CN103484518A

CN103484518A - 一种核桃蛋白肽及其制备方法和其应用

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Publication number: CN103484518A
Application number: CN201310412884.7A
Authority: CN
Inventors: 邹远东
Original assignee: Individual
Current assignee: Wuhan Jiushengtang Bioengineering Co Ltd
Priority date: 2013-09-11
Filing date: 2013-09-11
Publication date: 2014-01-01
Anticipated expiration: 2033-09-11
Also published as: CN103484518B

Abstract

本发明公开了一种核桃蛋白肽及其制备方法与应用。该核桃蛋白肽是按照包括下述步骤的方法制备得到的：采用芳香水果植物复合蛋白酶对核桃分离蛋白进行酶解反应，得到所述核桃蛋白肽。其相对分子质量主要在0～1000Da之间，均由2～9个氨基酸组成。本发明所提供的核桃蛋白肽风味独特、含肽率高、分子量小、肽链短、无需脱苦、具有极强的活性和多样性，可作为医药原料以及食品添加剂用于制备降血压、抗氧化、增强记忆力、提高脑神经灵敏度的产品，如药品、保健品、食品等。本发明制备核桃蛋白肽的方法工艺简易、投资少、见效快、回报率高、无环境污染、是一种低碳高效，适宜于工业化生产的项目。

Description

一种核桃蛋白肽及其制备方法和其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种核桃蛋白肽及其制备方法和其应用。

背景技术

核桃为胡桃科胡桃属植物，是世界四大干果之一。核桃油中饱和脂肪酸总量一般小于10%，不饱和脂肪酸含量丰富，主要有油酸、亚油酸和亚麻酸，总量约90%。

核桃仁中蛋白的含量约为15%，其中含8种人体必需氨基酸,且含量合理,接近联合国粮农组织(FAO)和世界卫生组织(WHO)规定的标准，是一种很好的木本植物蛋白。核桃制油剩余的核桃粕多被用作动物饲料原料，造成资源浪费。因此对核桃进行深加工，通过提取核桃蛋白对其进行再利用，既可提高核桃加工的附加值，又可以充分利用核桃蛋白资源。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种核桃蛋白肽及其制备方法和其应用。

本发明提供的一种制备核桃蛋白肽的方法，包括下述步骤：采用芳香水果植物复合蛋白酶对核桃分离蛋白进行酶解反应，得到所述核桃蛋白肽；所述芳香水果植物复合蛋白酶是由无花果蛋白酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶按照酶活单位1U：1U：4U的比例混合而成。

所述方法中，所述核桃分离蛋白的制备过程包括：将核桃仁经液压搾油机压搾后得到核桃粕加入水中,每30ml水中加入1g核桃粕，用氢氧化钠调节pH8.5，50℃的条件下，对核桃粕利用超声波提取60min,然后用冰醋酸调节pH值，在pH4.5条件进行酸沉淀，过滤后所得固体物质即为核桃分离蛋白。

所述方法中，所述核桃粕的制备过程包括：利用去壳工具去掉核桃外壳后，得到核桃仁；然后将核桃仁倒入烘干池,用热风炉将核桃仁升温到40℃并使其受热均匀，烘干3h；最后将经过预处理的核桃仁放入网状过滤袋，然后将过滤袋装入液压搾油机开始压搾去油后，所得固体物质为核桃粕。

所述方法中，所述酶解反应的反应温度为60℃，反应时间为90分钟，pH值为7.5-8.0。

所述方法中，所述酶解反应的反应体系中，核桃分离蛋白与水的质量份数比为1：15；酶解每克核桃分离蛋白所需芳香水果植物复合蛋白酶8000U。

所述方法还包括下述步骤：在酶解反应结束后，对酶解液进行冷藏沉降处理，过滤，收集滤液；所述冷藏沉降的温度为-4℃，时间为24小时。

所述方法还包括将所述滤液进行酶灭活处理的步骤；所述酶灭活的条件为：温度100℃，时间20分钟。

所述方法制备得到的核桃蛋白肽也属于本发明保护的范围。

所述方法制备得到的核桃蛋白肽在下述至少一种中的用途：

（1）制备降血压的产品中的应用；

（2）制备抗氧化的产品中的应用；

（3）制备增强记忆力和/或提高脑神经灵敏度产品中的应用。

所述应用中，所述产品可为药品、保健品或食品。

本发明的再一个目的是提供一种具有下述任一用途的产品，其活性成分为所述方法制备得到的核桃蛋白肽：

（1）降血压；

（2）抗氧化；

（3）增强记忆力和/或提高脑神经灵敏度。

以核桃蛋白肽为活性成分制备的降血压、抗氧化、增强记忆力、提高脑神经灵敏度的药物或保健品，需要的时候，在上述药物或保健品中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。

所述降血压、抗氧化、增强记忆力、提高脑神经灵敏度的药物可以制成口服液、片剂、冲剂、胶囊（包括软、硬胶囊）、喷剂以及包衣丸剂等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。

本发明所提供的核桃蛋白肽风味独特、含肽率高、分子量小、肽链短、无需脱苦、具有极强的活性和多样性，可作为医药原料以及食品添加剂用于制备降血压、抗氧化、增强记忆力、提高脑神经灵敏度的产品，如药品、保健品、食品等。

本发明制备核桃蛋白肽的方法工艺简易、投资少、见效快、回报率高、无环境污染、是一种低碳高效，适宜于工业化生产的项目。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、核桃蛋白肽的制备

（一）核桃分离蛋白的制备

1、核桃制油剩余的核桃粕的获得：利用去壳工具去掉核桃外壳后，得到核桃仁；然后将核桃仁倒入烘干池,用热风炉将核桃仁升温到40℃并使其受热均匀，烘干3h；最后将经过预处理的核桃仁放入网状过滤袋，然后将过滤袋装入液压搾油机开始压搾去油后，所得固体物质为核桃粕。

2、从核桃制油剩余的核桃粕中提取蛋白：将榨油后的核桃粕加入水中,每30ml水中加入1g核桃粕，用氢氧化钠调节pH8.5，50℃的条件下，对核桃粕利用超声波提取60min,然后用冰醋酸调节pH值，在pH4.5条件进行酸沉淀，过滤后所得固体物质即为核桃分离蛋白。

（二）芳香水果植物复合蛋白酶的配制

将无花果蛋白酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶按照1U：1U：4U的比例混合即得芳香水果植物复合蛋白酶。

（三）核桃蛋白肽的制备

将上述制备的核桃分离蛋白投入酶解罐中，向酶解罐内加入相当于所述核桃分离蛋白质量的15倍的水，按酶解每克核桃分离蛋白需要芳香水果植物复合蛋白酶8000U的量加入复合蛋白酶；搅拌混匀后加热至60℃对核桃分离蛋白酶解90min，酶解过程保持pH值在7.5-8.0，用冰醋酸调节反应液的pH值；酶解结束后，还需对酶解液进行酶灭活处理，所述酶灭活的条件为温度100℃，时间为20分钟。之后在-4℃条件下冷藏沉降处理24小时，待其杂质基本沉淀，取上清液，再用板框过滤后即得核桃蛋白

实施例2、核桃蛋白肽的分子量分布检测

核桃蛋白肽的分子量分布的测定方法采用高效凝胶过滤色谱法，测试结果表明本发明提供的核桃蛋白肽的相对分子质量主要集中在0-1000Da的小分子肽与氨基酸混合物，小肽含量为65%以上。

对比例1-3、核桃蛋白肽的制备

按照表1所述的酶反应条件，按实施例1所述方法，进行核桃蛋白肽的制备。

表1

	复合蛋白酶酶活配比	酶解反应pH值	酶解反应温度	酶解反应时间
					对比例1	1:1:1	6.0-6.5	65℃	3小时
对比例2	1:2:1	5.5-6.0	55℃	1小时
					对比例3	1:1:2	6.5-7.0	70℃	2小时

表1中，复合蛋白酶酶活配比具体指无花果蛋白酶、菠萝蛋白酶与木瓜蛋白酶的酶活单位的比例。

计算按各对比例的反应条件所制备的核桃蛋白肽中分子质量主要集中在0-1000Da的小分子肽的含量，结果显示，按照对比例1-3的反应条件所制备的核桃蛋白肽的小肽含量依次为42%、31%、38%。该数据表明实施例1所述的核桃蛋白肽的制备方法要优于对比例1-3。

实施例3、核桃蛋白肽的降血压药效学试验

通过血管紧张素转换酶（ACE）抑制活性的检测实验来验证核桃蛋白肽的降血压药效学功。

（一）试剂及待测样品溶液的制备

ACE溶液的配制：将1U ACE溶于2ml0.1mol/L硼酸缓冲液（pH8.3，含0.4mol/LNaCl）中即得。

HHL溶液的配制：取HHL适量，以0.1mol/L硼酸缓冲液（pH8.3，含0.4mol/L NaCl）溶解配成5mmol/LHHL溶液。

马尿酸标准液的制备：取马尿酸标准品适量，用0.1mol/L硼酸缓冲液（pH8.3，含0.4mol/L NaCl）配成不同浓度的马尿酸标准液。

核桃蛋白肽样品的制备：取实施例1制备的核桃蛋白肽、对比例1-3制备的核桃蛋白肽适量，用0.1mol/L硼酸缓冲液（pH8.3，含0.4mol/L NaCl）溶解混匀，配成不同浓度的样品溶液。

（二）酶反应

取不同浓度的核桃蛋白肽样品溶液15μL，加入15μL的ACE溶液，37℃水浴保温3min后加入50μL HHL溶液开始反应，在37℃条件下反应30min后加入100μL1.0mol/L HCl溶液终止反应；同时用15μL0.1mol/L硼酸缓冲液（pH8.3，含0.4mol/LNaCl）代替核桃蛋白肽样品溶液，作为空白对照组。

（三）HPLC分析检测结果

将上述酶反应液经0.45μm滤膜过滤后进行HPLC分析。检测波长：228nm；流动相A为水（含0.05%三氟乙酸），流动相B为乙腈（含0.05%三氟乙酸）；流速0.4ml/min；柱温30℃。

（四）实验结果分析

ACE抑制率的计算：

ACE抑制率(%)=（a-b）/a×100%

式中a为空白对照组马尿酸的峰面积；b为样品组马尿酸的峰面积。

ACE抑制率实验及HPLC分析结果显示，核桃蛋白肽样品溶液浓度与ACE抑制率呈线性关系，即随着核桃蛋白肽浓度的增高，其ACE抑制率也升高；实施例1制备的核桃蛋白肽的ACE抑制的IC₅₀为3.98mg/ml；对比例1-3制备的核桃蛋白肽的ACE抑制的IC₅₀依次为1.21mg/ml、0.93mg/ml、1.04mg/ml。

实施例4、核桃蛋白肽的抗氧化活性的测定

核桃蛋白肽对DPPH自由基的清除活性的测定：

将核桃蛋白肽用体积分数为50%的乙醇溶剂配制成1-10mg/mL的待测溶液。

在试管中依次加入3mL5×10^-5mol·L^-1DPPH溶液和1mL体积分数为50%的乙醇,总体积为4.0mL，混匀避光反应40min后,于1cm比色皿中测定517nm处的吸光度,记为A₀；同法测定3mL5×10^-5mol·L^-1DPPH溶液和1mL待测溶液的混合溶液在517nm处的吸光度,测定值记为A_x；同法测定3mL体积分数为50%的乙醇和1mL待测溶液的混合溶液在517nm处的吸光度,测定值记为A_r。按下述公式计算DPPH自由基清除率：

清除率（%）=1-（A_x-A_r）/A₀×100%

抗氧化剂清除自由基能力采用清除DPPH的IC₅₀值表示。测定不同浓度待测溶液的DPPH自由基清除率,并绘制待测溶液浓度与清除率曲线,由曲线读取DPPH自由基清除率为50%时所需核桃蛋白肽的质量,按下述公式计算IC₅₀值：

IC₅₀=50%×加入的DPPH的质量/加入的核桃蛋白肽的质量

重复测定2次,平均值即为测定结果。测定不同质量浓度实施例1制备的核桃蛋白肽的自由基清除和抗氧化活性结果显示，核桃蛋白肽具有较强的DPPH自由基清除活性，并且随着质量浓度增加，其清除能力增强。核桃蛋白肽清除DPPH自由基的IC₅₀值为3.68mg/mL。

实施例5、核桃蛋白肽增强记忆力和/或提高脑神经灵敏度的药效学试验

采用小鼠八臂迷宫实验来检测实施例1制备的核桃蛋白肽在增强记忆力和/或提高脑神经灵敏度的方面的功能。

（一）训练阶段

1.适应实验环境1周后，称重，禁食24小时。此后每天训练结束后限制性地给予正常食料，以使体重保持在正常进食小鼠的80%～85%。

2.第二天，迷宫各臂及中央区分撒着食物颗粒（每只4-5粒，直径约3-4mm）。然后，同时将4只动物置于迷宫中央（通往各臂的门打开）。让其自由摄食、探究10min。

3.第三天，重复第二天的训练。这一过程让动物在没有很强的应激条件下熟悉迷宫环境。

4.第四天起，动物单个进行训练：在每个臂靠近外端食盒处各放一颗食粒，让动物自由摄食。食粒吃完或10min后将动物取出。

5.第五天，将食物放在食盒内，重复前一天的训练，一天2次。

6.第六天以后，随机选4个臂，每个臂放一颗食粒；各臂门关闭，将动物放在迷宫中央；30s后，臂门打开，让动物在迷宫中自由活动并摄取食粒，直到动物吃完所有4个臂的食粒。如经10min食粒仍未吃完，则实验终止。每天训练两次，其间间隔1h以上。

记录以下2个指标：

1.工作记忆错误（working memory errors），即在同一次训练中动物再次进入已经吃过食粒的臂；

2.参与记忆错误（reference memory errors），即动物进入不曾放过食粒的臂；

连续5次训练的工作记忆错误为零、参考记忆错误不超过1次时，可以开始药物测试。

（二）测验阶段：

先给上述训练好的小鼠随机分为4组，即灌胃给予生理盐水的对照组，分别灌胃给予低、中、高剂量的实施例1制备的核桃蛋白肽的实验组，低剂量组给药剂量为25mg/kg，中剂量为50mg/kg，高剂量为100mg/kg，每组5只小鼠。

为缩短实验时间，将8个臂中的4个臂用隔板挡住，只利用其中编号依次为1、3、5、7的四个臂进行实验，在3、7两臂内放入食物。

将小鼠放入迷宫中央，任其在迷宫内自由探索，至小鼠全部获得了3、7两臂内的食物，结束实验，将小鼠取出。

每只小鼠在给药的第1-10天，每天进行一轮测试，在实验过程中，详细记录小鼠工作记忆错误（短期记忆）、参考记忆错误（长期记忆）和全部获得了3、7两臂内的食物即实验结束的时间，然后综合记录结果进行统计分析。

（三）实验结果

小鼠八臂迷宫实验检测记录结果显示，给药组小鼠在给药第3天开始，工作记忆错误（短期记忆）、参考记忆错误（长期记忆）次数明显低于对照组小鼠，给药组小鼠全部获得了3、7两臂内的食物即实验结束的时间要明显短于对照组；本实验结果表明，本发明实施例1制备的核桃蛋白肽具有增强记忆力和/或提高脑神经灵敏度的功效，且呈剂量相关性。

Claims

1.一种制备核桃蛋白肽的方法，包括下述步骤：采用芳香水果植物复合蛋白酶对核桃分离蛋白进行酶解反应，得到所述核桃蛋白肽；所述芳香水果植物复合蛋白酶是由无花果蛋白酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶按照酶活单位1U：1U：4U的比例混合而成。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述核桃分离蛋白的制备过程包括，将核桃仁经液压搾油机压搾后得到核桃粕加入水中,每30ml水中加入1g核桃粕，用氢氧化钠调节pH8.5，50℃的条件下，对核桃粕利用超声波提取60min,然后用冰醋酸调节pH值，在pH4.5条件进行酸沉淀，过滤后所得固体物质即为核桃分离蛋白。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述酶解反应的反应温度为60℃，反应时间为90分钟，pH值为7.5-8.0。

4.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其特征在于：所述酶解反应的反应体系中，核桃分离蛋白与水的质量份数比为1：15；酶解每克核桃分离蛋白所需芳香水果植物复合蛋白酶8000U。

5.根据权利要求1-4中任意一项所述的方法，其特征在于：所述方法还包括下述步骤：在酶解反应结束后，对酶解液进行冷藏沉降处理，过滤，收集滤液；所述冷藏沉降的温度为-4℃，时间为24小时。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述方法还包括将所述滤液进行酶灭活处理的步骤；所述酶灭活的条件为：温度100℃，时间20分钟。

7.权利要求1-6中任意一项所述方法制备得到的核桃蛋白肽。

8.权利要求7所述的核桃蛋白肽在下述至少一种中的用途：

（1）制备降血压的产品中的应用；

（2）制备抗氧化的产品中的应用；

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述产品可为药品、保健品或食品。

10.一种具有下述任一用途的产品，其活性成分为权利要求7所述的核桃蛋白肽：

（1）降血压；

（2）抗氧化；

（3）增强记忆力和/或提高脑神经灵敏度。