CN102998159A

CN102998159A - 鳗鱼中四环素类药物残留检测的前处理方法

Info

Publication number: CN102998159A
Application number: CN2012105520287A
Authority: CN
Inventors: 邱彬; 周平; 林振宇; 郭隆华; 陈国南
Original assignee: Fuzhou University
Current assignee: Fuzhou University
Priority date: 2012-12-19
Filing date: 2012-12-19
Publication date: 2013-03-27

Abstract

本发明提供了鳗鱼中四环素类药物残留检测的前处理方法,属于分析化学领域。该方法包括待测样品的称量、pH=3.5±0.05柠檬酸缓冲溶液的提取、固相萃取柱的活化、固相萃取柱的洗脱等操作。本发明操作简单有效，制备出的样品溶液可以直接用液相色谱-串联质谱法进行检测。该前处理方法与现有方法相比,具有操作简单有效、成本低、重现性好等优点，具有很强的可操作性，有望在商检及出入境检验检疫等行业大规模推广应用，具有显著的经济效益。

Description

鳗鱼中四环素类药物残留检测的前处理方法

技术领域

本发明属于分析化学领域，更具体涉及鳗鱼中四环素类药物残留检测的前处理方法。

背景技术

四环素类药物为并四苯衍生物，具有十二氢化并四苯基本结构，该类药物有共同的四个环的母核，其中尤以土霉素、四环素、金霉素的抗菌谱最广，对

革兰氏阳性菌、阴性菌均具有较强的抗菌作用。四环素类药物可在动物体内残留，并随鱼类、乳制品、蛋等食品进入人体，危害人体健康，具体表现为对人的肺、胃肠、肾脏、皮肤和骨骼造成损害，尤其是对儿童的牙齿损害最大。

四环素类(TCs)药物作为一种可治疗动物疾病的药物或饲料添加剂被广泛使用,用于防治肠道感染和促进生长,容易诱导耐药菌株和导致食品残留。研究发现该类药物具有致突变性和潜在的致癌性,被许多国家列为限量药物。为此,世界各国针对进出口动物组织及相关产品中四环素类残留量作出了明确的最高残留限量规定,以保障公众健康。

近年来，日本、澳大利亚等对畜、禽肉中抗生素残留问题进行了大量研

究，日本厚生省要求进口畜禽肉中四环素族残留量不得超过0.05mg/kg。澳大利亚规定四环素类总量不得大于0.3mg/kg。欧盟一律标准为0.01mg/kg。我国早在1991年就出台国标对蜂蜜中四环素类的最高残留量进行规定：不得大于0.05mg/kg，也针对它们在畜禽肉及水产品中的最高允许残留量进行规定。

鉴于上述原因，有必要研究掌握四环素类药物残留检测的有效检测方法，达到有效监控其在环境中残留，减少对于人类危害的目的。现阶段对于四环素类药物残留的检测方法多样，但都包含了样品前处理过程。前处理方法多为使用提取剂多次提取或有机溶剂萃取，之后使用层析柱或者具有吸附性填料的柱子进行清洗。此类前处理技术的关键缺点是提取过程繁琐、处理过程耗时较长。

发明内容

本发明的目的在于提供一种操作简单有效的鳗鱼中四环素类药物残留检测的前处理方法。

本发明的一种鳗鱼中四环素类药物残留检测的前处理方法, 包括以下步骤：

(1) 称取样品5.00 g，精确至0.01 g，置于50mL离心管中；

(2) 加入柠檬酸缓冲溶液20mL，混匀，10000转/分钟离心10分钟；

(3) 准确吸取上清液10 mL于离心管中，备用；

(4) C₁₈固相萃取柱的活化过程如下：

a.5mL甲醇淋洗，

b.5mL柠檬酸缓冲溶液除杂，

c.5mL蒸馏水平衡；

(5) 将步骤（3）中的上清液过柱，先用2mL柠檬酸缓冲溶液淋洗，弃去全部淋洗液；

(6) 再用0.8ml甲醇，以1-3mL/min的流速洗脱，收集洗脱液；

(1) 往洗脱液中加入0.1mol/mL乙酸铵缓冲溶液定容至1mL，然后用0.22mm微孔滤膜过滤，所得滤液即可上机检测；

上述柠檬酸缓冲溶液的PH = 3.5±0.05。

所述柠檬酸缓冲溶液的配制为：称取4.20g柠檬酸，用蒸馏水溶解，定容至200mL；称取2.84g磷酸氢二钠，用蒸馏水溶解，定容至100mL；取160mL柠檬酸溶液与100mL磷酸氢二钠溶液混合，用盐酸调节PH = 3.5±0.05制备缓冲溶液，称取9.68g乙二胺四乙酸二钠放入上述缓冲溶液中，使其溶解，摇匀。

所述乙酸铵缓冲溶液的配制为：称取0.385g乙酸铵，加入1mL甲酸溶液，用蒸馏水溶解，定容至500mL。

所述四环素类药物包括土霉素、四环素、金霉素、强力霉素。

本发明的前处理方法与现有方法相比，具有操作简单有效、成本低、重现性好等优点，具有很强的可操作性,经该方法处理后的待测样品能够直接用液相色谱-串联质谱法进行检测。

本发明的显著优点为:

1) 目前报导的大部分四环素类药物提取方法是针对动物源性食品中设计，而本方法是针对鳗鱼中四环素类药物残留检测的一种提取方法；

2) 目前报导的大部分提取剂均为EDTA-Mcllvainc缓冲溶液，而本方法采用EDTA-Mcllvainc缓冲溶液的特定PH值，使四环素类药物残留能够得到充分的提取，从而能够有效的检测四环素类药物残留；

3) 国标方法用EDTA-Mcllvainc缓冲溶液(PH=4.0)冰水浴超声提取三次；而本方法用EDTA-Mcllvainc缓冲溶液（PH=3.5）室温下提取一次，从而节省了提取时间。

4) 国标方法用HLB固相萃取柱来提取四环素类药物，洗脱液氮吹浓缩至干；而在本发明中用C₁₈固相萃取柱来提取四环素类药物，洗脱液直接上机检测。

具体实施方式

按照本发明的发明内容实施本发明，所需试剂溶液的配制方法如下：EDTA-Mcllvainc缓冲溶液：4.20g柠檬酸于200mL蒸馏水中 + 2.84g磷酸氢二钠于100mL蒸馏水中充分溶解后，取将160mL柠檬酸溶液与100mL磷酸氢二钠溶液混合，调节 PH = 3.5±0.05，加入9.68gEDTA；乙酸铵缓冲溶液：0.385g乙酸铵+1mL甲酸，用蒸馏水定容至500mL；标准储备液：分别称取土霉素、四环素、金霉素、强力霉素各10mg，用甲醇定溶于100ml棕色容量瓶中，制成100mg/mL的标准储备液；混合标准工作液：用甲醇稀释标准储备液，配制成土霉素、四环素、金霉素、强力霉素均为5mg/mL的混合标准溶液；定量曲线：用甲醇配制定量曲线标液，各个组分的浓度0.05mg /mL、0.1mg /mL、0.15 mg/mL、0.2mg /mL、0.25mg/mL；基质混合校准曲线：分别取浓度为5mg/mL的混合标准溶液10mL、20mL、30mL、40mL、50mL的标准溶液对空白样品进行洗脱过柱，过滤得基质混合校准溶液。本方法对空白鳗鱼样品中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素的测定下限为10.0 mg/kg,达到国内外检测四环素类抗生素的残留的标准。

实施例1

(1) 称取5.00 g(精确至0.01 g)样品于50 mL离心管中；

(2) 往上述离心管中加入提取剂（EDTA-Mcllvainc缓冲溶液）20ml；

(3) 离心管加盖振荡1分钟，在10000转/分钟离心10分钟；

(4) 准确吸取上清液10ml于离心管中，备用；

(5) 固相萃取柱（SPE小柱C₁₈-200mg/3mL）活化过程：

a.5ml甲醇活化

b.5ml提取剂活化

c.5ml蒸馏水活化

(6) 将4步骤中的上清液过柱，1-3ml/min；

(7) 准确吸取2ml提取剂洗脱C₁₈固相萃取柱；

(8) 准备吸取0.8ml甲醇洗脱固相萃取柱，收集洗脱液；

(9) 往洗脱液中加入0.2ml 10mmol/L乙酸铵缓冲溶液定容至1ml，洗脱液用0.22mm微孔滤膜过滤，所得滤液即可上机检测。

本发明的提取方法较EDTA-Mcllvainc缓冲溶液(PH=4.0)提取检测的四环素类药物回收率高（见表1），说明本发明使四环素类药物残留能够得到充分的提取，从而能够有效的检测四环素类药物残留。且本发明重复性好（见表2），具有很强的可操作性。

表1：EDTA-Mcllvainc缓冲溶液PH3.5与PH4.0的回收率比较

Figure 2012105520287100002DEST_PATH_IMAGE001

注：EDTA-Mcllvainc缓冲溶液PH3.5时的回收率均比PH4时的回收率高

表2：提取方法的重现性实验

注：土霉素、四环素、金霉素、强力霉素的RSD%均小于10。

结果：

1、加标回收：添加5.0 mg/L混合标准工作液50 mL，相当于0.05 mg/kg添加水平。空白鳗鱼样品进行加标回收试验结果表明:在50 mg·kg^-1添加水平时平均回收率在70%-95%。

2、用本方法测得土霉素、四环素、金霉素和强力霉素的保留时间依次为1.44min,1.78min,1.50min,1.87min,分离效果良好,分析时间为4min。

Claims

1.一种鳗鱼中四环素类药物残留检测的前处理方法, 其特征在于：所述的前处理方法包括以下步骤：

(1) 称取样品5.00 g，精确至0.01 g，置于50mL离心管中；

(2) 加入柠檬酸缓冲溶液20mL，混匀，10000转/分钟离心10分钟；

(3) 准确吸取上清液10 mL于离心管中，备用；

(4) C₁₈固相萃取柱的活化过程如下：

a.5mL甲醇淋洗，

b.5mL柠檬酸缓冲溶液除杂，

c.5mL蒸馏水平衡；

(6) 再用0.8ml甲醇，以1-3mL/min的流速洗脱，收集洗脱液；

(7) 往洗脱液中加入0.1mol/mL乙酸铵缓冲溶液定容至1mL，然后用0.22mm微孔滤膜过滤，所得滤液即可上机检测；

上述柠檬酸缓冲溶液的PH = 3.5±0.05。

2.根据权利要求1所述的鳗鱼中四环素类药物残留检测的前处理方法, 其特征在于：所述柠檬酸缓冲溶液的配制为：称取4.20g柠檬酸，用蒸馏水溶解，定容至200mL；称取2.84g磷酸氢二钠，用蒸馏水溶解，定容至100mL；取160mL柠檬酸溶液与100mL磷酸氢二钠溶液混合，用盐酸调节PH = 3.5±0.05制备缓冲溶液，称取9.68g乙二胺四乙酸二钠放入上述缓冲溶液中，使其溶解，摇匀。

3.根据权利要求1所述的鳗鱼中四环素类药物残留检测的前处理方法, 其特征在于：所述乙酸铵缓冲溶液的配制为：称取0.385g乙酸铵，加入1mL甲酸溶液，用蒸馏水溶解，定容至500mL。

4.根据权利要求1所述的鳗鱼中四环素类药物残留检测的前处理方法, 其特征在于：所述四环素类药物包括土霉素、四环素、金霉素、强力霉素。