CN111494495A - 荔枝果肉膳食纤维-结合酚加合物在制备改善肠道微生态制剂中的应用 - Google Patents

荔枝果肉膳食纤维-结合酚加合物在制备改善肠道微生态制剂中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了荔枝果肉膳食纤维‑结合酚加合物在制备改善肠道微生态制剂中的应用。本发明中的荔枝果肉膳食纤维‑结合酚加合物包括可溶性膳食纤维‑结合酚加合物和不可溶性膳食纤维‑结合酚加合物，制备工艺简单。不仅能够提高肠道中短链脂肪酸含量，还有助于调节肠道内菌群多样性、丰度以及优势菌群分布还能选择性增加有益菌比例，降低有害菌的比例，具有极大的价值。

Description

荔枝果肉膳食纤维-结合酚加合物在制备改善肠道微生态制 剂中的应用
技术领域
本发明涉及天然产物领域，具体涉及荔枝果肉膳食纤维-结合酚加合物在制备改善肠道微生态制剂中的应用。
背景技术
随着现代都市的生活节奏日趋快速化，城市居民工作强度大，人体长期处于应激状态，且易摄入辛辣、刺激性强的食物，导致肠道内处于动态平衡的微生物生态环境被破坏，具体表现为肠道菌群在种类、数量、比例、分布和生物学特性上的变化，菌群紊乱，进而导致人体出现急性肠胃炎和一些慢性肠道疾病的产生。如直肠炎、便秘等等。肠道微生物菌群参与宿主内多个代谢途径的调节、物质的消化和吸收、信号的传递以及免疫功能的调节等。比如，肠道中的短链脂肪酸来自于肠道菌群对蛋白质和脂肪的分解，同时也能抑制部分微生物的生长，调节肠道内的酸碱度。然而目前已有治疗肠道菌群紊乱和调节肠道中短链脂肪酸合成低下的抗生素和药物，但在一定程度上，对人体的肠道有很强的毒副作用。因此，开发具有改善肠道菌群紊乱及调节短链脂肪酸合成低下，且无毒副作用的制剂具有深远的现实意义和指导意义。
荔枝是热带和亚热带地区的特色水果，也是广东省最为主要的经济作物水果，口感鲜美深受人们喜爱。中医认为荔枝果肉具有健脾、益肝、养颜功效。荔枝果肉中的膳食纤维包括可溶性膳食纤维和不溶性膳食纤维。膳食纤维由复杂的碳水化合物组成，包括果胶和一些可溶性多糖。大多数在小肠和大肠中被某些细菌产生的酶所修饰，转化为有助于维护肠道内菌群的物质，促进消化。而不溶性膳食纤维也可以通过促进肠道蠕动等多种机制清除体内的废物与毒素。此前，张军丽等人研究复合菌-荔枝多酚对腹泻小鼠的肠道功能影响，所用荔枝多酚来自于荔枝果皮。截至目前，并未有任何现有技术公开过关于荔枝果肉中的膳食纤维-结合酚加合物在改善肠道微生态方面的研究及报道。
发明内容
本发明的目的在于提供荔枝果肉膳食纤维-结合酚加合物在制备改善肠道微生态制剂中的应用。
本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供：
荔枝果肉膳食纤维-结合酚加合物在制备改善肠道微生态制剂中的应用。
进一步地，上述荔枝果肉膳食纤维-结合酚的制备方法具体步骤如下：
(1)将荔枝果肉烘干，制成荔枝果肉干；
(2)将步骤(1)所得荔枝果肉干与酒精混合，超声处理，过滤，得到沉淀物A；
(3)将步骤(2)所得沉淀物A与水混合，调节酸碱度，水浴，均质；
(4)离心，收集上清液和沉淀物B；
(5)干燥沉淀物B，得到荔枝果肉不溶性膳食纤维-结合酚加合物；
(6)将步骤(4)所得上清液与酒精按混合，静置沉淀，过滤除去酒精取浆状物，干燥，得到荔枝果肉可溶性膳食纤维-结合酚加合物；
(7)混合步骤(5)所得荔枝果肉不溶性膳食纤维-结合酚加合物和步骤(6)所得荔枝果肉可溶性膳食纤维-结合酚加合物，得到荔枝果肉膳食纤维-结合酚加合物。
上述荔枝果肉膳食纤维-结合酚加合物包括荔枝果肉可溶性膳食纤维-结合酚加合物和荔枝果肉不溶性膳食纤维-结合酚加合物。
更进一步地，上述步骤(2)中荔枝果肉干与酒精的质量体积比为1：(5～8)。步骤(6)中所述上清液与酒精以体积比1：1～2混合。
更进一步地，上述步骤(3)中沉淀物A与水以体积比1：(20～40)混合；所述水浴的温度为70～90℃，水浴时间为20～30min。
上述步骤(2)中使用的食用酒精的体积分数为60％～95％(v/v)；步骤(6)中食用酒精体积分数优选为95％。
进一步地，上述荔枝果肉膳食纤维-结合酚加合物中结合酚为表儿茶素、芦丁、槲皮素和儿茶素中的一种或多种。
进一步地，上述改善肠道微生态包括：调节肠道中短链脂肪酸合成异常和/或改善肠道菌群紊乱。
更进一步地，上述调节肠道中短链脂肪酸合成异常包括：调节肠道中乙酸、异丁酸短链脂肪酸合成和/或提高短链脂肪酸总含量；所述改善肠道菌群紊乱包括：增加有益菌比例、降低有害菌比例、调节肠道中微生物菌群多样性及丰度。
以属划分，上述调节肠道中微生物菌群丰度体现在：增加有益菌比例，乳杆菌属、Akkermansia的相对丰度上升；降低有害菌比例，脱弧硫菌属的相对丰度下降。
本发明的第二个方面，提供：
一种改善肠道微生态的制剂，包括荔枝果肉膳食纤维-结合酚加合物。
进一步地，上述制剂的形式包括食品和药品。
进一步地，上述荔枝果肉膳食纤维-结合酚加合物的制备方法如上述本发明的第一方面。
本发明的有益效果是：
1.本发明中的荔枝果肉膳食纤维-结合酚加合物制备方法简单易行、运行成本低，提取溶剂可重复循环利用，具有无污染和提取率高等优点，保证了荔枝果肉膳食纤维-结合酚加合物的品质和产量的同时，不会对环境造成负担。
2.本发明所述荔枝果肉膳食纤维-结合酚加合物不仅具有膳食纤维所具有的通便功能，也注重与荔枝果肉膳食纤维以结合态形式结合的多酚对肠道微生物的修复作用。其能够提高肠道中短链脂肪酸的含量，有效改善肠道菌群多样性和丰富度，使菌群组成、分布恢复至正常水平，可进一步用于直肠炎、便秘和其他肠道疾病引起的菌群紊乱的治疗。
附图说明
图1为实施例4不同处理组小鼠肠道微生物Alpha多样性指数(Groups组别中的A：NC对照组；B：CM模型组；C：LD低剂量组；D：HD高剂量组)，其中，Chao1和Observed species指数表征丰富度，以Shannon和Simpson指数表征多样性，以Faith_pd指数表征基于进化的多样性，以Pielou_e指数表征均匀度，以Goods coverage指数表征覆盖度；
图2为实施例4不同处理组小鼠肠道微生物在属分类水平上的分布情况(A：NC对照组；B：CM模型组；C：LD低剂量组；D：HD高剂量组)。
具体实施方式
为了使本发明的发明目的、技术方案及其技术效果更加清晰，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明。
所使用的实验材料和试剂，若无特别说明，均为常规可从商业途径所获得的耗材和试剂。
一、荔枝果肉膳食纤维-结合酚加合物的制备方法
本发明荔枝果肉膳食纤维-结合酚加合物的制备方法具体步骤如下：
(1)将新鲜荔枝果肉置于红外干燥箱中烘制8h，制成荔枝果肉干；
(2)将步骤(1)所得荔枝果肉干与95％(v/v)的食用酒精混合，料液比为1:8，打浆，所得浆液置于超声清洗机中，超声处理60min，除去上清液，留下沉淀物A；
(3)将步骤(2)所得沉淀物A与蒸馏水按1:40的比例进行混合，搅拌均匀，调节酸碱度至pH＝7.0，并置于90℃的水浴锅中水浴20min，均质2次；
(4)将步骤(3)所得均质后的浆液倒入离心管中，在6000rpm/min下离心15min，收集上清液和沉淀物B；
(5)将步骤(4)中的沉淀物B置于35℃真空干燥机中干燥，得到荔枝果肉不溶性膳食纤维-结合酚加合物；
(6)向步骤(4)所得上清液中加入95％食用酒精至上清液酒精浓度为80％，搅拌均匀后，静置沉淀1h，抽滤，除去食用酒精，得到浆状物；所得浆状物置于35℃真空干燥机中干燥，得到荔枝果肉可溶性膳食纤维-结合酚加合物。
以下所有操作中的荔枝果肉可溶性膳食纤维-结合酚加合物均为通过步骤一所得的荔枝果肉可溶性膳食纤维-结合酚加合物。
二、荔枝果肉膳食纤维-结合酚加合物提取率及体外生物活性测试
具体步骤如下：
(1)荔枝果肉膳食纤维-结合酚加合物提取率的测定：准确取果肉干，按照实施例1所述步骤进行制备，所得荔枝果肉可溶性和不溶性膳食纤维-结合酚加合物分别置于千分位电子天平秤上测量，计算提取率。
Figure BDA0002455347220000041
Figure BDA0002455347220000042
(2)结合酚的提取与测定：将实施例1所得可溶性膳食纤维-结合酚加合物和不溶性膳食纤维-结合酚加合物分别溶于氢氧化钠溶液中，在液氮保护条件下室温条件下搅拌水解。然后用盐酸中和，乙酸乙酯萃取，合并萃取后的有机溶剂，真空条件下蒸发浓缩，用85％甲醇复溶为结合酚溶液。样品或者标准品加入超纯水和福林酚试剂。静置后加入碳酸钠溶液，振荡混匀，室温条件下暗室反应90min，测定其吸光度。以没食子酸为标准，按标准曲线y＝0.0043x+0.0266；R2＝0.9976计算总酚含量，结果以每100g加合物中没食子酸当量含量表示。
(3)用ABTS+法测定抗氧化活性，以Trolox为标准物质，按标准曲线y＝-0.9773x+0.6496；R2＝0.9963计算抗氧化活性，结果以TE mmol/100g表示。
(4)高效液相色谱法测定结合酚的组成及含量：采用岛津LC-20AT型HPLC-DAD进行测定。Wondasil C18柱(250×4.6mm，5μm，日本岛津)；柱温30℃；流速为1.0mL/min；进样量：20μL；流动相A为0.1％乙酸，流动相B为甲醇；洗脱程序：0-40min，5％-25％B；40-45min，25％-35％B；45-50min，35％-60％B；检测波长280nm；外标法定量分析结合酚单体的含量，称取一定量的标准品，分别用甲醇溶解，然后配置成混标，甲醇稀释至不同浓度，HPLC分析，制作标准曲线，标准曲线浓度范围为2.5-100mg/L。
结果如表1所示，荔枝果肉膳食纤维-结合酚加合物的提取率高达45.87％，总酚含量达201.40mg/100g。说明本发明中的提取条件温和，荔枝果肉中的多酚被保留下来，且由于超声和温度的物理作用，多酚与膳食纤维结合。另一方面原有膳食纤维-结合酚加合物没有受到破坏，使得该加合物具有生物活性。实验表明，此提取方法在保证高提取率的同时，能够有效地保留多酚。此外，该加合物中的结合酚可被碱溶液所提取，说明在碱性环境下，该加合物可以将其所结合的多酚释放。通过高效液相色谱分析结果可知膳食纤维-结合酚加合物中单体酚含量最高为表儿茶素，其次是芦丁。
SDF-P为可溶性膳食纤维-结合酚加合物；IDF-P为不溶性膳食纤维-结合酚加合物。
表1.荔枝果肉膳食纤维-结合酚加合物提取率及生物活性
Figure BDA0002455347220000051
注：同一列上的不同字母表示具有显著性差异(P<0.05)；ND：未检出。
三、荔枝果肉膳食纤维-结合酚加合物对便秘小鼠肠道内短链脂肪酸的影响
具体步骤如下：
(1)构建盐酸洛哌丁胺诱导的便秘小鼠模型
受试动物被饲养在广东省蚕业与农产品加工研究所动物房，饲养温度与湿度分别为23℃，55±10％，采用12h昼夜间断照明。饲养室条件始终保持稳定，以保证试验结果的可靠性。所有实验小鼠自由进食饮水，期间不定时检查动物身体健康活动情况(每日至少一次)和更换实验鼠笼和实验垫料，未发现不健康的动物，取全部健康小鼠进行实验。80只实验小鼠经适应性饲养后，随机分成对照组、模型组、低剂量组和高剂量组。所有小鼠用基础饲料正常喂养至平均体重40g以上后再进行正式实验。正式实验开始后，对照组和模型组用基础饲料喂养，低剂量组和高剂量组分别用饲料1和2喂养，均喂养12d。饲料1和饲料2组成成分如下表所示。
表2.饲料成分表
Figure BDA0002455347220000061
注：AIN93是美国营养学会制定的纯化性标准饲料，其中M型用于成年期。
(2)小鼠结肠中的粪便短链脂肪酸含量
取实验小鼠40只，分成对照组、模型组、低剂量组和高剂量组，共4组，每组各10只。在相应饲料喂养12d后，每天定时用剂量为10mg/(kg·bw(body weight))盐酸洛哌丁胺溶液[0.1mL/(10g·bw)]给模型组、低剂量组和高剂量组的实验小鼠灌胃，对照组给予等量的蒸馏水，期间所有实验组的小鼠各自用相应的饲料喂养，连续4d。第3d开始禁食不禁水18h，第4d用盐酸洛哌丁胺溶液灌胃30min后，小鼠颈椎脱臼处死，解剖小鼠，收集结肠。收集小鼠结肠中的粪便，测定其短链脂肪酸含量。
本发明下述实验皆采用此处所收集的小鼠结肠和粪便。
结果如表2所示，结果显示模型组小鼠相比于对照组小鼠，短链脂肪酸的含量显著降低，经过低剂量和高剂量荔枝果肉膳食纤维-结合酚加合物处理的小鼠，肠道中短链脂肪酸的含量均有所升高。
表3.各组小鼠肠道短链脂肪酸含量变化
Figure BDA0002455347220000062
注：同一列上的不同字母表示具有显著性差异(P<0.05)；NC：对照组；CM：模型组；LD：低剂量组(10％)；HD：高剂量组(30％)。
四、荔枝果肉膳食纤维-结合酚加合物对改善便秘小鼠肠道菌群组成分布的影响
为评价荔枝果肉膳食纤维-结合酚加合物对改善便秘小鼠肠道菌群组成、分布的效果，具体步骤如下：
(1)取收集得到的小鼠粪便提取总DNA，用Nanodrop对DNA进行定量，并通过1.2％琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量。根据序列中的保守区域设计相应引物，并添加样本特异性Barcode序列，进而对rRNA基因可变区(单个或连续的多个)或特定基因片段进行PCR扩增。通过2％琼脂糖凝胶电泳，对文库做最终的片段选择与纯化。参照初步定量的结果，将PCR扩增回收产物进行荧光定量。根据荧光定量结果，按照每个样本的测序量需求，对各样本按相应比例进行混合。采用TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit制备测序文库。使用NovaSeq测序仪进行双端测序；
(2)采用高通量测序利用小鼠粪便对肠道微生物菌群分布进行分析；
(3)检测分析在门、属分类水平上菌群的丰度变化情况。
小鼠肠道内多样性和丰富度变化测定结果如图1所示。Chao1和Observed species指数表征丰富度，以Shannon和Simpson指数表征多样性，以Faith_pd指数表征基于进化的多样性，以Pielou_e指数表征均匀度，以Goods coverage指数表征覆盖度。结果表明，不同处理组的Goods coverage指数均接近于0.98，说明本次测序样本量足以反映群落的整体情况。模型组微生物Alpha多样性指数Chao1、Shannon和Simpson指数等均有所下降，说明模型组小鼠肠道的微生物多样性和丰度均有所下降。而低剂量组和高剂量组均能有效恢复肠道中菌群的多样性和丰富度。值得注意的是，高剂量组的改善效果最佳，能够显著提高肠道中菌群丰度，保护肠道健康。
菌群分布测定结果如表3和图2所示。在门分类水平上，模型组小鼠相比于对照组小鼠，其肠道内拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)的相对丰度均有一定程度的上升，而脱铁杆菌门(Deferribacteres)、疣微菌门(Verrucomicrobia)的相对丰度明显下降。而经过灌胃处理给予荔枝果肉膳食纤维-结合酚加合物的小鼠，肠道内菌群拟杆菌门、脱铁杆菌门和变形菌门的相对丰度与对照组相比，无显著差异，说明该加合物可以将肠道菌群分布恢复至正常水平。
在属分类水平上，模型组小鼠肠道中的乳杆菌属、Akkermansia等有益菌属相对丰度相比于对照组明显降低，而代表性有害菌属脱弧硫菌属的相对丰度明显上升。而高剂量荔枝果肉膳食纤维-结合酚加合物能够有效提高有益菌属乳酸杆属和Akkermansia的相对丰度，显著降低脱弧硫菌属的相对丰度。因此，荔枝果肉膳食纤维-结合酚加合物能够通过选择性增加有益菌群的丰度和选择性降低有害菌属的相对丰度，从而起到保护肠胃的效果。
综上所述，可以看出荔枝果肉干膳食纤维提取物不仅能够提高肠道中短链脂肪酸含量，还有助于肠道内菌群多样性、丰度以及优势菌群分布恢复至正常健康状态，选择性增加有益菌比例，降低有害菌的比例，可用于功能性食品和药品领域，具有极大的经济价值与社会价值。
表4.小鼠肠道菌群丰度在门分类水平上的变化
Figure BDA0002455347220000081
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.荔枝果肉膳食纤维-结合酚加合物在制备改善肠道微生态制剂中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述荔枝果肉膳食纤维-结合酚的制备方法具体步骤如下：
(1)将荔枝果肉烘干，制成荔枝果肉干；
(2)将步骤(1)所得荔枝果肉干与酒精混合，超声处理，过滤，得到沉淀物A；
(3)将步骤(2)所得沉淀物A与水混合，调节酸碱度，水浴，均质；
(4)离心，收集上清液和沉淀物B；
(5)干燥沉淀物B，得到荔枝果肉不溶性膳食纤维-结合酚加合物；
(6)将步骤(4)所得上清液与酒精按混合，静置沉淀，过滤除去酒精取浆状物，干燥，得到荔枝果肉可溶性膳食纤维-结合酚加合物；
(7)混合步骤(5)所得荔枝果肉不溶性膳食纤维-结合酚加合物和步骤(6)所得荔枝果肉可溶性膳食纤维-结合酚加合物，得到荔枝果肉膳食纤维-结合酚加合物。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤(2)中所述荔枝果肉干与酒精的质量体积比为1：(5～8)；步骤(6)中所述上清液与酒精以体积比1：1～2混合。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤(3)中所述沉淀物A与水以体积比1：(20～40)混合；所述水浴的温度为70～90℃，水浴时间为20～30min。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述荔枝果肉膳食纤维-结合酚加合物中的结合酚为表儿茶素、芦丁、槲皮素和儿茶素的一种或多种。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述改善肠道微生态包括：调节肠道中短链脂肪酸合成异常和/或改善肠道菌群紊乱。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述调节肠道中短链脂肪酸合成异常包括：调节肠道中乙酸、异丁酸短链脂肪酸合成和/或提高短链脂肪酸总含量；所述改善肠道菌群紊乱包括：增加有益菌比例、降低有害菌比例、调节肠道中微生物菌群多样性及丰度。
8.一种改善肠道微生态的制剂，其特征在于，包括荔枝果肉膳食纤维-结合酚加合物。
9.根据权利要求8所述的制剂，其特征在于，所述制剂的形式包括食品和药品。
10.根据权利要求8所述的制剂，其特征在于，所述荔枝果肉膳食纤维-结合酚加合物的制备方法如权利要求2所述。
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