CN108627598A - 一种测定德拉昔布含量的方法 - Google Patents

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郭强
武茂成
桑艳丽
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Abstract

本发明提供了一种测定德拉昔布含量的方法，首先提供德拉昔布药品溶液；然后将所述德拉昔布药品溶液进行高效液相色谱分析，根据德拉昔布含量的标准曲线与德拉昔布药品溶液的液相色谱图，得到德拉昔布药品中德拉昔布的含量。本发明通过高效液相色谱法对德拉昔布药品中德拉昔布的含量进行分析检测，该方法具有分析速度快、样品用量少、检测范围大、线性关系良好、精密度高以及准确度高的优点，为德拉昔布含量的测定提供了有效的检测手段。

Description

一种测定德拉昔布含量的方法
技术领域
本发明涉及分析检测技术领域，尤其涉及一种测定德拉昔布含量的方法。
背景技术
德拉昔布是一种非甾类抗炎药物的COX-2抑制剂，它是第一个用于动物的非甾类抗炎药物的COX-2抑制类药物。这种传统的具有选择性的非甾类抗炎药物广泛用于治疗猫和狗术后疼痛及消炎。其中，口服德拉昔布用药已经被授权用于狗术后的疼痛和骨关节炎症的治疗。与其他非甾类抗炎药物相比，德拉昔布具有独特性，其以几乎不可逆的方式抑制COX-2酶。随着人们对宠物有越来越多的需求，德拉昔布在兽医临床上具有较好的应用前景。
然而，现有技术并未有关于德拉昔布含量的检测方法的报道。因此，开发一种高效准确的德拉昔布含量的测定方法，对于药物的开发和临床使用具有空前的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种测定德拉昔布含量的方法，该方法高效、准确性高，为德拉昔布含量的测定提供了有效的检测手段。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种测定德拉昔布含量的方法，包括以下步骤：
提供德拉昔布药品溶液；
将所述德拉昔布药品溶液进行高效液相色谱分析，根据德拉昔布含量的标准曲线与德拉昔布药品溶液的液相色谱图，得到德拉昔布药品中德拉昔布的含量；
其中，所述高效液相色谱的色谱条件为：
流动相：流动相为甲醇、乙腈和磷酸二氢钾缓冲液的混合物，所述甲醇、乙腈和磷酸二氢钾缓冲液的体积比为25～35：10～15：45～65；
检测器：DAD检测器；
高效液相色谱仪：Thormo U3000。
优选的，所述流动相的体积流量为0.8～1.5mL/min。
优选的，所述流动相使用前依次进行过滤和脱气处理；所述过滤采用的滤膜的孔径为0.45μm。
优选的，进行所述高效液相色谱分析时的柱温为20～45℃。
优选的，进行所述高效液相色谱分析时采用的色谱柱为Waters XbridgeC18柱，所述色谱柱中填充物为十八烷基硅烷键合硅胶。
优选的，进行所述高效液相色谱分析时的检测波长为250nm。
优选的，进行所述高效液相色谱分析时的进样量为20μL。
优选的，所述磷酸二氢钾缓冲盐的浓度为10～50mM，pH值为3.0～5.0。
优选的，所述德拉昔布药品溶液中的溶剂为甲醇与水的混合溶剂、乙腈与水的混合溶剂、甲醇或乙腈。
本发明提供了一种测定德拉昔布含量的方法，首先提供德拉昔布药品溶液；然后将所述德拉昔布药品溶液进行高效液相色谱分析，根据德拉昔布含量的标准曲线与德拉昔布药品溶液的液相色谱图，得到德拉昔布药品中德拉昔布的含量。本发明通过高效液相色谱法对德拉昔布药品中德拉昔布的含量进行分析检测，分析速度快：每个样品经高效液相色谱检测，运行时间30min即可完成；样品用量少：对于德拉昔布对照品和德拉昔布药品，每次用量约50mg，进样量为20μL，可极大节省样品用量；检测范围大：德拉昔布在0.01～0.5mg/mL范围内，线性关系良好；精密度高：测定6份德拉昔布样品，其峰面积的RSD为0.45％；准确度高：80％、100％、120％浓度的样品，每个样品各配制3份，计算得到的平均回收率为99.01％，RSD为0.89％。
附图说明
图1为实施例1中德拉昔布含量的线性曲线；
图2为实施例3中德拉昔布含量测定的高效液相色谱图。
具体实施方式
本发明提供了一种测定德拉昔布含量的方法，包括以下步骤：
提供德拉昔布药品溶液；
将所述德拉昔布药品溶液进行高效液相色谱分析，根据德拉昔布含量的标准曲线与德拉昔布药品溶液的液相色谱图，得到德拉昔布药品中德拉昔布的含量；
其中，所述高效液相色谱的色谱条件为：
流动相：流动相为甲醇、乙腈和磷酸二氢钾缓冲液的混合物，所述甲醇、乙腈和磷酸二氢钾缓冲液的体积比为25～35：10～15：45～65；
检测器：DAD检测器；
高效液相色谱仪：Thormo U3000。
本发明提供德拉昔布药品溶液。本发明优选将德拉昔布药品与溶剂混合，得到德拉昔布药品溶液。在本发明中，所述德拉昔布药品为自制原料药，所述德拉昔布药品的制备过程为：将100g 3-氟-4-甲氧基苯乙酮加入到2000mL三口瓶中，加入600mL四氢呋喃，降温到-5℃～-10℃，分批加入24g氢化钠，搅拌40分钟；滴加70mL二氟乙酸乙酯，滴加完毕后搅拌2小时，自然升温到室温；减压蒸除四氢呋喃，加入600mL水搅拌，用盐酸调pH值为3，抽滤，水洗，烘干，得140.7克黄色固体，即缩合产物，收率96.1％。将上述140.5克缩合产物和135克对肼基苯磺酰胺盐酸盐加入到2000ml三口反应瓶中，再加入850mL乙醇和52mL盐酸，升温回流反应至反应完全。搅拌降温到室温，抽滤，乙醇：水＝1:1洗涤，水洗，烘干，得类白固体174.6克，即德拉昔布药品，收率77.2％。
在本发明中，所述溶剂优选为甲醇与水的混合溶剂、乙腈与水的混合溶剂、甲醇或乙腈；所述甲醇与水的混合溶剂中甲醇与水的体积比优选为3:1，所述乙腈与水的混合溶剂中乙腈与水的体积比优选为3:1。在本发明的实施例中，具体是将德拉昔布药品与溶剂混合后用0.45μm有机滤头过滤，得到德拉昔布药品溶液。
得到德拉昔布药品溶液后，本发明将所述德拉昔布药品溶液进行高效液相色谱分析，根据德拉昔布含量的标准曲线与德拉昔布药品溶液的液相色谱图，得到德拉昔布药品中德拉昔布的含量；其中，所述高效液相色谱的色谱条件为：
流动相：流动相为甲醇、乙腈和磷酸二氢钾缓冲液的混合物，所述甲醇、乙腈和磷酸二氢钾缓冲液的体积比为25～35：10～15：45～65；
检测器：DAD检测器；
高效液相色谱仪：Thormo U3000。
在本发明中，所述甲醇、乙腈和磷酸二氢钾缓冲液的体积比优选为28～32：11～14：50～62，更优选为30:12:58。
在本发明中，所述磷酸二氢钾缓冲液的浓度优选为10～50mM，更优选为20～35mM；pH值优选为3.0～5.0，更优选为3.5～4.5。
在本发明中，所述流动相的体积流量优选为0.8～1.5mL/min，更优选为1.0～1.2mL/min。在本发明中，所述流动相使用前优选依次进行过滤和脱气处理；所述过滤采用的滤膜的孔径优选为0.45μm。
本发明进行高效液相色谱分析时的柱温优选为20～45℃，更优选为25～40℃，最优选为30～35℃。
本发明进行高效液相色谱分析时采用的色谱柱优选为Waters XbridgeC18柱，更优选为依利特ODS-2柱；所述色谱柱中填充物优选为十八烷基硅烷键合硅胶。本发明进行高效液相色谱分析时的检测波长优选为250nm，进样量优选为20μL，采集时间优选为30min。
本发明对于建立所述德拉昔布含量的标准曲线的方法没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的方法即可。在本发明中，建立所述德拉昔布含量的标准曲线的方法优选包括以下步骤：
提供德拉昔布标准溶液；
将所述德拉昔布标准溶液进行高效液相色谱分析，以所述德拉昔布标准溶液的浓度为横坐标，以所述德拉昔布标准溶液的峰面积为纵坐标，绘制德拉昔布含量的标准曲线。
本发明提供德拉昔布标准溶液。在本发明中，所述德拉昔布标准溶液的浓度优选为0.01～0.5mg/mL。本发明对于配制德拉昔布标准溶液的方法没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的溶液的配制方法即可。在本发明的实施例中，具体是称取德拉昔布对照品，使用溶剂溶解，得到浓度为1mg/mL的德拉昔布对照品储备液，然后进行精密稀释，获得不同浓度梯度的(0.01mg/mL、0.02mg/mL、0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.5mg/mL)的德拉昔布标准溶液。
得到德拉昔布标准溶液后，本发明将所述德拉昔布标准溶液进行高效液相色谱分析，以所述德拉昔布标准溶液的浓度为横坐标，以所述德拉昔布标准溶液的峰面积为纵坐标，绘制德拉昔布含量的标准曲线。在本发明中，将所述德拉昔布标准溶液进行高效液相色谱分析所采用的高效液相色谱条件优选与本申请上述技术方案中测定德拉昔布药品溶液时采用的高效液相色谱分析的条件一致；在本发明的实施例中，所述高效液相色谱分析的条件具体如下：
Thormo U3000高效液相色谱，依利特ODS-2(250*4.6mm，5μm)；流动相：甲醇：乙腈：20mM KH2PO4(pH 4.0)＝30:12:58(V/V/V)；检测波长250nm；流速1.0mL/min；柱温30℃；进样量20μL；采集时间30min。
在本发明的实施例中，所述德拉昔布含量的标准曲线回归方程为y＝316.6x+0.193，相关系数R2＝0.999，其中，所述x为德拉昔布标准溶液的浓度，所述y为德拉昔布标准溶液的峰面积。
下面结合实施例对本发明提供的测定德拉昔布含量的方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
制作标准曲线：
称取德拉昔布对照品50mg，使用甲醇溶解，得到浓度为1mg/mL的德拉昔布对照品储备液，进行精密稀释，获得不同浓度梯度的(0.01mg/mL、0.02mg/mL、0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.2mg/mL、0.5mg/mL)的德拉昔布标准溶液；将不同浓度的德拉昔布标准溶液进行高效液相色谱分析；其中，高效液相色谱条件为：
Thormo U3000高效液相色谱，依利特ODS-2(250*4.6mm，5μm)；流动相：甲醇：乙腈：20mM KH2PO4(pH 4.0)＝30:12:58(V/V/V)；检测波长250nm；流速1.0mL/min；柱温30℃；进样量20μL；采集时间30min。
以所述德拉昔布标准溶液的浓度为横坐标，以所述德拉昔布标准溶液的峰面积为纵坐标，绘制德拉昔布含量的标准曲线(图1)。
结果表明，德拉昔布在浓度0.01mg/mL～0.5mg/mL范围内，与峰面积呈良好的线性关系，德拉昔布含量的标准曲线回归方程为y＝316.6x+0.193，相关系数R2＝0.999。
配制德拉昔布药品溶液：精密称取德拉昔布药品50mg，置于50mL容量瓶中，加入甲醇溶解，然后用甲醇定容至刻度，摇匀后用0.45μm有机滤头过滤，得到德拉昔布药品溶液。
按照上述色谱条件，对德拉昔布药品溶液进行高效液相色谱分析，按照上述色谱条件，对德拉昔布样品溶液和对照品溶液进样，6次对照品溶液进样的峰面积平均值为32.50，RSD％为0.52％。根据标准曲线计算，得到德拉昔布药品中德拉昔布的含量为99.1％。
按照实施例1的条件，进行方法学验证：
1)精密度试验
称取6份德拉昔布药品，按照实施例1所述色谱条件对德拉昔布药品进行测定，并记录6份德拉昔布药品测定的峰面积，结果见表1。
表1 6次测定德拉昔布药品的峰面积数值
次数 1 2 3 4 5 6
峰面积 32.162 32.065 32.209 32.398 32.431 32.333
经过计算可知，经过6次测定的平均峰面积为32.27，峰面积的RSD为0.45％，结果表明，本发明使用高效液相色谱法检测德拉昔布的含量，方法的精密度高，重现性好。
2)准确度试验
称取已知含量的德拉昔布药品，加入德拉昔布对照品，分别配制成80％、100％、120％浓度的德拉昔布样品溶液，每个样品溶液各配制3份，按上述方法进行测定，计算其回收率。
结果表明，该方法的平均回收率为99.01％，RSD为0.89％，说明该方法的准确度较好。
实施例2
德拉昔布对照品及德拉昔布药品溶液的配制同实施例1；
色谱条件：Thormo U3000高效液相色谱，依利特ODS-2(150*4.6mm,5μm)；流动相：甲醇：乙腈：25mM KH2PO4(pH4.2)＝30:10:60(V/V/V)；检测波长250nm；流速1.5ml/min；柱温25℃；采集时间30min。
按上述色谱条件，对德拉昔布对照品溶液连续进样测定6次，测得其平均峰面积为34.652，RSD为0.96％。
根据标准曲线计算，得到德拉昔布药品中德拉昔布的含量为99.4％。
实施例3
德拉昔布对照品及德拉昔布药品溶液的配制同实施例1；
色谱条件：Thormo U3000高效液相色谱，依利特ODS-2(200*4.6mm,5μm)；流动相：甲醇：乙腈：20mM KH2PO4(pH4.5)＝25:15:60(V/V/V)；检测波长250nm；流速0.8ml/min；柱温35℃；采集时间30min。测得的色谱图如图2所示。
按上述色谱条件，对德拉昔布对照品溶液连续进样测定6次，测得其平均峰面积为31.376，RSD为0.56％。
根据标准曲线计算，得到德拉昔布药品中德拉昔布的含量为99.0％。
由以上实施例可知，本发明提供了一种测定德拉昔布含量的方法，本发明采用高效液相色谱法进行德拉昔布含量的检测，具有分析速度快、样品用量少、精密度高、准确度高及检测范围大等优点。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种测定德拉昔布含量的方法，包括以下步骤：
提供德拉昔布药品溶液；
将所述德拉昔布药品溶液进行高效液相色谱分析，根据德拉昔布含量的标准曲线与德拉昔布药品溶液的液相色谱图，得到德拉昔布药品中德拉昔布的含量；
其中，所述高效液相色谱的色谱条件为：
流动相：流动相为甲醇、乙腈和磷酸二氢钾缓冲液的混合物，所述甲醇、乙腈和磷酸二氢钾缓冲液的体积比为25～35：10～15：45～65；
检测器：DAD检测器；
高效液相色谱仪：Thormo U3000。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述流动相的体积流量为0.8～1.5mL/min。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述流动相使用前依次进行过滤和脱气处理；所述过滤采用的滤膜的孔径为0.45μm。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，进行所述高效液相色谱分析时的柱温为20～45℃。
5.根据权利要求1或4所述的方法，其特征在于，进行所述高效液相色谱分析时采用的色谱柱为Waters Xbridge C18柱，所述色谱柱中填充物为十八烷基硅烷键合硅胶。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，进行所述高效液相色谱分析时的检测波长为250nm。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，进行所述高效液相色谱分析时的进样量为20μL。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述磷酸二氢钾缓冲盐的浓度为10～50mM，pH值为3.0～5.0。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述德拉昔布药品溶液中的溶剂为甲醇与水的混合溶剂、乙腈与水的混合溶剂、甲醇或乙腈。
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