝지은 표준을 위한 상관 계수 (R) |
≥0.9997 | 0.9999 |
용매 내 제조된 표준 또는 기질 짝지은 표준을 이용할 때, 두 화합물에 대하여 0.25 내지 25 ㎍/ℓ 범위의 표준에서, 분석대상물의 주입 양과 LC/MS/MS 의 검출기 반응 사이의 우수한 선형 상관관계가 관찰되었다.
기질 효과의 발생을 모니터링했다.
결과가 표 36 및 표 37 에 도시된다.
[표 36]: 포세틸-Al 에 대한 기질 효과 평가, FL: 강화 수준
[표 37]: 아인산에 대한 기질 효과 평가, FL: 강화 수준
상기 두 표 36 및 37 에 나타난 결과는 하기 사항을 보여준다:
- 포세틸-Al 의 측정은, 용매 내에서 제조된 표준이 이용되어 확립된 경우, 또는 기질 짝지은 표준이 이용되어 확립된 경우에서 큰 차이가 관찰되지 않았다;
- 아인산의 측정은, 기질 짝지은 표준이 이용된 경우 대신 용매 내에서 제조된 표준이 이용되어 확립된 경우가 더 개선되었다 (더 높은 평균 회수 및 더 낮은 RSD 확인).
이러한 모든 이유로 인해, 용매 내에서 제조된 표준을 이용하는 것이 권장된다.
3.4 정량화 한계 및 회수 실험
정량화 한계 (LOQ) 는, 70 내지 110 % 범위 내의 평균 회수와 20 % 이하의 RSD 를 얻을 수 있는 최저 강화 수준으로 정의했다. LOQ 는 토양 시료 내 각각 의 화합물에 대하여 0.050 ㎎/㎏ 으로 정해졌다.
이들 기질을 위한 방법의 유효성을 검증하기 위해, 분석 전에 대조군 시료를 정해진 양의 포세틸-Al 및 아인산으로 강화했다.
3.5 회수율
얻어진 상세 회수 결과가 표 38 및 표 39 에 열거된다.
표 38 및 39 에 제공된 모든 결과는, 용매 내에서 제조된 표준 및 수량자 이온을 이용하여 얻은 것이다 (3.3.2 장 참조). 확인적 변환을 이용해 얻은 결과가 부록 9 에 제공된다.
[표 38]: 포세틸-Al 에 대하여 얻어진 회수율, RSD: 상대적 표준 변동
| 강화 [mg/㎏] |
토양 | 단일값[%] |
평균 [%] |
RSD [%] |
||||
| 0.05 |
 |
75 | 71 | 70 | 72 | 73 | 72 | 2.7 |
| 0.05 | Laacher Hof | 70 | 72 | 71 | 74 | 70 | 71 | 2.3 |
| 모든 0.05 ㎎/㎏ 단일값들의 평균 | 72 | 2.4 | ||||||
| 0.5 |
 |
79 | 79 | 79 | 77 | 78 | 78 | 1.1 |
| 0.5 | Laacher Hof | 80 | 80 | 79 | 78 | 81 | 80 | 1.4 |
| 모든 0.5 ㎎/㎏ 단일값들의 평균 | 79 | 1.5 | ||||||
모든  |
75 | 4.7 | ||||||
| 모든 Laacher Hof 시료의 평균 | 76 | 6.0 | ||||||
| 전체 평균 | 75 | 5.3 | ||||||
[표 39]: 아인산에 대하여 얻어진 회수율, RSD: 상대적 표준 변동
| 강화 [mg/㎏] |
토양 | 단일값[%] |
평균 [%] |
RSD [%] |
||||
| 0.05 |
 |
95 | 90 | 87 | 91 | 91 | 91 | 3.2 |
| 0.05 | Laacher Hof | 98 | 80 | 82 | 81 | 81 | 84 | 9.0 |
| 모든 0.05 ㎎/㎏ 단일값들의 평균 | 88 | 7.3 | ||||||
| 0.5 |
 |
87 | 84 | 86 | 82 | 84 | 85 | 2.3 |
| 0.5 | Laacher Hof | 84 | 83 | 84 | 83 | 87 | 84 | 2.0 |
| 모든 0.5 ㎎/㎏ 단일값들의 평균 | 84 | 2.0 | ||||||
모든  |
88 | 4.6 | ||||||
| 모든 Laacher Hof 시료의 평균 | 84 | 6.2 | ||||||
| 전체 평균 | 86 | 5.6 | ||||||
얻어진 회수율이 하기 표 40 에 요약된다.
각각의 화합물에 대하여 회수율을 총 20 회 측정했다.
[표 40]: 정확성 및 반복성 측정에서의 회수 데이터의 요약, RSD: 상대적 표준 변동
| 매개변수 | 포세틸-Al | 아인산 | n 값의 수 | |
| 정확성 |
단일 회수 [%] | 70 ~ 81 | 80 ~ 98 | 20 |
| 강화 수준당 평균 회수 [%] | 72 ~ 79 | 84 ~ 88 | 10 | |
| 시료 물질당 평균 회수 [%] | 75 ~ 76 | 84 ~ 88 | 10 | |
| 전체 평균 [%] | 75 | 86 | 20 | |
| 반복성 |
강화 수준당 RSD [%] | 1.5 ~ 2.4 | 2.0 ~ 7.3 | 10 |
| 시료 물질당 RSD [%] | 4.7 ~ 6.0 | 4.6 ~ 6.2 | 10 | |
| 전체 RSD [%] | 5.3 | 5.6 | 20 |
상기 표는 하기 사항을 보여준다:
단일 회수율은 포세틸-Al 에 대하여는 70 ~ 81 % 범위, 그리고, 아인산에 대하여는 80 내지 98 % 범위였다. 모든 평균 회수율은 70 내지 110 % 범위였다.
모든 RSD 는 20 % 보다 꽤 낮았다.
4. 평가 및 논의
제시되는 잔류물 분석 방법 수정안 00974/M001 은 토양 내 포세틸-Al 및 이 의 대사물 (아인산) 의 잔류물의 LC/MS/MS 에 의한 측정용으로 유효성이 검증되었다.
포세틸-Al 및 이의 대사물 (아인산) 의 잔류물은 암모니아 완충액과 진탕함으로써 토양 시료로부터 추출했다. 이후, 이 추출물을 양이온 수지로 처리하고, LC/MS/MS 에 의한 분석 전에 최종 희석했다. 전기분무 이온화 탄뎀 질량 분석기에 의해 검출하고 Hypercarb 컬럼을 이용하는 HPLC 에 의해 잔류물을 정량화했다. 정량화는 순수 용매 내 표준으로 외부 표준화에 의해 수행했다.
유효성 검증용 세트는 검출기 선형성의 측정, 정량화 한계 및 방법의 정확성을 포함했다.
사용된 검출기의 선형성은 기질 짝지은 표준 및 용매 내 표준을 이용하여 포세틸-Al 및 아인산에 대하여 시험했다.
포세틸-Al 및 아인산의 표준을 0.25 내지 25 ㎍/ℓ 의 농도로 주입함으로써 선형성을 시험했다. 검출기 반응은 이러한 범위에서 선형적이었다.
기질 효과의 발생을 모니터링했다.
- 포세틸-Al 의 측정은, 용매 내에서 제조된 표준이 이용되어 확립된 경우, 또는 기질 짝지은 표준이 이용되어 확립된 경우에서 큰 차이가 관찰되지 않았다;
- 아인산의 측정은, 기질 짝지은 표준이 이용된 경우 대신 용매 내에서 제조된 표준이 이용되어 확립된 경우가 더 개선되었다 (더 높은 평균 회수 및 더 낮은 RSD 확인).
이러한 모든 이유로 인해, 용매 내에서 제조된 표준을 이용하는 것이 권장된다.
모든 대조군 시료에서의 외견상의 잔류물이 각각의 화합물에 대한 LOQ 의 20 % 미만, 즉, 0.01 ㎎/㎏ 미만이었다.
정량화 한계 (LOQ) 는, 70 내지 110 % 범위 내의 평균 회수와 20 % 이하의 RSD 를 얻을 수 있는 최저 강화 수준으로 정의했다. LOQ 는 토양 시료 내 각각의 화합물에 대하여 0.050 ㎎/㎏ 으로 정해졌다.
방법의 정확성은 측정된 회수율을 근거로 평가할 수 있었다.
단일 회수율은 포세틸-Al 에 대하여 70 내지 81 %, 그리고, 아인산에 대하여 80 내지 98 % 의 범위였다. 모든 평균 회수율은 70 내지 110 % 의 범위였다. 방법의 정확성은, 각각의 강화 수준에 대한 평균 회수가 70 ~ 110 % 범위여야 함을 요구하는 잔류물 분석 방법을 위한 요건을 충족시켰다.
방법의 정밀성 및 반복성은, 회수율의 평균값에 대하여 측정된 상대적 표준 변동 (RSD) 을 근거로 평가할 수 있었다. 모든 RSD 는 20 % 보다 꽤 낮았다. 따라서, 방법의 정밀성 및 반복성이 허용될 수 있었다.
상기 방법의 유효성 검증의 모든 결과는 잔류물 분석 방법의 일반적 요건을 따랐고, 이에 따라 이 방법 수정안의 유효성이 성공적으로 검증되었다.
주: 분석 도중, 각각의 시료 세트에 대하여, 토양 시료가 없는 블랭크 시약에서 시료 제조에 기인한 아인산 오염이 확실히 발견되지 않도록 하는 것이 요구된다 (LOQ 의 30 % 미만).
비고:
어떠한 오염도 피하기 위해서는, 1 회용 실험실 소모품을 사용하는 것이 매우 권장된다.
부록 7
잔류물 방법 00974/M001 의 흐름도
부록 8
LC-MS/MS 조건의 세부 사항
코멘트:
동기화 모드: LC Sync
자동-평형: Off
수집 시간: 10 분 1 초
스캔 횟수: 455
기록 기간: 1
수집 모듈: Acquisition Method
소프트웨어 버전: Analyst 1.4
MS 방법 특성:
기간 1:
---------
기간 내 스캔: 455
상대적 시작 시간: 0.00 밀리초
기간 내 실험: 1
기간 1 실험 1:
-------------------
스캔 유형: MRM (MRM)
극성: 네거티브
스캔 모드: N/A
이온 공급원: 터보 분무
해상도 Q1: 유닛
해상도 Q3: 유닛
세기 한계값: 0.00 cps
안정 시간: 0.0000 밀리초
MR 중단: 5.0070 밀리초
MCA: No
단계 크기: 0.00 amu
수량자 변환:
| Q1 질량 (amu) |
Q3 질량 (amu) |
체류 (밀리초) |
매개변수 | 시작 | 정지 |
| 80.90 | 78.90 | 400.00 | DP | -55.00 | -55.00 |
| (아인산) |
CE | -22.00 | -22.00 | ||
| CXP | -5.00 | -5.00 | |||
| Q1 질량 (amu) |
Q3 질량 (amu) |
체류 (밀리초) |
매개변수 | 시작 | 정지 |
| 108.90 | 80.90 | 200.00 | DP | -45.00 | -45.00 |
| (포세틸-Al) |
CE | -16.00 | -16.00 | ||
| CXP | -1.00 | -1.00 | |||
확인적 변환:
| Q1 질량 (amu) |
Q3 질량 (amu) |
체류 (밀리초) |
매개변수 | 시작 | 정지 |
| 80.90 | 62.90 | 400.00 | DP | -55.00 | -55.00 |
| (아인산) |
CE | -38.00 | -38.00 | ||
| CXP | -1.00 | -1.00 | |||
| Q1 질량 (amu) |
Q3 질량 (amu) |
체류 (밀리초) |
매개변수 | 시작 | 정지 |
| 108.90 | 62.90 | 300.00 | DP | -45.00 | -45.00 |
| (포세틸-Al) |
CE | -38.00 | -38.00 | ||
| CXP | -5.00 | -5.00 | |||
매개변수 표 (기간 1 실험 1):
CAD: 6.00
CUR: 15.00
GS1: 40.00
GS2: 60.00
TEM: 650.00
ihe: ON
IS: -4500.00
EP -10.00
Agilent 1100 LC Pump 방법 특성:
펌프 모델: Agilent 1100 LC Binary Pump
최소 압력 (psi): 0.0
최대 압력 (psi): 5801.0
무용 부피 (㎕): 40.0
최대 흐름 램프 (㎖/분2):100.0
최대 압력 램프 (psi/초):290.0
단계표:
| 단계 | 총 시간 (분) | 유속 (㎕/분) | A (%) | B (%) |
| 0 | 0.00 | 200 | 55.0 | 45.0 |
| 1 | 10.00 | 200 | 55.0 | 45.0 |
좌측 압축성: 50.0
우측 압축성: 115.0
좌측 무용 부피 (㎕): 40.0
우측 무용 부피 (㎕): 40.0
좌측 스트로크 부피 (㎕): -1.0
우측 스트로크 부피 (㎕): -1.0
좌측 용매: A1 (메탄올 + 2 % 포름산)
우측 용매: B2 (물 + 2 % 포름산)
CTC PAL Autosampler 방법 특성:
루프 부피l (㎕): 50
루프 부피2 (㎕): 100
주입 부피 (㎕): 100.000
방법 설명:
시린지: 25O ㎕
Analyst LC-Inj
공기 부피 (㎕) 0
용매 1 로 전 세정 () 2
용매 2 로 전 세정 () 1
시료로 전 세정 () 0
충전 속도 (㎕/s) 50
충전 스트로크 () 0
주입 위치 LC Vlv1
주입 속도 (㎕/s) 50
전 주입 지연 (ms) 500
후 주입 지연 (ms) 500
용매 1 로 후 세정 () 3
용매 2 로 후 세정 () 2
용매 1 로 밸브 세정 () 2
용매 2 로 밸브 세정 () 1
| 가스 압력 |
자동 시료 주입기 CTC 분석 HTS Pal (no 1303) |
|||
| N2 | 4 바 | 펠티에 레크 | 10 ℃ | |
| 공기 GS1/GS2 가스 | 7 바 | 세정 용매 1: H2O + 0.5 % HCOOH | ||
| 공기 배스 가스 | 4 바 | 세정 용매 2:MeOH | ||
| 펌프 | ||||
| 분석 LC 펌프: | ||||
| Binary 1 pump Agilent 1100 (GLP no 1296): |
||||
| A1 = 메탄올 + 2 % 포름산 | 사용된 Valco 밸브 | 사용된 컬럼 선택자 | ||
| B2 = H2O + 2 % 포름산 | GLP no1289 | GLP no 1356 | ||
| 공급원 GLP no 1291 |
||||
| 프로브 터보이온분무 GLP no 1288 |
||||
| 보충 용매용 펌프: | ||||
| 수평 위치 | 7 (x 축) | |||
| 수직 위치 | 7 (y 축) | |||
| 모세관 출구 | 1 ㎜ | |||
| 질량 분광계 API 4000 | ||||
| Device GLP no | 1292 | |||
| Binary 1 pump Agilent 1100 (no 1297) | ||||
| A2 = H2O + 2 % 포름산 | 컬럼: | 실온에서 | ||
| B2 = 아세토니트릴 | 예비컬럼: | 무 | ||
| Column: SMAR 68-1 Thermo Hypercarb 100 ×2.0 ㎜ 5 ㎛ |
||||
부록 9
확인적 변환으로 얻어진 결과
표 41 및 42 에 제공된 모든 결과는 용매 내에서 제조된 표준을 이용하여 얻은 것이다.
[표 41]: 포세틸-Al 에 대하여 얻어진 회수율, RSD: 상대적 표준 변동
| 강화 [mg/㎏] |
토양 | 단일값[%] |
평균 [%] |
RSD [%] |
||||
| 0.05 |
 |
77 | 73 | 72 | 76 | 74 | 74 | 2.8 |
| 0.05 | Laacher Hof | 72 | 72 | 76 | 76 | 74 | 74 | 2.7 |
| 모든 0.05 ㎎/㎏ 단일값들의 평균 | 74 | 2.6 | ||||||
| 0.5 |
 |
79 | 79 | 80 | 76 | 78 | 78 | 1.9 |
| 0.5 | Laacher Hof | 80 | 80 | 79 | 79 | 81 | 80 | 1.0 |
| 모든 0.5 ㎎/㎏ 단일값들의 평균 | 79 | 1.7 | ||||||
모든  |
76 | 3.6 | ||||||
| 모든 Laacher Hof 시료의 평균 | 77 | 4.4 | ||||||
| 전체 평균 | 77 | 3.9 | ||||||
[표 42]: 아인산에 대하여 얻어진 회수율, RSD: 상대적 표준 변동
| 강화 [mg/㎏] |
토양 | 단일값[%] |
평균 [%] |
RSD [%] |
||||
| 0.05 |
 |
92 | 87 | 85 | 87 | 85 | 87 | 3.3 |
| 0.05 | Laacher Hof | 87 | 75 | 78 | 73 | 79 | 78 | 6.8 |
| 모든 0.05 ㎎/㎏ 단일값들의 평균 | 83 | 7.4 | ||||||
| 0.5 |
 |
86 | 85 | 85 | 81 | 84 | 84 | 2.3 |
| 0.5 | Laacher Hof | 83 | 83 | 83 | 82 | 86 | 83 | 1.8 |
| 모든 0.5 ㎎/㎏ 단일값들의 평균 | 84 | 2.0 | ||||||
모든  |
86 | 3.3 | ||||||
| 모든 Laacher Hof 시료의 평균 | 81 | 5.6 | ||||||
| 전체 평균 | 83 | 5.3 | ||||||
확인적 변환으로 상기 얻어진 모든 결과는 유럽 요구 사항에 응했다.
부록 10
토양 특징
 |
0 ~ 30 cm 토양층 |
| pH (CaCl2 용액 내) | 6.7 |
| pH (H2O 내) | 7.4 |
| 유기 탄소 [%] | 0.92 |
| 유기물 [%]* | 1.58 |
| 양이온 교환 용량 [meq/100 g 의 건조 토양] | 12.4 |
| 최대 보수력 [g/100 g 의 건조 토양] | 39.4 |
| USDA 에 따른 텍스쳐 설명 | |
| 부분 [%] | |
| 점토 (< 0.002 ㎜) | 19.4 |
| 미사 (< 0.002 ~ 0.050 ㎜) | 76.3 |
| 모래 (< 0.050 ~ 2.000 ㎜) | 4.3 |
| 토양 유형: 미사질양토 | |
| * 유기물 = 유기 탄소 × 1.72 | |
Laacher Hof 토양
| Laacher Hof 토양, 플롯 712/718: | 0 ~ 30 cm 토양층 |
| pH (CaCl2 용액 내) | 6.8 |
| pH (H2O 내) | 7.4 |
| 유기 탄소 [%] | 1.20 |
| 유기물 [%]* | 2.06 |
| 양이온 교환 용량 [meq/100 g 의 건조 토양] | 9.8 |
| 최대 보수력 [g/100 g 의 건조 토양] | 37.9 |
| USDA 에 따른 텍스쳐 설명 | |
| 부분 [%] | |
| 점토 (< 0.002 ㎜) | 12.0 |
| 미사 (< 0.002 ~ 0.050 ㎜) | 18.3 |
| 모래 (< 0.050 ~ 2.000 ㎜) | 69.7 |
| 토양 유형: 사양토 | |
| * 유기물 = 유기 탄소 × 1.72 | |
Claims (45)
- 하기 단계를 포함하는, 시료 내에 0.00005 ㎎/㎏ 미만 또는 이와 동일한 양으로 존재하는 아인산 및 포세틸-Al 의 직접적인 동시 분석 방법:- 시료의 제조;- 제조된 시료의 임의 희석;- 임의 희석된 시료의 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)/탄뎀 질량 분석기 (MS/MS) 에 의한 직접 분석으로서, 고성능 액체 크로마토그래피가, 0.5% 이하의 포름산을 함유하는, 메탄올 (35% 내지 55%, v/v) 및 물 (45% 내지 65%, v/v) 로 이루어지고, 일정용매 조성법 (isocratic mode) 에 채용된 이동상을 이용하여 수행됨.
- 제 1 항에 있어서, 시료가 식물 조직; 물; 토양; 동물 제품 또는 조직; 공기; 농식품 제품, 및 혈액 및 소변과 같은 인간 체액으로부터 선택되는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 시료가 수분 함량이 높은 식물 기질, 산성 pH 의 식물 기질, 건조한 식물 기질, 지방성 식물 기질; 광천수, 지하수, 수돗물 또는 지표수; 우유, 달걀, 간, 신장, 지방, 근육; 전환된 농식품 제품 (converted agrofood product); 혈액 및 소변과 같은 인간 체액으로부터 선택되는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 제조가 식물 조직; 토양; 동물 제품 또는 조직 및 전환된 농식품 제품에 대한 추출; 물에 대한 임의적 농축 및 공기의 트래핑 (trapping) 으로부터 선택되는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 제조된 시료의 희석으로 이루어지는 단계를 포함하는 방법.
- 제 5 항에 있어서, 희석이 산성화될 수 있는 수성 용매 내에서, 또는 산성화될 수 있는 유기 용매 내에서, 또는 상기 용매의 혼합물 내에서 수행되는 방법.
- 제 6 항에 있어서, 수성 용매가 포름산, 아세트산 또는 트리플루오로아세트산으로부터 선택되는 산을 포함하거나, 또는 유기 용매가 아세토니트릴 또는 메탄올로부터 선택되는 방법.
- 삭제
- 제 7 항에 있어서, 시료가 식물 조직으로부터 선택되고, 이동상이 0.5% 의 포름산을 함유하는, 35% (v/v) 메탄올 및 65% (v/v) 물로 이루어진 방법.
- 제 7 항에 있어서, 시료가 물 또는 토양으로부터 선택되고, 이동상이 0.2% 포름산을 함유하는 55% (v/v) 메탄올 및 0.2% 포름산을 함유하는 45% (v/v) 물로 이루어진 방법.
- 제 9 항에 있어서, 정량화 한계가 0.1 mg/kg 의 아인산 및 0.001 mg/kg 의 포세틸-Al 인, 아인산 및 포세틸-Al 의 직접적인 동시 분석 방법.
- 제 10 항에 있어서, 물 시료의 경우 정량화 한계가 0.0001 mg/kg 의 아인산 및 0.0001 mg/kg 의 포세틸-Al 인, 아인산 및 포세틸-Al 의 직접적인 동시 분석 방법.
- 제 10 항에 있어서, 토양 시료의 경우 정량화 한계가 0.05 mg/kg 의 아인산 및 0.05 mg/kg 의 포세틸-Al 인, 아인산 및 포세틸-Al 의 직접적인 동시 분석 방법.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
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|---|---|---|---|
| EP05356015.7 | 2005-01-25 | ||
| EP05356015A EP1684068A1 (fr) | 2005-01-25 | 2005-01-25 | Méthode d'analyse de composés pesticides |
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| EP05356031.4 | 2005-02-11 | ||
| EP05356216.1 | 2005-12-16 | ||
| EP05356216 | 2005-12-16 | ||
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|---|---|---|---|
| KR1020077019301A KR101276987B1 (ko) | 2005-01-25 | 2006-01-23 | 아인산, 포세틸-ａｌ 또는 두 가지 모두의 동시적 분석방법 |
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