CN101985644B - 一种苦瓜多肽及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种苦瓜多肽及其制备方法与应用。该苦瓜多肽是按照包括下述步骤的方法制备得到的:采用木瓜蛋白酶对苦瓜粉进行酶解反应,得到所述苦瓜多肽。其相对分子质量主要在130~1000Da之间,均由2~9个氨基酸组成,人体极易吸收,可快速被组织利用、迅速平衡血糖,且可长期服用。本发明所提供的苦瓜多肽可作为医药原料以及食品添加剂用于制备预防和/或治疗糖尿病产品,如药品、保健品、食品等。本发明制备苦瓜多肽的方法工艺简单、投资少、见效快、附加值高,是适宜于工业化生产的方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种苦瓜多肽及其制备方法与应用。
背景技术
苦瓜(Momordica charantia L.)为葫芦科植物,整株植物包括果实均有苦味,叶边缘齿状,果实长方形,嫩果翡翠绿色,成熟后为橘黄色;生长在亚热带地区,因其既可入药,又可用作蔬菜,在世界范围内广泛种植。果实性苦,味寒,有清暑涤热、明目解毒等功效,局部外敷治疗外伤,内服用于驱虫、调经、抗病毒、治疗麻疹及肝炎。药理实验证实其具有治疗糖尿病、抗病毒、抗癌、抗菌及杀虫等作用。
目前,国内外热衷于用苦瓜治疗糖尿病,相继研究开发出许多类似“苦瓜素”、“苦瓜总皂苷”、“苦瓜茶”、“苦瓜粉”等产品,但这些产品中有效物质相对分子质量较大,人体不易吸收和利用。像“苦瓜粉”、“苦瓜茶”、“苦瓜素”类产品,从中医理论上讲,体质寒的人不宜吃或不宜多吃、常吃。
发明内容
本发明的目的是提供一种苦瓜多肽及其制备方法。
本发明所提供的苦瓜多肽是按照包括下述步骤的方法制备得到的:采用木瓜蛋白酶对苦瓜粉进行酶解反应,得到所述苦瓜多肽。
本发明中所述苦瓜粉是将新鲜苦瓜冷冻干燥后,粉碎得到的。
所述冷冻干燥可按照常规方法进行,如在冷冻干燥机干燥12h(预冻阶段:先将冷冻干燥箱内温度降至-30℃至-40℃,维持2~3小时;升华阶段:当冷凝器的温度达到-30℃以下时,对整个系统抽真空,压强设置在15~20帕之间,温度升至30~35℃,维持10~15小时;二次升华阶段:将温度升至45~50℃,维持3~5小时,制成冻干苦瓜。
本发明中,所述酶解反应的反应温度为38-42℃,时间为7-8小时。
所述酶解反应的反应体系中,苦瓜粉与水的质量份数比为1∶8-10;酶解每克苦瓜粉所需木瓜蛋白酶为150000-180000U。酶活力单位U是指在特定条件下(25℃,pH7.0),每1分钟转化1微摩尔的底物所需的酶量或转化1微摩尔的有关基团所需的酶量。
在酶解反应结束后,还需对酶解液进行酶灭活处理,所述酶灭活的条件为温度100℃,时间为30分钟。之后进行冷藏沉降处理,得到纯化的苦瓜多肽浓缩液;所述冷藏沉降的温度为2-4℃,时间为48-72小时。
为了储运方便及适用于更多剂型,还可进一步将上述苦瓜多肽浓缩液进行冷冻干燥或喷雾干燥处理制成苦瓜多肽粉末。
按照上述方法制备得到的苦瓜多肽,其相对分子质量主要在130-1000Da之间,由2-9个氨基酸组成,其营养性及降糖生理活性优良。该苦瓜多肽可以浓缩液、冷冻干燥干粉或喷雾干燥干粉的形式存在。
本发明的另一个目的是提供所述苦瓜多肽的应用。
本发明所提供的苦瓜多肽的应用是其在制备预防和/或治疗糖尿病产品中的应用。
本发明的再一个目的是提供一种预防和/或治疗糖尿病的产品。
本发明所提供的预防和/或治疗糖尿病的产品,其活性成分为本发明所提供的苦瓜多肽。所述产品可以包括药品、保健品或食品等。
以苦瓜多肽为活性成分制备的预防和/或治疗糖尿病的药物或保健品,需要的时候,在上述药物或保健品中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。
所述预防和/或治疗糖尿病的药物可以制成口服液、片剂、冲剂、胶囊(包括软、硬胶囊)、喷剂以及包衣丸剂等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。
附图说明
图1为本发明制备苦瓜多肽的工艺流程图。
图2为实施例4中苦瓜多肽的凝胶色谱图。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明的方法进行说明,但本发明并不局限于此。
下述实施例中所述实验方法,如无特殊说明,均为常规方法;所述试剂和生物材料,如无特殊说明,均可从商业途径获得。
下述实施例中对鲜苦瓜进行冷冻干燥的工艺如下:在冷冻干燥机干燥12h(预冻阶段:先将冷冻干燥箱内温度降至-30℃至-40℃,维持2~3小时;升华阶段:当冷凝器的温度达到-30℃以下时,对整个系统抽真空,压强设置在15~20帕之间,温度升至30~35℃,维持10~15小时;二次升华阶段:将温度升至45~50℃,维持3~5小时,制成冻干苦瓜。
实施例1、制备苦瓜多肽
将鲜苦瓜(人工种植或野生多籽苦瓜)放进冷冻干燥设备里进行冷冻干燥,之后粉碎成粉末,即成冷冻干燥苦瓜粉。然后将苦瓜粉放进酶解罐内,向酶解罐内加入苦瓜粉质量9倍的水,按酶解每克苦瓜粉需要木瓜蛋白酶165000U的量加入木瓜蛋白酶,在温度40℃条件下对苦瓜粉酶解8小时。酶解结束后,对酶解液进行酶灭活处理,酶灭活的条件为温度100℃,时间为30分钟。之后在2-4℃条件下冷藏沉降处理60小时,待其杂质基本沉淀,再用过滤设备过滤三遍,即得苦瓜多肽浓缩液。将该苦瓜多肽浓缩液进行冷冻干燥或喷雾干燥处理,即得到苦瓜多肽粉末。
实施例2、制备苦瓜多肽
将鲜苦瓜(人工种植或野生多籽苦瓜)放进冷冻干燥设备里进行冷冻干燥,之后粉碎成粉末,即成冷冻干燥苦瓜粉。然后将苦瓜粉放进酶解罐内,向酶解罐内加入所述苦瓜粉质量8倍的水,按酶解每克苦瓜粉需要木瓜蛋白酶150000U的量加入木瓜蛋白酶,在温度38℃条件下对苦瓜粉酶解7小时。酶解结束后,还需对酶解液进行酶灭活处理,所述酶灭活的条件为温度100℃,时间为30分钟,之后在2-4℃条件下冷藏沉降处理48小时,待其杂质基本沉淀,再用过滤设备过滤三遍,即得苦瓜多肽浓缩液。将该苦瓜多肽浓缩液进行冷冻干燥或喷雾干燥处理,即得到苦瓜多肽粉末。
实施例3、制备苦瓜多肽
将鲜苦瓜(人工种植或野生多籽苦瓜)放进冷冻干燥设备里进行冷冻干燥,之后粉碎成粉末,即成冷冻干燥苦瓜粉。然后将苦瓜粉放进酶解罐内,向酶解罐内加入所述苦瓜粉质量10倍的水,按酶解每克苦瓜粉需要木瓜蛋白酶180000U的量加入木瓜蛋白酶,在温度42℃条件下对苦瓜粉酶解8小时。酶解结束后,还需对酶解液进行酶灭活处理,所述酶灭活的条件为温度100℃,时间为30分钟。之后在2-4℃条件下冷藏沉降处理72小时,待其杂质基本沉淀,再用过滤设备过滤三遍,即得苦瓜多肽浓缩液。将该苦瓜多肽浓缩液进行冷冻干燥或喷雾干燥处理,即得到苦瓜多肽粉末。
实施例4、苦瓜多肽的分子量分布检测
苦瓜多肽的分子量分布的测定方法采用高效凝胶过滤色谱法,由江南大学分析测试中心进行检测。
具体方法如下:
1、方法提要
采用高效凝胶过滤色谱法测定。即以多孔性填料为固定相,依据样品组分分子体积大小的差别进行分离,在肽键的紫外吸收波长220纳米条件下检测,使用凝胶色谱测定分子量分布的专用数据处理软件(即GPC软件),对色谱图及其数据进行处理,计算得到苦瓜多肽的相对分子质量大小及分布范围。
2、仪器
a)高效液相色谱仪,配有紫外检测器和含有GPC数据处理软件的色谱工作站或积分仪;
b)流动相真空抽滤脱气装置;
c)超声波震荡器;
d)分析天平,感量0.0001克。
3、试剂
a)乙腈,色谱纯;b)三氟醋酸,分析纯;c)水,超纯级或二次蒸馏水。
d)分子量校正曲线所用标准品:
1)细胞色素C(cyyochrome,MW12500);2)抑肽酶(aprotinin,MW6500)
3)杆菌酶(bacit racin,MW1450);4)乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸(NW451)
5)乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸(MW189)
4、色谱条件与系统适应性实验
色谱柱:TSKge1G2000SWXL 300毫米×7.8毫米或性能与此相近的同类型其他适用于测定蛋白质和肽的凝胶柱。
流动相∶乙腈∶水∶三氟乙酸,10∶90∶0.1(体积比)
检测波长:UV220纳米
流速:0.5毫升/分钟
柱温:30℃
进样体积:10微升
为使色谱系统符合检测要求,规定在上述色谱条件下,凝胶色谱柱效即理论塔板数(N)按三肽标准品(乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸)峰计算不低于10000,苦瓜多肽的分配系数(Kd)应在0-1之间。
5、分子量校正曲线制作
分别用流动相配制成质量分数为0.1%的上述不同分子量肽标准品溶液,用孔径0.2微米~0.5微米聚四氟乙烯或尼龙过滤膜后分别进样,得到系列标准品的色谱图。
以分子量的对数(1gMV)对保留时间作图或作线性回归得到分子校正曲线及其方程。
6、样品制备
称取样品约20.0毫克于10毫升容量瓶中,用流动相定宽至刻度,超声振荡10分钟,使样品充分溶解混匀,用孔径为0.2微米-0.5微米聚四氯乙烯或尼龙过滤膜过滤后,上机进样。
7、分子量分布的计算
将6制备的样品溶液在上述色谱条件下分析,色谱图见图2。然后用GPC数据处理软件,将样品的色谱数据代入校正曲线中进行计算,即可得到样品的分于量及其分布范围。用峰面积归一法可计得不同分子量范围肽的相对百分比。
表1 苦瓜多肽分子量分布测定结果
实施例1~3制备的苦瓜多肽经江南大学分析测试中心检测,相对分子质量>1000Da的占23.91%;130-1000Da的占66.44%,详细结果见表1。说明本发明提供的苦瓜多肽的相对分子质量主要集中在130-1000Da。
实施例5、苦瓜多肽的药效学试验
采用实施例1制备的苦瓜多肽对II型糖尿病模型大鼠进行动物试验,通过对照试验,考察本发明的苦瓜多肽对试验大鼠的治疗作用。
具体试验过程如下:
将大鼠用基础饲料喂养1周后,随机分为普通饲料组(正常对照组,10只)和高脂饲料组(60只),持续喂养8周后,高脂饲料组大鼠尾静脉一次性注射STZ(链脲佐菌素)25mg/kg,正常对照组大鼠注射等量的枸橼酸钠-枸橼酸缓冲液。2d后以12mmol/L≤血糖<30mmol/L者视为II型糖尿病模型大鼠造模成功。将造模成功的40只2-DM大鼠随机分成四组:模型对照组(水灌胃)、实施例1高、中、低剂量组(高剂量组给药剂量为100mg/kg,中剂量为50mg/kg,低剂量为25mg/kg,灌胃)。连续灌胃8天,观察动物的症状及检测各项指标,试验结束后测定大鼠的空腹血糖及其他指标。
采用SPSS 16.0统计软件进行数据处理,实验数据以均数±标准差(±s)表示,采用t检验,检验水准α=0.05。
表2、苦瓜多肽对II型糖尿病大鼠血糖的影响(χ±SD)
与模型对照组相比,*P<0.05,差异有显著性。
表3、苦瓜多肽对II型糖尿病大鼠胰岛素及肝糖原的影响
与模型对照组相比,*P<0.05,差异有显著性。
表4、苦瓜多肽对II型糖尿病大鼠血SOD及MDA的影响
与模型对照组相比,*P<0.05,差异有显著性。
综上,本试验结果表明:苦瓜多肽有明显的降糖作用,可改善糖尿病机体的胰岛素敏感性,增加肝脏对葡萄糖的利用,改善机体糖代谢;可显著减少血清MDA的含量,使SOD活性显著升高,具有一定的医用、药用价值。
Claims (9)
1.一种制备苦瓜多肽的方法,包括下述步骤:采用木瓜蛋白酶对苦瓜粉进行酶解反应,得到所述苦瓜多肽;
所述酶解反应的反应时间为7-8小时;
酶解每克苦瓜粉所需木瓜蛋白酶150000-180000U;
所述酶解反应的反应温度为38-42℃。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述苦瓜粉是将新鲜苦瓜冷冻干燥后粉碎得到的。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于:所述酶解反应的反应体系中,苦瓜粉与水的质量份数比为1∶8-10。
4.根据权利要求1或2所述的方法,其特征在于:所述方法还包括下述步骤:在酶解反应结束后,对酶解液进行冷藏沉降处理,过滤,收集滤液;所述冷藏沉降的温度为2-4℃,时间为48-72小时。
5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于:所述方法还包括将所述滤液进行酶灭活处理的步骤;所述酶灭活的条件为:温度100℃,时间30分钟。
6.权利要求1-5中任意一项所述方法制备得到的苦瓜多肽。
7.权利要求6所述的苦瓜多肽在制备预防和/或治疗糖尿病产品中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用,其特征在于:所述产品可为药品、保健品或食品。
9.一种预防和/或治疗糖尿病产品,其活性成分为权利要求6所述的苦瓜多肽。
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