CN112881565A - 三苯双脒有关物质的hplc检测方法 - Google Patents

三苯双脒有关物质的hplc检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了三苯双脒有关物质的HPLC检测方法，公开了一种同时检测三苯双脒有关物质氨脒、对苯二甲醛、单脒的高效液相方法，使主峰与相邻杂质峰峰及各杂质峰间均能达到基线分离，并提供了完整验证方案，操作简单，精密度高，稳定性好，重现性好。

Description

三苯双脒有关物质的HPLC检测方法
技术领域
本发明属于药物分析技术领域，具体而言，涉及三苯双脒有关物质的HPLC检测方法。
背景技术
三苯双脒肠溶片是一种广谱新型抗寄生虫药物，为国际原创新药，属于国家一类新药，拥有自主知识产权，具有不良反应少、高效、低毒、剂量小，疗程短，虫迅速等优点，具有很好的抗蛔虫、十二指肠钩虫和美洲钩虫的效果，对蛲虫亦有较好的疗效，特别是对顽固的美洲钩虫感染，三苯双脒效果显著，优势更为明显。
三苯双脒肠溶片“力卓”获得一类新药证书，意味着该药品属于国际原创，是我国自主研究开发的创新药物，拥有化学结构、合成工艺及制剂处方等发明专利。随着新华制药的国际化步伐，三苯双脒肠溶片作为贡献于人类健康，致力于提高世界范围内健康水平的良药而登上国际化舞台。
三苯双脒肠溶片其有效成分三苯双脒原料药经历了由工艺开发到生产实践再到具备CGMP资格的批量生产。其工艺国际化接轨的同时，分析方法也面临新的挑战，开发新方法、利用新技术迫在眉睫。
对于全新的化学结构，基础研究始于30多年前，时间跨度大，加之分析技术、仪器日新月异，有必要对其进行新的分析方法研究。
目前三苯双脒已公开的有关物质测定方法为HPLC法(见国家药品标准WS1-(X-005)-2010Z)，具体如下：
供试液制备：精密称取含量测定项下的细粉适量(约相当于三苯双脒10mg)，于100ml量瓶中，加乙腈－三乙胺(100：0.35)溶液溶解并稀释至刻度，制成每1ml中含三苯双脒0.1mg的溶液，经0.45um有机系滤膜过滤，取续滤液作为供试液。每批供试品制备1份。
对照液制备：精密吸取供试品溶液3ml，于200ml量瓶中，用乙腈－三乙胺(100：0.35)溶液稀释至刻度，摇匀；制成每1ml中约含三苯双脒1.5ug的溶液，作为对照液。
色谱条件：流动相：(1)配比：乙腈－水－三乙胺(75：25：0.35)
(2)配制方法：取水250ml，加三乙胺3.5ml，经0.45um水系滤膜过滤，加经0.45um有机系滤膜过滤的乙腈750ml，混匀，超声脱气10分钟备用。
(3)必要时可适当调节流动相比例，以满足分离需要。根据供试品量的多少，必要时可按照流动相配比，同比例扩大或缩小，配制不同体积的流动相。
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶柱。Φ150mm×4.6mm
检测波长：380nm；
流速：1.0ml/min；
进样操作：按照高效液相色谱仪操作规程打开仪器，装上色谱柱，冲流动相约30分钟，检查柱压以及基线，看是否稳定。待各项指标都稳定后，取对照液10ul，注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为满量程的20％，连续进样测定5次，计算三苯双脒峰面积的相对标准偏差应不大于5％；理论板数以第一次的三苯双脒峰计应不低于1500。如系统适用性试验不合格，则应调查原因，并排除原因，重新进行系统适用性试验，合格后才能进行以下分析。
测定：取乙腈－三乙胺(100：0.35)溶液10ul注入液相色谱仪，作为空白对照。精密量取供试品溶液10ul，注入液相色谱仪，供试液每份进样1次，记录色谱图至主成分峰保留时间的4倍，供试液的色谱图中如有杂质峰，按自身对照法以峰面积计算，杂质总量应符合规定。
经研究发现，在实际操作过程中，上述方法存在以下不足：
(1)通过对三苯双脒杂质谱全面分析，采用国家药品标准WS1-(X-005)-2010Z色谱条件进行有关物质分析，三苯双脒峰与杂质峰、杂质峰与杂质峰之间分离效果较差，所有色谱峰基本重叠在一起；
(2)部分已知存在的杂质在该波长下没有吸收，导致杂质漏检。
(3)方法中的色谱系统与色谱柱兼容性差，色谱柱失效严重，耐受性差。
发明内容
本发明提供了三苯双脒有关物质的HPLC检测方法，包括如下操作步骤：
(1)溶液配制：
精密称取20mg对苯二甲醛、20mg单脒、20mg氨脒于同一250mL容量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，作为贮备液；移取1mL该溶液至100mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度作为对照液1；
精密称取20mg三苯双脒标准品于250mL容量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度；移取1ml该溶液至100mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度作为对照液2；
精密称取20mg三苯双脒样品粉末于250mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容到刻度作为样品溶液；
(2)将对照液1、对照液2和样品溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，色谱条件如下：
色谱柱：氰基为填充剂；
检测波长：270nm
流动相：体积百分比为0.5％的三乙胺：乙腈＝50:50,混匀后静置，加入15-25体积的乙腈，进行等度洗脱，以满足系统适用性结果；
(3)测定法：样品溶液色谱图中如有与对照溶液1色谱图中保留时间一致的杂质峰，按外标法以峰面积计算：
所述的步骤(2)中的色谱柱尺寸为5um CN 4.6*250mm；
所述的步骤(2)中流动相的流速为1.0mL/min；
所述的步骤(2)中柱温：30℃；
所述的步骤(2)中的流动相：体积百分比为0.5％的三乙胺：乙腈＝50:50,混匀后静置，加入15-25体积的乙腈。
本发明的目的在于提供一种检测方法，以克服现有技术存在的不足，本发明公开了一种同时检测三苯双脒有关物质氨脒、对苯二甲醛、单脒的高效液相方法，使主峰与相邻杂质峰峰及各杂质峰间均能达到基线分离，并提供了完整验证方案，操作简单，精密度高，稳定性好，重现性好。
三苯双脒有关物质方法开发过程中有几个难点，
1.被测物质极性相似，导致大正相、大反相分离效果不尽人意。
2.普通C18柱子的载体硅胶能催化副反应，导致降解。
3.普遍意义上的反相系统中水、甲醇、乙醇等质子型溶剂会引起三苯双脒的降解。在最终成品的放行中，0.05％的单杂限度使得普通的反相系统难于符合要求。
4.大正相分离机制由于几个物质的极性相似，也没有达到理想的结果。
5.基于这几个难点，我们进行的新方法的开发。
6.首先，波长的确定，在开发阶段选取了几种物质吸收较为相近的点(270nm)为检测波长。
由于三苯双脒的特性，整个分析过程、溶解过程中，只要有质子存在就会降解。所以选取了纯的乙腈作为溶剂，在方法优化过程中考虑过在乙腈中加入三乙胺作为溶剂，此时对CN柱的挑战会更高，报废时间更短。而且加入三乙胺的溶剂在过色谱柱时产生溶剂效应，在LOD/LOQ testing时会影响基线。我们放弃了三乙胺-乙腈作为溶剂，而改用减小样品浓度，增加进样量的方式来提高准确度。样品溶液制备过程中严格烘干容器(去除水、甲醇、乙醇等质子型溶剂)。
特别地，此检测方法的流动相体系为在本发明时间、地点、环境及操作者限制下最优，而不限于此流动相体系及洗脱比例，对此流动相体系的比例、浓度及梯度洗脱程序做适当修改、调整与等同替换，并不脱离本发明的技术思想和保护范围。
附图说明
图1三苯双脒有关物质检测方法典型对照溶液1图谱(其中，RT对苯二甲醛3.549min；RT单脒4.766min；RT氨脒15.494min)
图2三苯双脒有关物质检测方法典型对照溶液2图谱(其中，RT三苯双脒7.641min)
图3三苯双脒有关物质检测方法典型空白溶液图谱
图4典型样品溶液图谱(其中，RT三苯双脒7.480min)
图5典型回填杂质样品溶液图谱(其中，RT对苯二甲醛3.547min；RT单脒4.743min；RT三苯双脒＝7.473；RT氨脒15.417min)
具体实施方式
以下通过实验说明本发明的有益效果。
实施步骤：
1.专属性
溶液配制：精密称取21.20mg对苯二甲醛、20.85mg单脒、20.53mg氨脒于同一100ml容量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，作为贮备液A；移取1ml该溶液至250ml容量瓶中，用乙腈定容至刻度作为对照液1；精密称取20.73mg三苯双脒标准品于250ml容量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度；移取1ml该溶液至100ml容量瓶中，用乙腈定容至刻度，作为对照液2。精密称取对苯二甲醛、单脒和氨脒标准品各约20mg，分别置250ml容量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，作为各杂质贮备液；分别精密量取各杂质贮备液1ml至100ml容量瓶中，用乙腈定容至刻度，作为杂质贮备液；精密称取硝脒标准品20.60mg于100ml容量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度；移取1ml该溶液至250ml容量瓶中，用乙腈定容至刻度，作为杂质贮备液B。精密称取三苯双脒20.10mg于250ml容量瓶中，加乙腈超声溶解并稀释至刻度，作为样品溶液。精密称取三苯双脒20.18mg于250ml容量瓶中，加乙腈超声溶解，加入1ml贮备液A、1ml贮备液B，用乙腈稀释至刻度，作为样品回添杂质溶液。
分别精密量取各溶液40μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果见表1所示，对照液1中色谱峰之间的分离度>1.5，三苯双脒峰面积的RSD小于2.0％，空白中三苯双脒、对苯二甲醛、氨脒、单脒处无干扰，三苯双脒峰纯度达到要求，即没有不纯物检出，峰纯度相似度>0.99，纯度阈值>0.9，表明本方法专属性良好。
表1三苯双脒有关物质专属性结果
Figure BDA0002963374670000051
2.检测限及定量限
精密称取对苯二甲醛、单脒、氨脒各20mg于同一250ml容量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度；移取1ml该溶液至100ml容量瓶中，用乙腈定容至刻度，作为对照液1；精密称取20mg三苯双脒标准品于250ml容量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度；移取1ml该溶液至100ml容量瓶中，用乙腈定容至刻度，作为对照液2。精密称取20mg对苯二甲醛、20mg单脒、20mg氨脒于同一250ml容量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度；移取1ml该溶液至100ml容量瓶中，用乙腈定容至刻度，作为LOD/LOQ杂质贮备液。精密称取20mg三苯双脒标准品于250ml容量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度；移取1ml该溶液至100ml容量瓶中，用乙腈定容至刻度，作为LOD/LOQ三苯双脒贮备液。移取合适体积的LOD/LOQ杂质贮备液于100ml容量瓶中，同法制备6份。移取合适体积的LOD/LOQ三苯双脒贮备液于100ml容量瓶中，同法制备6份。分别精密量取各贮备液40μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果见表2。
表2三苯双脒有关物质检测限、定量限结果表
Figure BDA0002963374670000052
3.线性范围
精密称取20mg对苯二甲醛、20mg单脒、20mg氨脒于同一250ml容量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀；精密称取20mg三苯双脒标准品于250ml容量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀；各移取1ml上述溶液至100ml容量瓶中，用乙腈定容至刻度，分别作为杂质对照品、三苯双脒对照品贮备液。分别精密量取杂质对照品及三苯双脒对照品贮备液适量，配制成50％、80％、100％、120％四个浓度的溶液，每个浓度平行三份，再分别精密量取40μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，以峰面积对浓度作曲线，用最小二乘法计算回归方程及相关系数。结果如表3所示，三苯双脒在浓度为0.00617～0.0413μg/ml的范围内线性良好，对苯二甲醛在浓度为0.0167～0.0927μg/ml的范围内线性良好，单脒在浓度为0.0157～0.0953μg/ml的范围内线性良好，氨脒在浓度为0.0327～0.093μg/ml的范围内线性良好。
表3三苯双脒有关物质线性试验结果
样品名称 浓度范围(μg/ml) 线性方程 相关系数
三苯双脒 0.00617～0.0413 y＝-422.65348+347085.5709 r＝0.9993
对苯二甲醛 0.0167～0.0927 y＝-480.44989+197368.0159 r＝0.9996
单脒 0.0157～0.0953 y＝-539.08557+118563.9073 r＝0.9975
氨脒 0.0327～0.093 y＝79.91312+102752.39529 r＝0.9991
4.准确度
溶液配制同线性范围项下，结果如表4所示，以理论浓度和实际浓度计，三苯双脒、对苯二甲醛、单脒、氨脒回收率均在90％～110％内。
表4三苯双脒有关物质线性试验结果
Figure BDA0002963374670000071
5.重复性
精密称取20.85mg对苯二甲醛、21.53mg单脒、20.51mg氨脒于同一100ml容量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度作为储备液A；移取1ml该溶液至250ml容量瓶中，用乙腈定容至刻度作为对照液1；精密称取21.53mg三苯双脒于250ml容量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度。移取1ml用乙腈稀释至100ml作为对照液2。精密称取三苯双脒20mg于250ml容量瓶中，加入1ml储备液A用乙腈溶解并稀释至刻度，同法制备6份，作为供试品溶液。分别精密量取上述对照溶液和供试品溶液各40μl注入液相色谱仪，记录色谱图。结果如表5，对苯二甲醛、单脒、氨脒的含量的RSD均不大于3％，有关物质检查重复性试验结果良好。
表5三苯双脒有关物质重复性试验结果
Figure BDA0002963374670000081
6.中间精密度
精密称取20.06mg对苯二甲醛、19.52mg单脒、20.05mg氨脒于同一100ml容量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度作为储备液A；移取1ml该溶液至250ml容量瓶中，用乙腈定容至刻度作为对照液1；精密称取20.80mg三苯双脒于250ml容量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度；移取1ml用乙腈稀释至100ml作为对照液2。精密称取三苯双脒20mg于250ml容量瓶中，加入1ml储备液A用乙腈溶解并稀释至刻度，同法制备6份，作为供试品溶液。精密量取上述对照溶液和供试品溶液各40μl注入液相色谱仪，记录色谱图；计算回收率，并计算6次测定结果的相对标准偏差。结果如表6所示，中间精密度RSD不大于3％，两名化验员精密度项下的综合RSD不大于5％。
表6三苯双脒有关物质中间精密度试验结果
Figure BDA0002963374670000082
7.耐用性
溶液配制：精密称取20mg对苯二甲醛、20mg单脒、20mg氨脒于同一100ml容量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度作为储备液A。移取1ml该溶液至250ml容量瓶中，用乙腈定容至刻度作为对照液1；精密称取20mg三苯双脒于250ml容量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度。移取1ml用乙腈稀释至100ml作为对照液2。精密称取三苯双脒20mg于250ml容量瓶中，加入1ml储备液A用乙腈溶解并稀释至刻度，同法制备6份，作为供试品溶液。
在既定色谱条件的基础上，改变流速、改变柱温、改变波长，精密量取上述对照品和供试品溶液各40μl注入液相色谱仪，记录色谱图。结果如表7、8所示，三苯双脒含量的RSD均小于2.0％，而且每项下的结果同重复性项下结果一起，所有结果的RSD均不大于5％，该分析方法的耐用性符合要求。
表7三苯双脒有关物质HPLC方法的耐用性
Figure BDA0002963374670000091
表8三苯双脒有关物质HPLC方法的耐用性试验结果
Figure BDA0002963374670000092
Figure BDA0002963374670000101
8.溶液稳定性
为考察溶液的稳定性，将对照品溶液1及样品回添杂质溶液，分别于0-24小时，每隔1小时，对照品溶液2及样品溶液，分别于0-24小时，每隔2小时注入液相色谱仪进样分析。
溶液配制：精密称取20mg对苯二甲醛，20mg单脒，20mg氨脒于100ml容量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度作为储备液A；移取1ml该溶液用乙腈稀释至250ml，作为对照液1；精密称取三苯双脒20mg于250ml容量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度；移取1ml该溶液于100ml容量瓶中用乙腈稀释至刻度，作为对照液2。精密称取20mg三苯双脒于250ml容量瓶中，用乙腈超声溶解并稀释至刻度，作为样品溶液。精密称取三苯双脒20mg于250ml容量瓶中，加入1ml储备液A用乙腈溶解并稀释至刻度，作为样品回添杂质溶液。
分别精密量取上述溶液各40μl，将对照品溶液1及样品回添杂质溶液分别于0-24小时，每隔1小时，对照品溶液2及样品溶液，分别于0-24小时，每隔2小时，注入液相色谱仪，记录色谱图。计算各溶液色谱图中各色谱峰峰面积的相对标准偏差，结果见表9-12，对照溶液1和样品溶液需要临用新制。稳定性项下对照溶液2从制备0小时到24小时，分别进样检测。检测结果表明，14h内每个时间点的变化均不超过初始含量的±2.0％，稳定性符合要求。当对苯二甲醛、氨脒、硝脒同时存在时，三苯双脒会有明显降解。
表9对照品溶液1稳定性考察结果
Figure BDA0002963374670000102
Figure BDA0002963374670000111
表10对照品溶液2稳定性考察结果
Figure BDA0002963374670000112
表11样品溶液稳定性考察结果
Figure BDA0002963374670000113
Figure BDA0002963374670000121
表12样品回添杂质溶液稳定性考察结果
Figure BDA0002963374670000122
Figure BDA0002963374670000131
9.降解试验和物料平衡
溶液配制：精密称取20mg对苯二甲醛、20mg单脒、20mg氨脒于同一250ml容量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度；移取1ml该溶液至100ml容量瓶中，用乙腈定容至刻度作为对照液1；精密称取20mg三苯双脒标准品于250ml容量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，移取1ml该溶液至100ml容量瓶中，用乙腈定容至刻度作为对照液2。精密称取三苯双脒粉末于250ml容量瓶中，用乙腈超声并溶解至刻度，作为样品溶液。
迫降条件见表13。准确称取一定量的三苯双脒平铺于称量瓶中，厚度小于3毫米，分别于热、湿、光条件下，每5天、10天、30天取样测试。各精密称取三份20mg三苯双脒，分别置于250ml容量瓶中，于化学条件下进行测试。精密量取上述溶液40μl注入液相色谱仪，记录色谱图。结果见表14，强酸强碱强氧化性物质对三苯双脒的纯度产生影响较大，并会产生降解杂质。将降解后样品同时测定其含量和有关物质，回收率在100±10％以内。
表13三苯双脒有关物质降解试验
Figure BDA0002963374670000132
表14三苯双脒有关物质降解试验结果
Figure BDA0002963374670000141

Claims (5)

1.三苯双脒有关物质的HPLC检测方法，其特征在于：包括如下操作步骤：
(1)溶液配制：
精密称取20mg对苯二甲醛、20mg单脒、20mg氨脒于同一250mL容量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，作为贮备液；移取1mL该溶液至100mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度作为对照液1；
精密称取20mg三苯双脒标准品于250mL容量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度；移取1ml该溶液至100mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度作为对照液2；
精密称取20mg三苯双脒样品粉末于250mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容到刻度作为样品溶液；
(2)将对照液1、对照液2和样品溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，色谱条件如下：
色谱柱：氰基为填充剂；
检测波长：270nm
流动相：体积百分比为0.5％的三乙胺：乙腈＝50:50,混匀后静置，加入15-25体积的乙腈，进行等度洗脱，以满足系统适用性结果；
(3)测定法：样品溶液色谱图中如有与对照溶液1色谱图中保留时间一致的杂质峰，按外标法以峰面积计算：
所述的三苯双脒的有关物质是对苯二甲醛、单脒、氨脒。
2.根据权利要求1所述的三苯双脒有关物质的HPLC检测方法，其特征在于：步骤(2)中所述的色谱柱尺寸为5um CN 4.6*250mm。
3.根据权利要求1所述的三苯双脒有关物质的HPLC检测方法，其特征在于：步骤(2)中流动相的流速为1.0mL/min。
4.根据权利要求1所述的三苯双脒有关物质的HPLC检测方法，其特征在于：步骤(2)中柱温：30℃。
5.根据权利要求1所述的三苯双脒有关物质的HPLC检测方法，其特征在于：步骤(2)中的流动相：体积百分比为0.5％的三乙胺：乙腈＝50:50,混匀后静置，加入15-25体积的乙腈。
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