KR20110129605A

KR20110129605A - 더덕의 항균 활성 증진을 목적으로 하는 유산균 락토바실러스 불가리쿠스의 최적배양배지 및 그를 이용한 더덕 발효 방법과 발효물

Info

Publication number: KR20110129605A
Application number: KR1020100049084A
Authority: KR
Inventors: 이현용; 정명훈; 안주희; 권민철; 김승섭; 오성호; 최운용; 서용창
Original assignee: 강원대학교산학협력단
Priority date: 2010-05-26
Filing date: 2010-05-26
Publication date: 2011-12-02
Also published as: KR101150179B1

Abstract

본 발명은 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus)를 이용하여 더덕을 발효시키는 것과 관련된 것이다. 더욱이 본 발명은, 위와 같이 더덕 발효를 함에 있어서 발효물의 항균 활성 증진에 초점을 두고 있다.
본 발명은 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus)를 이용하여 산출되는 더덕 발효물의 항균 활성 증진을 달성하기 위하여, 락토바실러스 불가리쿠스의 최적 배양 배지를 제공한다. 또한 그와 같은 배지에서 활성화된 락토바실러스 불가리쿠스를 이용하여 더덕을 발효시키는 방법 및 그와 같이 하여 획득된 발효물을 제공한다.
상기와 같은 본 발명은, pH는 6이고 fructo-oligosaccharide를 25~35 g/L 포함하는, 더덕 발효를 위한 Lactobacillus bulgaricus의 최적 배양 배지인 것을 특징으로 한다.
본 발명은 또한 상기한 바와 같은 배양 배지를 이용하여 활성화한 Lactobacillus bulgaricus를 더덕에 접종하고 발효시켜서 얻어지는 더덕의 발효물인 것을 특징으로 한다.

Description

더덕의 항균 활성 증진을 목적으로 하는 유산균 락토바실러스 불가리쿠스의 최적배양배지 및 그를 이용한 더덕 발효 방법과 발효물{A optimum culture media of Lactobacillus bulgaricus for the fermentation of Codonopsis lanceolata, the fermenting method using the culture media, and the product}

본 발명은 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus)를 이용하여 더덕을 발효시키는 것과 관련된 것이다. 더욱이 본 발명은, 위와 같이 더덕 발효를 함에 있어서 발효물의 항균 활성 증진에 초점을 두고 있다.

본 발명은 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus)를 이용하여 산출되는 더덕 발효물의 항균 활성 증진을 달성하기 위하여, 락토바실러스 불가리쿠스의 최적 배양 배지를 제공한다. 또한 그와 같은 배지에서 활성화된 락토바실러스 불가리쿠스를 이용하여 더덕을 발효시키는 방법 및 그와 같이 하여 획득된 발효물을 제공한다.

더덕(Codonopsis lanceolatae)은 독특한 향과 맛을 지닌 도라지과에 속하는 다년생 초본으로서 예로부터 식용으로 이용되어 왔다. 백삼, 사삼, 행엽, 가덕, 지취 등 여러 가지 이름으로 불리며, 한국, 중국(만주지방), 일본의 산간지방에서 자생한다.

더덕은 특히, triterpenoid계 saponin과 당질 및 섬유질을 함유하고 있으며, 아미노산, 무기질 외에 스테롤, triterpenoid, cycloartenol, N-formylharman, l-carbomethoxy-β-carboline, perlolyrine, norharman 및 휘발성 향기성분 등을 함유하고 있다.

한방에서는 가래를 없애주는 약재로 이용되어 강장, 해열, 거담, 폐결핵 등의 치료 목적으로 사용되어 왔다. 또한 특유의 풍미와 탄수화물, 단백질 외에도 칼슘, 인, 철분 등 무기질과 비타민 B₁, 비타민 B₂가 풍부하여 식용으로도 널리 이용되어 왔다.

이러한 더덕에 관해서는 연구를 통해 중성지질과 콜레스테롤 축적 억제를 통한 혈청지질 감소와 항산화 효과, 항바이러스, 항알러지 효과 등이 알려져 있다. 또한, 이러한 효과는 더덕에 함유된 iridoid glycoside, 리그닌, isofraxidin 등에 의한 것으로 밝혀지고 있다. 그 외에 흉선세포의 증식과 복강 마크로파지의 활성을 증가시키는 등의 약리 작용이 있는 것으로 보고되어 있다.

그러나 더덕은 등급외품이 40~50% 이상으로서, 재배 농가의 수익성이 악화되고 차년도 재배면적의 확대가 어려운 실정에도 불구하고 중하위품 더덕의 가공 기술이 거의 초보적 수준에 머물러 있어 단순 양념구이 포장, 장아찌, 배추절임, 사탕, 단순 추출에 의한 일부 화장품 소재 등으로만 소진되고 있다. 더욱이 더덕 향에 대한 기호도의 연령별 편차가 극심하고 인삼과 대비되어 상대적으로 하위 농산품으로 인식되어 국내 및 수출용으로 개발이 매우 저조한 상황이다.

이와 함께 더덕은 종래 뿌리작물로 조직이 치밀하게 형성되어 있어 높은 유용성분 함량에 비해 상응하는 활성을 나타내지 못했던 활용상의 문제점이 있었다.

한편 본 발명에서 사용하는 락토바실러스(Lactobacillus) 균은 막대기 모양의 간균이며 그람양성이다. 아라비노스, 글루코스, 프럭토스, 갈락토스, 말토스, 슈크로스, 덱스트란, 라피노스와 트레할로스 등을 발효하여 젖산을 생성하며, 자연계에서 가장 분포가 넓은 젖산균 중의 하나이다. 유럽에서는 프로바이오틱(probiotic) 균주로서 락토바실러스를 요구르트에 첨가하고 있다. 하지만 락토바실러스는 영양 요구가 복잡하여 고가의 배지를 필요로 하고, 자신이 생성한 산과 산에 의해 조정되는 낮은 pH 환경에서 생장이 저해되거나 사멸하는 등 배양 방법이 까다로우며, 산소에 민감한 혐기성이라는 특성으로 인해 고농도 배양이 어려워, 실험실 단위의 연구만이 진행되고 산업화를 위한 대량생산은 거의 이루어지지 못하고 있다.

본 발명의 목적은 기존의 발효 더덕 제조 시 유산균의 고효율 배양에 있어 문제점으로 지적되었던 까다로운 생육조건과 기능성 성분 추출 효율의 증진을 위해, 더덕 발효에 있어 생존능이 양호한 Lactobacillus bulgaricus의 배양 배지 성분 조성의 최적화를 꾀하고, 이를 통해 종래 뿌리작물로 조직이 치밀하게 형성되어 있어 높은 유용성분 함량에 비해 상응하는 활성을 나타내지 못했던 더덕 활용의 문제점을 극복하여 활성 성분 수율의 최대화 및 항균활성 향상을 달성하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 또한 더덕의 발효를 통하여 항균활성 증진 효과를 최대화하고 활성 성분 수득의 향상을 통하여 항균 식품 소재로서의 가치를 높이는 데 목적이 있다.

이를 위해 발명자들은 기존 MRS 배지의 성분 변경을 통해 최적화된 배지 조성을 찾아내어 새로운 유기물 생성과 미생물의 물질전환으로 인한 신물질 생성을 통한 생체 적용성 증가, 폭 넓은 활성 분야로의 적용을 이루었다.

상기와 같은 본 발명은, pH는 6이고 fructo-oligosaccharide를 25~35 g/L 포함하는, 더덕 발효를 위한 Lactobacillus bulgaricus의 최적 배양 배지인 것을 특징으로 한다. 즉 본 발명은, 발효 더덕의 제조에 있어서 락토바실러스의 성장 촉진 인자로 잘 알려진 프락토올리고당의 첨가 및 배지 조성 최적화를 통해 발효 더덕의 항균 활성이 증진된 것을 기본적인 특징으로 한다.

더 구체적으로 본 발명은, 25~35 g/L fructo-oligosaccharide, 35~45 g/L maltose, 8~12 g/L 대두박, 8~12 g/L malt extract, 4~6 g/L yeast extract, 4~6 g/L sodium acetic acid, 7~9 g/L disodium phosphate, 1~3 g/L ammonium citric acid, 1 g/L tween 80, 0.5 g/L MgSO₄·7H₂O, 1 g/L K₂HPO₄, 0.5 g/L MnSO₄·7H₂O을 포함하는, 더덕 발효를 위한 Lactobacillus bulgaricus의 최적 배양 배지인 것을 특징으로 한다.

이때 배양 배지의 pH는 6인 것을 특징으로 한다.

본 발명은 또한 상기한 바와 같은 배양 배지를 이용하여 활성화한 Lactobacillus bulgaricus를 더덕에 접종하고 발효시켜서 얻어지는 더덕의 발효물인 것을 특징으로 한다.

또한 본 발명은,

(1) 더덕을 수세하고 건조시키는 단계;

(2) 더덕을 분쇄한 후, 효과적인 미생물의 증식 및 발효를 위해 100~150℃의 온도에서 5~25분간 증숙, 멸균하는 단계;

(3) pH는 6이고, 25~35 g/L fructo-oligosaccharide, 35~45 g/L maltose, 8~12 g/L 대두박, 8~12 g/L malt extract, 4~6 g/L yeast extract, 4~6 g/L sodium acetic acid, 7~9 g/L disodium phosphate, 1~3 g/L ammonium citric acid, 1 g/L tween 80, 0.5 g/L MgSO₄·7H₂O, 1 g/L K₂HPO₄, 0.5 g/L MnSO₄·7H₂O을 포함하는 배양 배지에 Lactobacillus bulgaricus를 접종하여 균을 활성화시키는 단계; 및

(4) 상기 단계 (2)까지 완료된 더덕에, 단계 (3)을 통해 활성화된 Lactobacillus bulgaricus를 접종하여 혐기적 조건하에서 더덕을 발효시키는 단계;로 이루어지는, 더덕의 발효 방법인 것을 특징으로 한다.

또한 상기 발효 방법에 의해 얻어지는 더덕의 발효물인 것을 특징으로 한다.

종래 더덕이 뿌리작물로 조직이 치밀하게 형성되어 있어 높은 유용성분 함량에 비해 상응하는 활성을 나타내지 못했던 활용상의 문제점이 있었던 점을 개선하고자, 발명자들은 미국 식약청에서 안전성 및 안정성을 인정한 균으로서 식품에 사용 가능하며 인체에 무해하고 유익한 기능성을 나타내는 활성 미생물인 GRAS 균을 이용하여 더덕 발효를 하도록 하는 한편, 그에 따른 최적 배양 배지를 고안함으로써, 항균활성 및 기능성 성분 추출이 증진된 더덕의 발효물을 얻을 수 있었다.

이러한 최적 배양 배지의 조성에 있어서 기존의 MRS 배지와 다르게 사용된 영양성분으로서의 대두박은 두과작물인 대두로부터 착유 후 생기는 산물로, 현재 가장 많이 사용되는 식물성 단백질 사료이다. 대두박은 가장 경제적이고 고품질의 식물성 단백질로 콩으로부터 기름을 짤 때 생기는 부산물이다. 이러한 잉여자원의 활용으로 락토바실러스의 고농도 배양이 가능한 최적배양배지 조성을 가능하게 하였다.

또한 malt extract는 맥아를 당화, 여과시킨 것으로 말토오스(maltose) 등의 당을 많이 함유하고 있어 락토바실러스의 생육을 촉진하는 효과를 가져온다.

전술한 바와 같이 락토바실러스는 여러 가지 문제점을 가지고 있어서 산업화를 위한 대량생산은 거의 이루어지지 못하였는바, 본 발명에서는 유산균의 성장을 돕는 성분인 프리바이오틱스(prebiotics)의 개념을 도입하여 락토바실러스 불가리쿠스의 성장 촉진 인자로서 프락토올리고당(fructo-oligosaccharide, FOS)을 첨가하는 한편, 배지 조성의 최적화를 통하여 더덕 발효 시 고농도 배양에 의한 효율의 증가와 항균활성이 증진된 발효물 생산의 향상을 이루었다.

상기 프락토올리고당은 유산균의 성장을 촉진하고 설탕에서 만들어져 설탕구조와 매우 유사한 올리고당이기 때문에 영양, 생리적 기능이 전혀 다르지 않다. 또한, 프락토올리고당은 난소화 흡수성의 올리고당이기 때문에 인간의 체내에 생식하는 미생물에 의해 체내 이용성이 다르며, 특히 장내 유용균 락토바실러스균에 의해 잘 이용된다. 이 결과로서 변비, 변성 개선효과 및 지질개선효과와 같은 생리작용을 나타낸다는 것이 판명되었다. 이러한 프락토올리고당은 섭취하여도 난소화성의 저칼로리 올리고당으로 혈당치, 인슐린의 상승이 없다는 장점이 있다. 따라서 더덕 발효 시 락토바실러스 불가리쿠스의 생육 증진 및 고효율 배양이 가능한 프락토올리고당의 첨가 및 배양배지 조성 최적화 기술을 적용한 본 발명을 통해 항균활성이 증진된 발효 더덕 발효물의 제조가 가능하여 새로운 항균 식품소재로서의 활용을 가능하게 하는 계기가 될 수 있다.

본 발명에 따르면 Latobacillus bulgaricus의 최적 생육을 위한 배양 배지의 최적 조성을 통해 더덕 발효물의 항균 활성 증진과 기능성 성분 추출 수율 향상을 꾀할 수 있다.

또한 본 발명에 따르면 더덕의 발효 시 배양배지의 프락토올리고당 첨가 및 배지 조성 최적화를 통해 Lactobacillus bulgaricus의 고농도 배양이 가능하게 되고, 그에 따라 더덕 발효물의 항균 활성 증진을 극대화함으로써 식품 및 의약품 소재로서의 더덕 발효물의 가치가 크게 증진된다.

이하, 본 발명의 항균활성을 가지는 발효 더덕 제조방법과 실시예를 위한 처리과정을 공정별로 상세히 설명한다.

[제1공정 : 더덕의 수세/건조 공정]

더덕을 수세하고 건조시킨다. 일반 생체상태의 더덕으로 발효시킬 수도 있으나, 발효 효율의 측면에서 수세한 더덕을 열풍 또는 원적외선 조사와 같이 통상적으로 사용되는 건조 방법을 통하여 건조한 후 수분을 제거한 다음 발효하는 것이 바람직하다.

[제2공정 : 더덕의 증숙 및 멸균 공정]

효과적인 미생물의 증식 및 발효를 위해 더덕을 100~150℃의 온도에서 5~25분간 증숙 및 멸균하는 공정이다.

실시예에서는, 단단한 조직으로 이루어진 더덕의 발효를 좀 더 쉽고 용이하게 하기 위해 건조한 더덕을 잘게 분쇄한 후 121℃에서 15분간 autoclave를 처리하여 더덕의 증숙 및 background bacteria를 멸균하였다. 멸균 처리된 더덕과 증류수를 1:1로 혼합한 후 균질화하여 균 접종이 가능한 상태로 준비하였다.

[제3공정 : 최적배양 및 발효공정]

30 g/L fructo-oligosaccharide, 40 g/L maltose, 10 g/L 대두박, 10 g/L malt extract, 5 g/L yeast extract, 5 g/L sodium acetic acid, 8 g/L disodium phosphate, 2 g/L ammonium citric acid, 1 g/L tween 80, 0.5 g/L MgSO₄·7H₂O, 1 g/L K₂HPO₄, 0.5 g/L MnSO₄·7H₂O을 포함하고 pH 6 조건의 배지에 Lactobacillus bulgaricus를 접종하여 37℃의 중온에서 30시간 동안 활성화시켰다.

그리고 제2 공정의 전처리가 완료된 더덕 100g 에 활성화된 Lactobacillus bulgaricus를 1 X 10⁶CFU/mL의 농도로 접종한 후 37℃의 혐기적 조건하에서 48시간 동안 발효시켰다.

[제4공정 : 숙성 공정]

숙성 공정은 발효 더덕의 발효를 마무리하는 공정으로 주발효가 끝난 발효 더덕을 20℃의 저온실에서 30일간 혐기적 상태로 저온숙성하는 단계이다.

[제5공정 : 추출 공정]

본 발명에서 항균활성을 검증하고자 하는 Lactobacillus bulgaricus로 발효된 더덕 100g을 잘게 분쇄하여 100℃의 증류수를 이용하여 수직환류냉각기가 부착된 추출 플라스크로 12시간씩 2회 반복하여 추출한 후 감압 여과 및 농축한 뒤 동결건조를 하여 분말상태로 사용하였다.

[제6공정 : 발효 분해 산물의 추출 수율 및 항균활성 평가]

위의 공정으로 얻은 발효 더덕 추출물의 항균 목적 활성을 평가하기 위해 추출 수율 및 항균활성을 평가하였다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. (아래 실시예에서는 배지의 조성 등을 제외하고는 전술한 제1공정 내지 제6공정의 방법들을 사용하였다.)

실시예 1. MRS 배지 성분 조성의 최적화

(1) 탄소원의 최적화 실험은 일반 MRS 배지 성분(Glucose 20 g/L, Peptone 10 g/L, Beef extract 10 g/L, MgSO₄·7H₂0 0.1 g/L, K₂HPO₄2 g/L, MnSO₄·7H₂0 0.05 g/L, Disodium phosphate 2 g/L, Yeast extract 5 g/L, Sodium acetic acid 5 g/L, Ammonium citric acid 2 g/L, Tween 80 1 g/L)에서 탄소원을 제거한 후 glucose, galactose, maltose, sucrose를 각각 20g/L로 첨가하여 48시간 동안 배양한 후 균체량을 측정하였고, 그 후 선택된 탄소원의 농도를 20, 40, 60 그리고 80 g/L로 조절한 후 같은 시간 동안 배양한 후 균체량을 측정하여 Lactobacillus bulgaricus에 적합한 탄소원을 결정하였다.

그리고 Lactobacillus 균의 영양 성분 역할을 하는 배지 조성 성분들의 변화를 통하여 균체량을 측정하였다. [균체량 측정 방법 - 균체를 칭량병에 취한 후 염화칼슘이나 실리카겔 등의 건조제가 들어 있는 데시케이터에 넣어 서서히 감압하면서 건조시킨 다음(대개 20시간 정도에 완전히 건조되지만 가끔 무게를 측정하여 거의 일정치가 나타날 때까지(항량) 건조를 계속한다), 건조균체의 무게를 측정하여 균량을 표시하였다.]

(2) 우선 탄소원 및 그 농도의 결정과 관련하여, 균체량을 측정한 결과 maltose를 탄소원으로 하였을 시 7.41 g/L로 가장 잘 성장함을 알 수 있었고, maltose의 양은 측정결과 40 g/L로 하였을 시 가장 많은 균체량을 보여 최적의 MRS 배지 조성 중 maltose는 40 g/L으로 결정하였다(Fig. 1 및 2).

(3) 최적 배양배지의 결정을 위해서 peptone 대신 대두박, beef extract 대신 malt extract를 첨가하여 그 효과를 측정하였다. 그 결과 대두박과 malt extract를 첨가한 배양 배지의 균체량이 기존의 MRS 배지의 성분인 peptone과 beef extract를 첨가하였을 때보다 약 1.8배 균체량이 증가한 것을 확인할 수 있었다(Fig. 3).

(4) 그 외 미량 첨가되는 성분들을 Fig. 4 및 5와 같이 농도별로 첨가하여 48시간 배양한 후 균체량을 측정하여 최적 배지 조성을 결정하였다.

그 결과 disodium phosphate의 최적 농도는 8 g/L 였으며, 미량 첨가되는 조성물로서 MgSO₄·7H₂0, K₂HPO_4,MnSO₄·7H₂0는 실험 결과 각각 0.5 g/L, 1.0 g/L, 0.5 g/L의 농도에서 최대 균체량을 나타내었다(Fig. 4 및 5).

실시예 2. 프락토올리고당(fructo-oligosaccharide)의 첨가량 결정

일반적인 MRS 배지(Glucose 20 g/L, Peptone 10 g/L, Beef extract 10 g/L, MgSO₄·7H₂0 0.1 g/L, K₂HPO₄2 g/L, MnSO₄·7H₂0 0.05 g/L, Disodium phosphate 2 g/L, Yeast extract 5 g/L, Sodium acetic acid 5 g/L, Ammonium citric acid 2 g/L, Tween 80 1 g/L)에 프락토올리고당(fructo-oligosaccharide)을 10, 30, 50 그리고 70 g/L의 농도로 함유된 배지에 Lactobacillus bulgaricus를 1 X 10⁶ CFU/㎖의 농도로 접종한 후 37℃에서 48시간 동안 배양하면서 일정 시간 간격으로 샘플링을 하여 균의 성장 상태를 조사하였다.

그 결과 50 및 70 g/L 농도의 프락토올리고당을 첨가하였을 경우 처음 16시간 배양할 시까지는 Lactobacillus bulgaricus의 생육도가 일반 MRS 배지나 다른 농도의 경우보다 크게 증가하나 시간이 지남에 따라 그 생육도가 크게 감소하는 것으로 나타나 본 발명의 발효에 적합하지 않은 것으로 나타났다.

그리고 나머지 10 및 30 g/L의 농도로 프락토올리고당을 첨가하였을 경우 일반 MRS 배지에 비하여 Lactobacillus bulgaricus의 생육도가 증가하였고, 10 g/L 보다 30 g/L 농도의 프락토올리고당을 첨가하였을 때 가장 좋은 생육도를 나타내었다(Fig. 6).

위의 다양한 배지 조성의 최적화 결과와 프락토올리고당의 농도를 종합하여 산출한 최적의 MRS 배지 조성 결과는 30 g/L fructo-oligosaccharide, 40 g/L maltose, 10 g/L 대두박, 10 g/L malt extract, 5 g/L yeast extract, 5 g/L sodium acetic acid, 8 g/L disodium phosphate, 2 g/L ammonium citric acid, 1 g/L tween 80, 0.5 g/L MgSO₄·7H₂O, 1 g/L K₂HPO₄, 0.5 g/L MnSO₄·7H₂O 이다.

실시예 3. 최적 pH 조건의 결정

상기의 최적 MRS 배지 조성 및 프락토올리고당 첨가량을 적용한 배지의 최적 pH 결정을 위하여 pH 4, 5, 6 및 7의 조건하에서 Lactobacillus bulgaricus의 생육도를 측정하였다. pH는, pH 4~7로 조정한 0.1 M phosphate buffer를 사용하여 조절하였다. 그 결과 pH 6의 조건에서 Lactobacillus bulgaricus가 가장 생육도가 높았다(Fig. 7).

이상의 실시예를 통해 더덕 발효에 맞추어 최적화된 배지 조성과 pH를 일반 MRS 배지와 비교하면 정리한 것을 표 1에 나타내었다.

실시예 4. 최적화된 배지 및 프락토올리고당 첨가에 따른 균체성장 측정

Lactobacillus bulgaricus의 생육을 평가하기 위해 균체농도 및 생균수를 측정하였다.

균체농도는 주기적으로 각 배양액을 5ml씩 취하여 3,000 X g에서 15분 동안 원심분리를 시행한 다음 침전된 세포를 희석하여 Spectrophotometer를 이용하여 600nm에서 O.D 0.8 이하가 되도록 희석하여 측정한 후 건조 균체량(dry cell weight, DCW)과 O.D값 사이의 관계식을 이용하여 얻은 건조 균체 중량으로 환산하여 구하였다.

생균수 측정은 표준방법(standard plate count method)을 사용하였으며, MRS(Lactobacilli MRS, DifcoTM, Detroit, MI, USA) agar plate에 도말하여 37℃에서 48시간 이상 배양한 후에 나타난 colony 수를 계수하여 CFU/㎖로 표시하였다.

위 그래프는 기존 배지와 최적 배지에서의 균체 농도 및 생균수를 측정한 것인데, 그래프에서 볼 수 있듯이 최적 MRS배지가 균체 농도 및 생균수가 기존 MRS배지에 비해 많아진 것을 확인할 수 있다. 이로써 최적 MRS배지를 통하여 Lactobacillus bulgaricus 의 생육이 증가하는 것을 확인할 수 있다.

실시예 5. 다양한 식중독균에 대한 항균활성 측정

본 발명을 통해 얻어진 발효더덕의 기능성을 확인하기 위해 실시예를 통해 얻어진 발효더덕을 이용해 항균활성 실험을 하였다.

먼저, 분말상태로 만든 추출물을 무균의 증류수에 용해하고 0.2 μm의 필터를 사용하여 필터링을 한다. 소독된 추출물을 10-500mg/mL의 농도범위로 trypticase soy broth배지에 녹여 96 well plate에 배양한다. 항균활성 측정을 위해 사용된 식중독균인 Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Shigella boydii, Salmonella typhimurium의 초기 균수를 1.70 X 10⁵ CFU/mL로 하여 각 well에 37℃에서 20시간 동안 배양한다.

그 후 각 실의 항균활성 측정을 위하여 각 시료의 MIC(minimum inhibitory concentration)를 측정하여 항균활성을 측정하였는데, MIC는 각 식중독균이 99% 까지 성장이 억제되는 데 필요한 최소한의 농도를 나타낸다.

각 식중독균에 대한 최적화된 배양배지에서 발효한 발효 더덕 추출물의 항균활성 측정 결과 기존 MRS 배지 추출물의 활성 결과보다 높은 것을 알 수 있다(표 1).

실시예 6. Challenge test

상기의 실시예 5처럼 최적배지를 이용한 발효물은 강력한 항균력을 가지므로 방부의 목적으로도 사용이 가능하다. 따라서 기존 배지의 발효물과 최적 배지 발효물의 방부력(challenge test)을 확인하였다.

방부제의 유효성 측정에 사용되는 방법 중 미국화장품 협회의 방법, 즉 CTFA법(The cosmetics, Toiletry, and Fragrance Association)을 기준으로 테스트하였다. CTFA법은 100g의 용기에 발효물 50g을 넣고 10⁶~10⁷ CFU/mL의 균을 접종하여 7일 이내에 처음 접종 균수의 99.9%가 사멸되면 방부제로서의 유효성을 입증하는 방법이다. 본 발명에서는 5 X 10⁶ CFU/mL의 균을 발효물에 접종시켜 35℃, 100 rpm으로 조정된 shaking incubator에 두고 0, 3, 12 시간과 1~7일까지 샘플을 취하여 고체배지에서 균일하게 도말한 후 colony 수를 측정하였다.

Fig. 9의 challenge test는 상기의 MIC 항균활성 실험에서 최적 배지 추출에 대해 사멸정도가 가장 좋았던 Staphylococcus aureus 균을 접종하여 나타낸 그래프이다. 본 실험에서 positive control은 paraben이라는 화학방부제를 사용하였다.

그래프에서 볼 수 있듯이 positive control의 경우 약 접종 6일 이후에 접종된 균수가 99.9% 이상 감소되어 CTFA법을 기준한 방부력테스트(즉 7일 이내 접종균수의 99.9%가 사멸) 기준에 적합하였고, 최적 MRS 배지 배양물의 경우 약 접종 5일째 방부력테스트 기준을 통과한 것으로 나타났다. 그 반면에 기존 MRS 배지 배양물은 CTFA기준을 통과하지 못한 것으로 나타났다. 이상의 결과로 최적 MRS 배지 배양물은 Shigella boydii 균을 접종한 경우 CTFA법의 기준에 만족하는 방부력이 있는 것으로 나타났다.

Claims

pH는 6이고 fructo-oligosaccharide를 25~35 g/L 포함하는 것을 특징으로 하는,
더덕 발효를 위한 Lactobacillus bulgaricus의 최적 배양 배지.
25~35 g/L fructo-oligosaccharide, 35~45 g/L maltose, 8~12 g/L 대두박, 8~12 g/L malt extract, 4~6 g/L yeast extract, 4~6 g/L sodium acetic acid, 7~9 g/L disodium phosphate, 1~3 g/L ammonium citric acid, 1 g/L tween 80, 0.5 g/L MgSO₄·7H₂O, 1 g/L K₂HPO₄, 0.5 g/L MnSO₄·7H₂O을 포함하는 것을 특징으로 하는,
더덕 발효를 위한 Lactobacillus bulgaricus의 최적 배양 배지.
제2항에 있어서,
배양 배지의 pH는 6인 것을 특징으로 하는,
더덕 발효를 위한 Lactobacillus bulgaricus의 최적 배양 배지.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 배양 배지를 이용하여 활성화한 Lactobacillus bulgaricus를 더덕에 접종하고 발효시켜서 얻어지는 것을 특징으로 하는,
더덕의 발효물.
(1) 더덕을 수세하고 건조시키는 단계;
(2) 더덕을 분쇄한 후, 효과적인 미생물의 증식 및 발효를 위해 100~150℃의 온도에서 5~25분간 증숙, 멸균하는 단계;
(3) pH는 6이고, 25~35 g/L fructo-oligosaccharide, 35~45 g/L maltose, 8~12 g/L 대두박, 8~12 g/L malt extract, 4~6 g/L yeast extract, 4~6 g/L sodium acetic acid, 7~9 g/L disodium phosphate, 1~3 g/L ammonium citric acid, 1 g/L tween 80, 0.5 g/L MgSO₄·7H₂O, 1 g/L K₂HPO₄, 0.5 g/L MnSO₄·7H₂O을 포함하는 배양 배지에 Lactobacillus bulgaricus를 접종하여 균을 활성화시키는 단계; 및
(4) 상기 단계 (2)까지 완료된 더덕에, 단계 (3)을 통해 활성화된 Lactobacillus bulgaricus를 접종하여 혐기적 조건하에서 더덕을 발효시키는 단계;로 이루어지는 것을 특징으로 하는,
더덕의 발효 방법.
제5항의 발효 방법에 의해 얻어지는 것을 특징으로 하는,
더덕의 발효물.