CN113604391A - 荔枝果肉黄酮类提取物在制备促乳杆菌增殖和抗致病菌黏附制剂方面的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种荔枝果肉黄酮类提取物在制备促乳杆菌增殖和抗致病菌黏附制剂方面的应用。本发明通过实验发现，荔枝果肉黄酮类提取物可以促进乳杆菌如植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌的增殖、提高其产酸能力，且该荔枝果肉黄酮类提取物还能够选择性改善肠道内益生菌的丰度，同时抑制致病菌如小肠结肠炎耶尔森菌和致病性大肠埃希菌等对粘蛋白的黏附作用，阻止致病菌的定植，改善微生态环境，因此，可将荔枝果肉黄酮类提取物用于促乳杆菌增殖以及抑制致病菌黏附方面。

Description

荔枝果肉黄酮类提取物在制备促乳杆菌增殖和抗致病菌黏附 制剂方面的应用

技术领域

本发明涉及食品微生物技术领域，特别涉及一种荔枝果肉黄酮类提取物在制备促乳杆菌增殖和抗致病菌黏附制剂方面的应用。

背景技术

荔枝是热带和亚热带地区的特色水果，也是广东省最为主要的经济作物水果之一，口感鲜美深受人们喜爱。中医认为荔枝果肉具有健脾、益肝、养颜功效。荔枝果肉中黄酮类化合物是重要的非营养素活性成分来源。荔枝中的黄酮类化合物以QRR(槲皮素-3-O-芸香糖-7-O-α-L-鼠李糖苷)、芦丁和原花青素A2等为主。然而，荔枝中的黄酮类化合物仅有少部分被胃和小肠直接吸收利用，绝大多数需经肠道微生物酵解代谢后才能吸收利用或发挥促健康功效。并且在微生物代谢黄酮类化合物的同时，微生物的组成和丰度也受到了调节。

以往研究表明，富含QRR的荔枝果肉提取物能够改善肠道内微生物多样性和丰度，但所用提取物纯度仅为60％左右(见中国专利申请：CN111494398A-荔枝果肉多酚QRR及其组合物在制备改善肠道微生态制剂中的应用)。郑欣等在研究不同乳杆菌在荔枝汁中的发酵特性中指出荔枝汁可以促进多种乳酸菌的生长，但荔枝汁中含有大量的还原糖可以作为微生物生长的碳源，难以判定荔枝果肉黄酮是否具有促增殖的作用。陶健等研究大肠杆菌生物膜形成的影响因素，指出碳源浓度和培养基组成是生物膜形成的重要因素。然而，关于黄酮苷类提取物等非必须营养素对于致病菌的生物膜影响尚未见相关报道。另外，关于荔枝果肉黄酮类化合物对单一乳杆菌菌种促增殖作用、抗致病菌黏附效果评价等方面的研究和报道并未发现。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种荔枝果肉黄酮类提取物在促进乳杆菌增殖和/或抑制致病菌黏附中的应用。

本发明的另一目的在于提供上述荔枝果肉黄酮类提取物在制备促乳杆菌增殖和/或抑制致病菌黏附的产品中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种荔枝果肉黄酮类提取物在促进乳杆菌增殖和/或抑制致病菌黏附中的应用(非疾病治疗目的)。

所述的乳杆菌为植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌和鼠李糖乳杆菌中的至少一种；优选为植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌中的至少一种。

所述的植物乳杆菌优选为植物乳杆菌GDMCC 1.140。

所述的嗜酸乳杆菌优选为嗜酸乳杆菌GIM1.67。

所述的鼠李糖乳杆菌优选为鼠李糖乳杆菌GDMCC 1.1798。

所述的致病菌为小肠结肠炎耶尔森菌和致病性大肠埃希菌中的至少一种。

所述的小肠结肠炎耶尔森菌优选为小肠结肠炎耶尔森菌NCTC 10406。

所述的致病性大肠埃希菌优选为大肠埃希菌ATCC 25922。

所述的荔枝果肉黄酮类提取物抑制小肠结肠炎耶尔森菌和/或大肠埃希菌等对肠道粘蛋白的黏附作用，从而促使小肠结肠炎耶尔森菌和/或大肠埃希菌死亡。

所述的荔枝果肉黄酮类提取物为含有槲皮素-3-O-芸香糖-7-O-α-L-鼠李糖苷(QRR)的提取物；优选为含有槲皮素-3-O-芸香糖-7-O-α-L-鼠李糖苷(QRR)和其他黄酮类化合物的提取物；其中，其他黄酮类化合物为芦丁、原花青素A2、槲皮素、儿茶素、原花青素B2、异鼠李素-3-O-芸香糖苷中的一种或多种；更优选为含有70wt％～85wt％槲皮素-3-O-芸香糖-7-O-α-L-鼠李糖苷(QRR)，以及含有10wt％～15wt％其他黄酮类化合物的提取物；其中，其他黄酮类化合物为芦丁、原花青素A2、槲皮素、儿茶素、原花青素B2、异鼠李素-3-O-芸香糖苷中的一种或多种。

所述的荔枝果肉黄酮类提取物优选为通过如下方法制备得到：

(1)将新鲜荔枝去壳、去核，得到新鲜荔枝果肉；

(2)将步骤(1)中得到的新鲜荔枝果肉加入到有机溶剂中，打浆，得到浆状物；然后将浆状物进行超声提取，得到荔枝浆液；再将荔枝浆液，抽滤，收集滤液，浓缩，得到浓缩液I；

(3)将步骤(2)中得到的浓缩液I通过HPD-100大孔树脂进行吸附，并用蒸馏水冲洗(除去绝大部分糖分及其大分子杂质)，再用有机溶剂冲洗HPD-100大孔树脂，收集滤液，浓缩，得到浓缩液II；

(4)将步骤(2)中得到的浓缩液II通过聚酰胺树脂进行吸附，用蒸馏水冲洗树脂，然后分别用体积百分比40、60、80和100％的有机溶剂冲洗聚酰胺树脂，收集各组分滤液，再基于液相色谱分析合并含有黄酮类化合物的组分滤液，冷冻干燥，得到荔枝果肉黄酮类提取物。

步骤(1)中所述的新鲜荔枝为常规市售的新鲜荔枝；优选为无腐烂和病虫害、大小、形状、颜色均一的成熟荔枝。

步骤(1)中所述的打浆的条件为：6000rpm/min打浆2min。

步骤(2)和(3)中所述的有机溶剂为食用酒精；优选为体积百分比80％的食用酒精。

步骤(2)中所述的超声提取的条件为：35～50℃、100～150w超声提取25min以上；优选为40℃、120w超声提取25min。

步骤(2)中所述的超声提取的次数优选为3次以上。

步骤(2)和(3)中所述的浓缩为采用旋转蒸发的方式进行浓缩；优选为在40℃下、采用旋转蒸发的方式进行浓缩。

步骤(2)所述的浓缩为浓缩至原体积的20％～40％。

步骤(3)中所述的HPD-100大孔树脂吸附所用的玻璃柱为直径3～5cm、长度40～60cm的玻璃柱。

步骤(3)中所述的浓缩液I、蒸馏水和有机溶剂的体积比为1：1：3。

步骤(3)中所述的浓缩液II与所述浓缩液I的体积比为1：1。

步骤(4)中所述的聚酰胺树脂吸附所用的玻璃柱为直径3～5cm、长度40～60cm的玻璃柱。

步骤(4)中所述的浓缩液II、蒸馏水和有机溶剂的体积比为1：1：3。

步骤(4)中所述的有机溶剂为食用酒精。

步骤(4)中所述的收集各组分滤液优选为收集用体积百分比40、60和80％的有机溶剂冲洗的组分滤液。

上述荔枝果肉黄酮类提取物在制备促乳杆菌增殖和/或抑制致病菌黏附的产品中的应用。

所述的乳杆菌为植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌和鼠李糖乳杆菌中的至少一种；优选为植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌中的至少一种。

所述的植物乳杆菌优选为植物乳杆菌GDMCC 1.140。

所述的嗜酸乳杆菌优选为嗜酸乳杆菌GIM1.67。

所述的鼠李糖乳杆菌优选为鼠李糖乳杆菌GDMCC 1.1798。

所述的致病菌为小肠结肠炎耶尔森菌和致病性大肠埃希菌中的至少一种。

所述的小肠结肠炎耶尔森菌优选为小肠结肠炎耶尔森菌NCTC 10406。

所述的致病性大肠埃希菌优选为大肠埃希菌ATCC 25922。

所述的产品的剂型包括溶液、散剂、胶囊剂以及泡腾剂等。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明中的荔枝果肉黄酮类提取物的提取方法具有提取率高，操作简单，成本低廉等优点。

(2)本发明中的荔枝果肉黄酮类提取物能够选择性改善肠道内益生菌的丰度，同时抑制致病菌(如小肠结肠炎耶尔森菌和致病性大肠埃希菌等)对粘蛋白的黏附作用，阻止致病菌定植，改善微生态环境，也可以进一步用于肠道微生态失调相关疾病的治疗。

(3)本发明中的荔枝果肉黄酮类提取物可以提高鼠李糖乳杆菌的产酸能力，对嗜酸乳杆菌无抑制作用，可以促进植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌的增殖，荔枝果肉黄酮类提取物干预后具有明显促进酵解液浊度、产酸和活菌数的功能。

附图说明

图1是荔枝果肉黄酮类提取物HPLC图谱。

图2是荔枝果肉黄酮类提取物对三种乳杆菌酵解液酸碱性的影响图；其中，A为鼠李糖乳杆菌；B为嗜酸乳杆菌；C为植物乳杆菌。

图3是荔枝果肉黄酮类提取物对三种乳杆菌发酵过程中活菌数的影响图；其中，A为鼠李糖乳杆菌；B为嗜酸乳杆菌；C为植物乳杆菌。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。除非特别说明，本发明所用实验材料和试剂均可通过市售获得。

实施例中涉及的新鲜荔枝(荔枝品种：白蜡，购于广州水果市场)为无腐烂和病虫害、大小、形状、颜色均一的成熟荔枝果实。

实施例中涉及的植物乳杆菌为植物乳杆菌GDMCC 1.140，嗜酸乳杆菌为嗜酸乳杆菌GIM1.67以及鼠李糖乳杆菌为鼠李糖乳杆菌GDMCC 1.1798，均购于广东省微生物菌种保藏中心。

实施例中涉及的致病菌小肠结肠炎耶尔森菌NCTC 10406和大肠埃希菌ATCC25922均购于广东省微生物菌种保藏中心。

实施例1：荔枝果肉中黄酮类化合物的提取与纯化

(1)将新鲜荔枝去壳、去核，得到新鲜荔枝果肉；

(2)将步骤(1)所得到的新鲜荔枝果肉与80％(v/v)食用酒精按质量比为1：2的比例混合，置于转速为6000rpm/min的飞利浦榨汁机中打浆2min，得到浆状物；

(3)将步骤(2)所得到的浆状物置于功率为120w，温度为40℃的超声提取仪中提取25min，得到荔枝浆液；

(4)将步骤(3)所得到的荔枝浆液进行抽滤，分离出荔枝果渣，收集滤液，重复提取3次，合并滤液；然后将所得滤液置于温度为40℃旋转蒸发仪中进行浓缩至体积为原溶液体积的20％～40％，得到浓缩液I；

(5)将步骤(4)所得到的浓缩液I通过HPD-100大孔树脂(沧州宝恩吸附材料科技有限公司；填充的玻璃柱的直径为3～5cm，长度为40～60cm)吸附，用蒸馏水冲洗除去绝大部分糖分及其大分子杂质；用体积三倍于蒸馏水的80％(v/v)食用酒精按冲洗HPD-100树脂，收集滤液，于40℃下旋转蒸发进行浓缩至体积约与浓缩液I相等，得到浓缩液II；

(6)将步骤(5)所得的浓缩液II通过聚酰胺树脂(沧州宝恩吸附材料科技有限公司；填充的玻璃柱的直径为3～5cm，长度为40～60cm)吸附，用蒸馏水冲洗树脂；然后分别用体积三倍于蒸馏水的20、40、60、80和100％(v/v)食用酒精分别冲洗聚酰胺树脂，收集各组分滤液，并用于配置二极管阵列检测器和安捷伦Zorbax SB-C18柱(250mm×4.6mm，5μm，Palo Alto，CA)的安捷伦1260高效液相色谱系统分析各组分滤液的成分，设置的参数为：进样量，20μL；柱温，30℃；流速，1.0mL min^-1。流动相为乙腈(溶剂A)和0.4％(v/v)冰醋酸(溶剂B)。梯度洗脱程序的应用如下：0–40min，5％–25％A；40–45min，25％–35％A；45–50min，35％–50％A。基于图谱结果合并含黄酮类化合物的组分滤液(本实验收集了20％、40％和80％组分)。

(7)置于-80℃冷冻干燥箱中进行干燥至样品呈粉末状，所得固形物即为荔枝果肉中黄酮类化合物提取物(LPFE)

(8)结果

荔枝果肉中黄酮类提取物的HPLC图谱如图1所示，各组分含量如表1所示。从表1中可以看出：槲皮素-3-O-芸香糖-7-O-α-L-鼠李糖苷(QRR)含量最高，达到747.65±18.22mg/g，其次为芦丁和原花青素A2，含量分别为62.31±4.21mg/g和25.02±1.02mg/g；另外，还含有其他黄酮类化合物如槲皮素、儿茶素、原花青素B2、异鼠李素-3-O-芸香糖苷。

表1荔枝果肉黄酮类提取物中各组分含量

组成	含量(mg/g)
		槲皮素-3-O-芸香糖-7-O-α-L-鼠李糖苷	747.65±18.22
芦丁	62.31±4.21
		槲皮素	10.26±0.24
原花青素A2	25.02±1.02
		儿茶素	1.07±0.01
原花青素B2	7.26±1.01
		异鼠李素-3-O-芸香糖苷	3.66±0.19
水分含量	95.33±2.35
		还原糖含量	57.21±6.81

实施例2：基于结肠发酵模型评价荔枝果肉黄酮类化合物提取物(LPFE)对不同乳杆菌的促增殖作用、抗黏附作用及其组成变化

(1)LPFE溶液的制备与灭菌：准确称取0.5g LPFE粉末置于50mL无菌烧杯中，加入20mL无菌PBS缓冲溶液，搅拌均匀后，置于功率为150～220w超声清洗机中超声处理20min，洗涤烧杯，用PBS缓冲溶液定容至50mL，121℃下灭菌15min，获得无菌LPFE溶液。

(2)预培养基的制备：取1g胰蛋白胨，0.5g酵母提取物，1g氯化钠，0.5g葡萄糖和0.6g麦芽糖，溶解于100mL蒸馏水中，121℃灭菌15min。

(3)生长培养基的制备：取蛋白胨2g，酵母提取物2g，氯化钠0.1g，K₂HPO₄ 0.04g，KH₂PO₄ 0.04g，MgSO₄·7H₂O 0.01g，CaCl₂·6H₂O 0.01g(CaCl₂5.1mg),NaHCO₃ 2g，血红素0.02g，盐酸半胱氨酸0.5g，猪胆盐0.5g，刃天青1mg，吐温80 2mL和维生素K1 10uL溶解于1000mL蒸馏水中。121℃灭菌15min。

(4)菌悬液的制备：分别将植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌和鼠李糖乳杆菌置于液体MRS肉汤培养基中增殖培养15h，通过离心(12000g，4℃)15min收集菌体沉淀，采用PBS溶液洗涤菌体沉淀，最后菌体沉淀溶解在步骤(2)制备的预培养基中，以获得浓度约为8.0Log CFUmL^-1(10⁸CFU mL^-1)的菌悬液。

(5)模拟结肠发酵：分别取1mL浓度为10mg/mL的无菌LPFE溶液、1mL的菌悬液和8mL的生长培养基进行混合，置于37℃厌氧培养箱中培养0，12，24，36，48h后取出发酵液，用于后续分析(3次重复)。以PBS缓冲液代替LPFE溶液作为空白对照。

(6)酵解液pH和活菌数的测定：采用pH计分别测定各时间点酵解液的pH值变化；酵解液中活细胞数通过MRS琼脂培养基平板计数进行分析。

(7)酵解液中黄酮类化合物组成分析：分别将发酵液进行离心(12000g，4℃)15min后，收集上清液。使用安捷伦1260高效液相色谱系统(配备二极管阵列检测器)和安捷伦Zorbax SB-C18柱(250mm×4.6mm，5μm，Palo Alto，CA)对酵解液中的单体酚进行分析和定量，在分析之前，通过0.45μm的滤膜过滤上清液，并将所得滤液注入样品瓶中。设置的参数为：进样量，20μL；柱温，30℃；流速，1.0mL min^-1。流动相为乙腈(溶剂A)和0.4％(v/v)冰醋酸(溶剂B)。梯度洗脱程序的应用如下：0–40min，5％–25％A；40–45min，25％–35％A；45–50min，35％–50％A。根据标准物质的保留时间，确定在280nm波长下检测到的峰。用相应酚类物质建立的标准曲线计算各酚类化合物的含量，含量以mg/g LPFE表示。

(8)抗黏附效果评价：采用小肠结肠炎耶尔森菌NCTC 10406和大肠埃希菌ATCC25922研究了LPFE酵解液的抗粘附能力。在密度计上分别将过夜培养的菌悬液浓度调节至8.0Log CFU mL^-1。以猪回肠粘蛋白(1mg/mL，源叶生物)为基质，在平底96孔板中进行抗粘附试验。将100μL浓度为1mg/mL的猪回肠粘蛋白溶液加入到平板孔上，静置1h，随后在4℃下培养过夜。用200μL PBS缓冲液洗涤平板孔两次后，加入100μL(20mg/mL)牛血清白蛋白(BSA)在4℃下培养2h。再次用200μL PBS缓冲液洗涤平板孔两次，以去除未结合的BSA。加入50μL细菌悬浮液(约8～9Log CFU mL^-1)到孔中。在空白对照组中，添加50μL PBS缓冲液；在LPFE组中，添加50μL的LPFE溶液(10mg/mL)；在实验组中，添加鼠李糖乳杆菌或植物乳杆菌酵解48h后的上清液(酵解上清液的制备同上述步骤(5))(命名为：LPFE-植物乳杆菌，LPFE-鼠李糖乳杆菌)，然后在37℃下培养1h。培养后，用200μL无菌PBS缓冲液清洗孔5次，以去除未结合的细菌。再加入200μL 0.5％(v/v)Tritonx-100分离附着细菌。在所有情况下，通过在特定培养基上培养来测定活细胞计数。每次试验一式三份，每次试验有两个以上的重复。抑制微生物黏附的百分比计算如下：

CFU：活细胞数。

(9)结果与讨论

①三种乳杆菌的发酵液pH值测定结果如图2所示：在三种乳杆菌发酵荔枝果肉黄酮类提取物过程中，酵解液的pH逐渐降低，说明存在有机酸等酸性物质的生成。在0h时，空白对照组初始的pH均略高于LPFE组(p＜0.05)。在发酵过程中，鼠李糖乳杆菌发酵过程中的LPFE组的pH值明显低于空白对照组；而嗜酸乳杆菌和植物乳杆菌发酵过程中的LPFE与空白组间pH没有显著性差异(p＞0.05)，以上结果提示LPFE可能促进鼠李糖乳杆菌的产酸能力

②三种乳杆菌的发酵液中活菌数测定结果如图3所示：在三种乳杆菌在发酵荔枝果肉黄酮类提取物过程中，菌落数均呈增加趋势。与空白组相比，LPFE组嗜酸乳杆菌的活菌数并没有显著增加，但显著提高了植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌的活菌数，这说明荔枝果肉黄酮提取物对嗜酸乳杆菌无抑制作用，并且可促进植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌的增殖，暗示荔枝果肉黄酮类提取物是一种潜在的益生元。

③三种乳杆菌的酵解液中单体酚组成变化如表2所示：在酵解24h时，鼠李糖乳杆菌对QRR的降解率最高，达到17.37％；在酵解12h后，芦丁的降解率达到16.15％，但在12～24h发酵过程中，芦丁含量显著上升(p＜0.05)，可能的原因是：第一，在发酵过程中，可能出现分子重排，导致上述两种物质有所增加；QRR七位上的糖苷键断裂导致芦丁增加；第二，生物实验过程中微生物对于物质的降解能力差异较大。嗜酸乳杆菌对QRR和芦丁的降解作用较弱，发酵48h后降解率最高，仅为6.07％和7.65％。然而，植物乳杆菌可以有效利用荔枝果肉黄酮类提取物，对QRR和芦丁的降解作用随发酵周期的延长而增强；发酵48h后，酵解液中QRR和芦丁的含量分别降低64.36％和71.99％，这也解释了荔枝果肉黄酮类提取物的促增殖作用。

表2三种乳杆菌酵解荔枝果肉黄酮类提取物后酚类物质组成的影响

注：同一列上的不同字母表示具有显著性差异(p<0.05)。

④不同乳杆菌酵解对LPFE抗黏附性的影响如表3所示：未发酵的荔枝果肉黄酮类提取物可以有效抑制小肠结肠炎耶尔森菌NCTC 10406和大肠埃希菌ATCC 25922对粘蛋白的黏附作用，抗黏附率分别为26.23％和20.72％。而鼠李糖乳杆菌和植物乳杆菌发酵48h后，荔枝果肉黄酮类提取物的抗黏附活力均有所提高，其中鼠李糖乳杆菌酵解作用后，荔枝果肉黄酮类提取物的抗黏附活性优于植物乳杆菌酵解后的荔枝果肉黄酮类提取物。

表3不同乳杆菌酵解对LPFE抗黏附性的影响

注：LPFE:未发酵的荔枝果肉黄酮类提取物；LPFE-植物乳杆菌：植物乳杆菌酵解48h后的荔枝果肉黄酮类提取物；LPFE-鼠李糖乳杆菌：鼠李糖乳杆菌酵解48h后的荔枝果肉黄酮类提取物。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种荔枝果肉黄酮类提取物在促进乳杆菌增殖和/或抑制致病菌黏附中的应用，其特征在于：

所述的乳杆菌为植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌和鼠李糖乳杆菌中的至少一种；

所述的致病菌为小肠结肠炎耶尔森菌和致病性大肠埃希菌中的至少一种；

所述的荔枝果肉黄酮类提取物为含有槲皮素-3-O-芸香糖-7-O-α-L-鼠李糖苷的提取物。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：

所述的乳杆菌为植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌中的至少一种；

所述的荔枝果肉黄酮类提取物为含有槲皮素-3-O-芸香糖-7-O-α-L-鼠李糖苷和其他黄酮类化合物的提取物；其中，其他黄酮类化合物为芦丁、原花青素A2、槲皮素、儿茶素、原花青素B2、异鼠李素-3-O-芸香糖苷中的一种或多种。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：

所述的荔枝果肉黄酮类提取物为含有70wt％～85wt％槲皮素-3-O-芸香糖-7-O-α-L-鼠李糖苷，以及含有10wt％～15wt％其他黄酮类化合物的提取物；其中，其他黄酮类化合物为芦丁、原花青素A2、槲皮素、儿茶素、原花青素B2、异鼠李素-3-O-芸香糖苷中的一种或多种。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：

所述的植物乳杆菌为植物乳杆菌GDMCC 1.140；

所述的嗜酸乳杆菌为嗜酸乳杆菌GIM1.67；

所述的鼠李糖乳杆菌为鼠李糖乳杆菌GDMCC 1.1798；

所述的小肠结肠炎耶尔森菌为小肠结肠炎耶尔森菌NCTC 10406；

所述的致病性大肠埃希菌为大肠埃希菌ATCC 25922。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：

所述的荔枝果肉黄酮类提取物通过如下方法制备得到：

(1)将新鲜荔枝去壳、去核，得到新鲜荔枝果肉；

(2)将步骤(1)中得到的新鲜荔枝果肉加入到有机溶剂中，打浆，得到浆状物；然后将浆状物进行超声提取，得到荔枝浆液；再将荔枝浆液，抽滤，收集滤液，浓缩，得到浓缩液I；

(3)将步骤(2)中得到的浓缩液I通过HPD-100大孔树脂进行吸附，并用蒸馏水冲洗，再用有机溶剂冲洗HPD-100大孔树脂，收集滤液，浓缩，得到浓缩液II；

(4)将步骤(2)中得到的浓缩液II通过聚酰胺树脂进行吸附，用蒸馏水冲洗树脂，然后分别用体积百分比40、60、80和100％的有机溶剂冲洗聚酰胺树脂，收集各组分滤液，再基于液相色谱分析合并含有黄酮类化合物的组分滤液，冷冻干燥，得到荔枝果肉黄酮类提取物。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：

步骤(2)和(3)中所述的有机溶剂为食用酒精；

步骤(3)中所述的浓缩液I、蒸馏水和有机溶剂的体积比为1：1：3；

步骤(4)中所述的有机溶剂为食用酒精；

步骤(4)中所述的浓缩液II、蒸馏水和有机溶剂的体积比为1：1：3。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：

步骤(2)和(3)中所述的有机溶剂为体积百分比80％的食用酒精。

8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：

步骤(1)中所述的打浆的条件为：6000rpm/min打浆2min；

步骤(2)中所述的超声提取的条件为：35～50℃、100～150w超声提取25min以上；

步骤(2)中所述的超声提取的次数为3次以上；

步骤(2)和(3)中所述的浓缩为采用旋转蒸发的方式进行浓缩；

步骤(2)所述的浓缩为浓缩至原体积的20％～40％；

步骤(3)中所述的浓缩液II与所述浓缩液I的体积比为1：1。

9.权利要求1～8任一项中所述的荔枝果肉黄酮类提取物在制备促乳杆菌增殖和/或抑制致病菌黏附的产品中的应用，其特征在于：

所述的乳杆菌为植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌和鼠李糖乳杆菌中的至少一种；

所述的致病菌为小肠结肠炎耶尔森菌和致病性大肠埃希菌中的至少一种。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：

所述的乳杆菌为植物乳杆菌和鼠李糖乳杆菌中的至少一种。

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