CN109001362A - 分散固相萃取-液相色谱-质谱/质谱法同时测定蜂王浆中双甲脒及代谢产物残留量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及蜂王浆中双甲脒及其3种代谢产物残留量测定的方法，尤其涉及分散固相萃取‑液相色谱‑质谱/质谱法同时测定蜂王浆中双甲脒及其代谢产物残留量的方法。该方法在试样中加入pH=9的缓冲溶液稀释后用乙腈、氯化钠沉淀蛋白、提取、盐析，通过含有N‑丙基乙二胺（PSA）、无水硫酸镁和C18粉末的吸附剂进行分散固相萃取对提取液进行净化，采用液相色谱‑质谱/质谱仪检测，同位素内标稀释内标法定量。该方法绿色友好、简便快捷，消耗资源小，检测成本低，方法灵敏度能满足蜂王浆中双甲脒及其代谢产物残留量的检测和确证要求。

Description

分散固相萃取-液相色谱-质谱/质谱法同时测定蜂王浆中双 甲脒及代谢产物残留量的方法

技术领域

本发明涉及蜂王浆中双甲脒及其代谢产物残留量测定的方法，尤其涉及一种分散固相萃取-液相色谱-质谱/质谱法同时测定蜂王浆中双甲脒、单甲脒2,4-二甲基苯基甲酰胺和2,4-二甲基苯胺残留量的方法。

背景技术

蜂王浆(royal jelly)，是蜜蜂巢中培育幼虫的青年工蜂咽头腺的分泌物，也是供给将要变成蜂王的幼虫的食物和蜂王终身的食物。研究发现，蜂王浆就像哺乳动物的乳汁极具营养价值和免疫功能而且含有极高的长寿因子。营养学家认为蜂王浆是一种可供人类直接服用的高活性成分的超级营养食品。近些年研究表明，蜂王浆具有辅助降低血糖，抗氧化，降低血脂，控制血管扩张，降低血压，保护肝脏，抗菌消炎以及提高免疫力抗衰老等医疗和保健的功效，因此越来越受到人们的关注与欢迎。

中国是世界蜂王浆第一生产国，也是第一出口国，世界上90％以上的蜂王浆来自于中国，主要出口国家和地区有日本，欧盟和美国等发达国家和经济体。蜂王浆也是除蜂蜜外最具市场竞争力和高附加值的蜂产品。伴随着人民生活水平的提高，对蜂王浆质量要求也在不断的提高。蜂王浆中药物残留情况一直是消费者除营养成分外的主要关注点，我国药物和抗生素曾经的滥用情况较为突出，蜂蜜等蜂产品中氯霉素等的药物检出曾对其出口造成严重的不利影响。

双甲脒(Amitraz)，又称N,N-双(2,4-二甲苯亚氨基甲基)甲胺，是一种有机氮杀虫、杀螨剂，其具有触杀和熏蒸作用，对叶螨科各发育阶段的虫态都有效。因此广泛用于果树、蔬菜、茶叶、棉花、大豆、甜菜等作物防治多种害螨，对同翅目害虫也具有良好药效，还可以用于防治蚜虫、棉铃虫、红铃虫等害虫。对牛、羊、猪等家畜体外寄生螨也有效，可以防治体虱、壁虱、疥癣和恙虫等，在蜂蜜养殖中对蜂螨有较好的防治效果，且对蜜蜂属于低毒性，因此曾被广泛用于蜂巢除螨。根据双甲脒的化学性质，其可发生代谢或降解，先形成单甲脒(N-2,4-Dimethyl phenyl-N-methylformamidine，DMPF)、2,4-二甲基苯基甲酰胺(N-(2,4-DiMethylphenyl)formamide，DMF)，最终降解为2,4-二甲基苯胺(2,4-Dimethylaniline，DMA)。其中单甲脒既是双甲脒的一个代谢产物，其自身也是杀螨剂，能防治抗三氯杀螨醇的螨，杀螨卵、若螨和成螨，对棉红铃虫、水稻三化螟和二化螟也有一定活性。单甲脒在防治柑橘、苹果、棉花等作物上的螨，对瓢虫、草蛉、食虫蝽象、食螨瓢虫、棉田蜘蛛、蜜蜂、家蚕比较安全，其毒性较双甲脒要低。2,4-二甲基苯胺在化工合成中通常作为单甲脒和双甲脒的合成原料而被使用，但研究表明2,4-二甲基苯胺具有毒副作用和致突变性，对肝脏的损伤较大。

通过食物链传播或直接在蜂巢中使用双甲脒后，所产生的蜂王浆比较容易被双甲脒及其代谢产物污染，进而影响消费者的身体健康，如表1所示，各国纷纷制定双甲脒在蜂产品中(以蜂蜜居多)的最低限量，来保证其的质量安全。

表1主要国家和经济体对蜂产品中双甲脒的限量要求

韩国等国家虽然在蜂王浆中并未明确规定双甲脒的限量要求，但在猪肉等其他动物源性产品以及果蔬产品中双甲脒的最低限量都有明确规定，我国在出口蜂王浆的残留监控中也明确要求双甲脒不得检出(同时检测代谢产物)。

基于双甲脒的稳定性以及代谢情况和检测手段的限制，目前食品中双甲脒残留量的测定通常是将样品进行通过酸、碱环境下高温水解后对最终代谢产物2,4-二甲基苯胺进行测定，再数学转化成双甲脒的含量。其中以气相色谱法或者气相色谱-质谱法为主。

例如：GB 29707-2013《牛奶中双甲脒残留标志物残留量测定气相色谱法》用氢氧化钠溶液提取，水解成2,4-二甲基苯胺，液-液萃取，七氟丁酸衍生后气相色谱-电子捕获检测法检测，方法测定低限5ug/kg。与之类似，目前发布的检测标准中GB/T 5009.143-2003《蔬菜、水果、食用油中双甲脒残留量的测定》和农业部1163号公告-3-2009《动物性食品中双甲脒残留标示物检测气相色谱法》等均采用水解后测定最终水解产物2,4-二甲基苯胺来完成对双甲脒含量的测定。

对蜂产品中双甲脒或其代谢产物残留量的测定主要集中在蜂蜜的检测中，蜂王浆的测定较少。也有研究人员直接对双甲脒的残留情况进行测定，从而获得其单体的残留含量，但该检测方式忽略了双甲脒降解转化的部分含量。

例如：GB/T 21169-2007《蜂蜜中双甲脒及其代谢产物残留量测定-液相色谱法》对蜂蜜样品中的双甲脒及其代谢产物用正己烷-异丙醇混合溶剂提取，依次用乙腈、水定容，HPLC进行测定，实现对蜂蜜中双甲脒和最终代谢产物2,4-二甲基苯胺的测定，方法定量限双甲脒0.01mg/kg，2,4-二甲基苯胺0.02mg/kg。徐锦忠等采用混合溶剂提取-液液萃取的前处理方法，液相色谱-质谱/质谱法测定蜂蜜中双甲脒和最终代谢产物2,4-二甲基苯胺的测定，方法测定低限5ug/kg(双甲脒)和10ug/kg(双甲脒)。

伴随着液相色谱-质谱/质谱法的广泛应用，为充分发挥其定量优势，研究人员陆续将双甲脒及其代谢产物检测的方式进行拓展，应用液相色谱-质谱/质谱法对其在环境水、水果中的残留量进行测定，实现对化合物有效分离和确证的定性与定量分析。

例如：郭浩等采用固相萃取/液相色谱-串联质谱法测定了鱼塘水中双甲脒及其代谢产物，方法对水样直接进行固相萃取净化，实现对双甲脒、单甲脒2,4-二甲基苯基甲酰胺和2,4-二甲基苯胺的测定，方法定量限0.4-1.0ng/L。同时他也对血液样品进行稀释后直接通过固相萃取净化，实现对血液中双甲脒、单甲脒2,4-二甲基苯基甲酰胺和2,4-二甲基苯胺的测定。Nilgun Tokmana等采用乙酸乙酯提取-液相色谱串联质谱测定的方法实现了对梨样品中双甲脒、单甲脒2,4-二甲基苯基甲酰胺和2,4-二甲基苯胺的测定，方法测定低限10ug/kg。

对于蜂王浆中双甲脒及其代谢产物的测定，目前仅有GB 23200.103-2016《蜂王浆中双甲脒及其代谢产物残留量的测定气相色谱-质谱法》和周召千等发表的文章《动物源产品中双甲脒及其代谢产物残留量的气相色谱-质谱法测定》有报道，该方法均采用加酸水解，碱化后用正己烷-乙醚(2+1，体积比)混合溶剂提取，酸、碱液-液分配净化，采用气相色谱-质谱仪检测最终水解产物2,4-二甲基苯胺，方法测定低限0.01mg/kg。

为此申请人申请了中国发明专利申请(申请号：201710308821.5)公开了一种液相色谱-质谱/质谱法测定蜂王浆中双甲脒及其代谢产物残留量的方法，该方法试样加氨化水稀释后用氨化乙腈沉淀蛋白并提取，通过中性氧化铝固相萃取柱对提取液进行净化，采用液相色谱-质谱/质谱仪检测，双甲脒和2,4-二甲基苯胺内标法定量，单甲脒和2,4-二甲基苯基甲酰胺外标法定量。该方法的灵敏度能满足蜂王浆中双甲脒及其代谢物残留量的检测和确证要求。但该专利在检测速度、绿色检测和节约成本上还有待提高。

本发明基于更好的满足蜂王浆质量检验监管需要，保障人民生活安全，维护国家的利益，提高检测技术水平，扩展蜂王浆中双甲脒及其代谢产物检测的方式，研究采用分散固相萃取-液相色谱-质谱/质谱法测定蜂王浆中双甲脒及其代谢产物单甲脒、2,4-二甲基苯基甲酰胺和2,4-二甲基苯胺残留量的测定。

表2双甲脒及代谢产物的基本性质

发明内容

为了解决蜂王浆中双甲脒及其代谢产物残留量同时测定的技术问题，本发明的目的是提供一种分散固相萃取-液相色谱-质谱/质谱法测定蜂王浆中双甲脒及其代谢产物残留量的方法，该方法具有简便快捷，消耗资源小，检测成本低的特点。

为了实现上述的目的，本发明采用了以下的技术方案：

一、提取

称取蜂王浆试样2.0g于50mL聚塞离心管中，加入同位素内标，加入pH＝9的缓冲溶液至10mL，2000转/分钟，涡旋混匀，静置5分钟，加10mL乙腈，2g氯化钠，2000转/分钟，涡旋混匀，8500转/分钟离心5分钟，移取乙腈提取液，水相中再加入10mL乙腈重复提取一次，合并乙腈提取液，并定容至20mL，取1.0mL乙腈溶液待净化；

二、净化

将上述乙腈提取液1.0mL，转移至15mL聚塞离心管中(内含混合均匀的吸附剂：25mg N-丙基乙二胺(PSA)、30mg无水硫酸镁、10mg C₁₈粉末)，涡旋，混匀，高速离心，转移全部上清液，加入水定容至2.0mL，涡旋，混匀，过0.22μm滤膜，待液相色谱-质谱/质谱仪测定。

三、测定

①标准工作液和样品溶液在设定的液相色谱-质谱/质谱条件下进样，以质量浓度X为横坐标，峰面积的比值Y为纵坐标，绘制6点标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中各化合物的响应值应在仪器检测的线性范围内；

②在上述色谱条件下，判断样品中是否存在相应的被测物，需要满足如下条件：样品溶液中出现的质量色谱峰保留时间与混合基质标准工作液一致，允许偏差小于±2.5％，该色谱峰所对应的化合物在设定的质谱定性离子的相对丰度与浓度相当的混合基质标准工作液的相对丰度一致，相对丰度偏差不超过设定的规定，则可确定含有该化合物。

本方法经缓冲溶液稀释样品，调节pH值并初步沉淀蛋白，乙腈和氯化钠进一步沉淀蛋白、提取和盐析分层，分散固相萃取技术进行净化的前处理过程，采用液相色谱-质谱/质谱法测定，同位素内标稀释法定量。该方法绿色环保、简便快捷，消耗资源小，检测成本低，所提及的前处理过程、涉及化合物以及测定所用仪器可以与已有方法进行很好的互补，适用于蜂王浆中双甲脒及其代谢产物残留量同时测定的要求，可以为维护食品安全和保障蜂王浆质量进一步提供有力的技术保障。

附图说明

图1空白蜂王浆测试的总离子流图。

图2空白蜂王浆测试的选择性离子流图。

图3空白蜂王浆基质加标测试的总离子流图(添加浓度：5μg/kg)。

图4空白蜂王浆基质加标测试的选择性离子流图(添加浓度：5μg/kg)。

图5空白蜂王浆添加目标化合物的加标回收实验测试的总离子流图(添加浓度：5μg/kg)。

图6空白蜂王浆添加目标化合物的加标回收实验测试的选择性离子流图(添加浓度：5μg/kg)。

具体实施方式

分散固相萃取-液相色谱-质谱/质谱法同时测定蜂王浆中双甲脒及其代谢产物残留量的方法，该方法包括以下的步骤：

一、提取

由于双甲脒的不稳定性，需要首先对化合物在提取条件下的稳定性进行考察，由于蜂王浆样品的特殊性，蛋白沉淀是前处理的关键步骤，因此需要在测定蜂王浆样品中药物残留时，对样品去除蛋白处理，来降低蛋白对测定的影响。试验综合考察了酸性溶液，中性溶液和碱性溶液环境下有机溶剂沉淀蛋白和提取的效果，研究发现酸性溶液(pH＝5)双甲脒容易发生水解，回收率小于30％，碱性溶液(pH大于9)单甲脒的回收率偏低，弱碱性溶液(pH＝7-8)条件下，双甲脒和单甲脒的回收率均大于70％，2,4-二甲基苯基甲酰胺和2,4-二甲基苯胺受到pH值影响较小。由于蜂王浆自身pH值呈现酸性(pH≈5)，因此需要加入碱性缓冲溶液来调节提取体系的pH至7-8，再进行提取实验。加入乙腈和氯化钠不但可以进一步有效的沉淀蛋白，同时可以促使乙腈和水相分离，起到提高提取效率的作用。

具体操作：

称取蜂王浆试样2.0g于50mL聚塞离心管中，加入同位素内标，加入pH＝9的缓冲溶液至10mL，2000转/分钟，涡旋混匀，静置5分钟，加10mL乙腈，2g氯化钠，2000转/分钟，涡旋混匀，8500转/分钟离心5分钟，移取乙腈提取液，水相中再加入10mL乙腈重复提取一次，合并乙腈提取液，并定容至20mL，取1.0mL乙腈溶液待净化；

二、净化

本发明尝试考察N-丙基乙二胺(PSA)、无水硫酸镁、C₁₈粉末和石墨化碳黑(GCB)四种吸附剂的净化效果。

1、N-丙基乙二胺(PSA)吸附净化，对比25mg，50mg，100mg N-丙基乙二胺(PSA)对各化合物的净化回收率无明显差异，大于80％。

2、无水硫酸镁吸附净化，对比30mg，75mg，150mg无水硫酸镁对各化合物的净化，其中30mg和75mg回收率无明显差异，均大75％。150mg时双甲脒回收率降低至60％。

3、C₁₈粉末吸附净化，对比10mg，25mg，50mg C18粉末对各化合物的净化回收率无明显差异，大于80％。

4、石墨化碳黑(GCB)吸附净化，对比15mg，30mg，100mg石墨化碳黑(GCB)的净化情况，其中双甲脒的净化回收率小于10％，其他化合物的净化回收率也小于50％。

5、不同比例配比的N-丙基乙二胺(PSA)、无水硫酸镁、C₁₈粉末混合剂，对各化合物的净化回收率，其中无水硫酸镁用量在150mg时双甲脒回收率偏低，其他化合物无明显差异。以绿色环保、节约检测成本为基点出发选择25mg N-丙基乙二胺(PSA)，30mg无水硫酸镁和10mg C₁₈粉末为组合净化吸附剂。

具体操作：

将上述乙腈提取液1.0mL，转移至15mL聚塞离心管中(内含混合均匀的吸附剂：25mg N-丙基乙二胺(PSA)、30mg无水硫酸镁、10mg C₁₈粉末)，涡旋，混匀，高速离心，转移全部上清液，加入水定容至2.0mL，涡旋，混匀，过0.22μm滤膜，待液相色谱-质谱/质谱仪测定。

三、测定

标准工作液和样品溶液在表3和表4设定的液相色谱-质谱/质谱仪条件下进样，以质量浓度X为横坐标，峰面积的比值Y为纵坐标，绘制6点标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中各化合物的响应值应在仪器检测的线性范围内。在上述色谱条件下，判断样品中是否存在相应的被测物，需要满足如下条件：样品溶液中出现的质量色谱峰保留时间与混合基质标准工作液一致，允许偏差小于±2.5％，该色谱峰所对应的化合物在表3中的质谱定性离子的相对丰度与浓度相当的混合基质标准工作液的相对丰度一致，相对丰度偏差不超过表4的规定，则可确定含有该化合物。

表3为各类化合物的母离子、子离子和碰撞能量等质谱参数。在表3和表4设定的液相色谱-质谱/质谱仪条件下，空白样品添加回收实验的回收率和精密度见表5，各类化合物的质谱色谱峰见图1和图2。

表3双甲脒及其代谢产物的质谱参数

表4液相色谱串联质谱的仪器条件参数

表5蜂王浆中双甲脒及其代谢产物添加水平、回收率和精密度(n＝6)

Claims (4)

1.分散固相萃取-液相色谱-质谱/质谱法同时测定蜂王浆中双甲脒及其代谢产物残留量的方法，所述的代谢产物为单甲脒，2,4-二甲基苯基甲酰胺和2,4-二甲基苯胺，其特征在于，该方法包括以下的步骤：

一、提取：

称取蜂王浆试样2.0g于50mL聚塞离心管中，加入同位素内标，加入pH＝9的缓冲溶液至10mL，2000转/分钟，涡旋混匀，静置5分钟，加10mL乙腈，2g氯化钠，2000转/分钟，涡旋混匀，8500转/分钟离心5分钟，移取乙腈提取液，水相中再加入10mL乙腈重复提取一次，合并乙腈提取液，并定容至20mL，取1.0mL乙腈溶液待净化；

二、净化

将上述乙腈提取液1.0mL，转移至15mL聚塞离心管中，涡旋，混匀，高速离心，转移全部上清液，加入水定容至2.0mL，涡旋，混匀，过0.22μm滤膜，待液相色谱-质谱/质谱仪测定；聚塞离心管内含混合均匀的吸附剂：25mg N-丙基乙二胺PSA、30mg无水硫酸镁和10mg C₁₈粉末；

三、测定

3.1标准工作液和样品溶液在设定的液相色谱-质谱/质谱条件下进样，以质量浓度X为横坐标，峰面积的比值Y为纵坐标，绘制6点标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中各化合物的响应值应在仪器检测的线性范围内；

3.2在上述色谱条件下，判断样品中是否存在相应的被测物，需要满足如下条件：样品溶液中出现的质量色谱峰保留时间与混合基质标准工作液一致，允许偏差小于±2.5％，该色谱峰所对应的化合物在设定的质谱定性离子的相对丰度与浓度相当的混合基质标准工作液的相对丰度一致，相对丰度偏差不超过设定的规定，则可确定含有该化合物。

2.根据权利要求1所述的分散固相萃取-液相色谱-质谱/质谱法同时测定蜂王浆中双甲脒及其代谢产物残留量的方法，其特征在于，步骤一同位素内标溶液的加入为：双甲脒-D₆和2,4-二甲基苯胺-D₆内标物40ng。

3.根据权利要求1所述的分散固相萃取-液相色谱-质谱/质谱法同时测定蜂王浆中双甲脒及其代谢产物残留量的方法，其特征在于，步骤三设定的各化合物的母离子、子离子和碰撞能量等质谱参数如下：

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4.根据权利要求1所述的分散固相萃取-液相色谱-质谱/质谱法同时测定蜂王浆中双甲脒及其代谢产物残留量的方法，其特征在于，步骤三设定的液相色谱-质谱/质谱仪的仪器条件参数如下：

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