CN109406648A - 用于检测产品中违禁药品的组合物 - Google Patents

Abstract

本发明属于保健品领域，提供了一种用于检测产品中违禁药品的组合物，所述组合物由人参提取物、西洋参提取物、刺五加提取物和玉米淀粉组成；所述产品为免疫调节产品，所述组合物可以应用于检测市场上声称具有免疫调节产品中的违禁药品检测中，在相应的检测方法中具有检测限低、干扰小、制备方便和结果灵敏度高等特点，适于工业生产和实验室检测过程，对于检测机构的检测水平进行有效的评测。

Description

用于检测产品中违禁药品的组合物

技术领域

本发明属于保健品领域，具体涉及保健品的质控领域，是一种用于检测免疫调节产品中违禁药品的组合物。

背景技术

在中国现有的注册保健产品中，有超过1/3以上宣称具有增强免疫力功能的产品，因此违法添加药品行为也多发生在此类产品中。根据根据国家食品药品监督管理总局(http://www.sda.gov.cn/WS01/CL1162/76614.html)公布的保健食品中可能非法添加的物质名单(第一批)，可能非法添加物质为：那红地那非、红地那非、伐地那非、羟基豪莫西地那非、西地那非、豪莫西地那非、氨基他打拉非、他达拉非、硫代艾地那非、伪伐地那非和那莫西地那非等PDE5型(磷酸二酯酶5型)抑制剂。

发明人根据目前市面上现有的具有增强免疫力功能的保健产品处方，发现保健品中含有各种各样的辅料，对保健品中违禁药品的检测造成了巨大干扰。

目前现行有效的检测方法为国家食品药品监督管理总局2016年第196号公告：关于发布食品中那非类物质的测定和小麦粉中硫脲的测定2项检验方法的公告。该方法为高效液相色谱质谱联用方法，检出限为ppb级，这类检测方法极易受到产品中其他物质的干扰，因此实验室对于这类物质的检测结果无相应的标准物参考标准，无法检测确定是否漏检已含有的违禁物质。因此需要一种在增强免疫力的保健食品基质中添加违禁物质的质控样的组合物，用以模拟基质对违禁物质检出的干扰。该组合物用作实验室内部质控或对实验室检验能力的考察，即在保健食品基质干扰下，定量检出ppb级违禁物质。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于检测产品中违禁药品的组合物，所述组合物由违禁药品、人参提取物、西洋参提取物、刺五加提取物和玉米淀粉组成，所述玉米淀粉为组合物 的基质，玉米淀粉的用量是用来稀释所述人参提取物、西洋参提取物和刺五加提取物在该组合物中含量，使其满足上述几种提取物在组合物中含量均为50-150g/Kg,所述违禁药品的含量为5-60mg/kg。

进一步地，本发明提供了一种用于检测产品中违禁药品的组合物，所述人参提取物、西洋参提取物和刺五加提取物的含量均为75-125g/Kg，违禁药品的含量范围为20-50mg/kg。

进一步地，本发明提供了一种用于检测产品中违禁药品的组合物，所述人参提取物、西洋参提取物和刺五加提取物的含量均为100g/Kg，违禁药品的含量范围为40mg/kg。

所述上述组合物优选固体形式。

所述产品优选为免疫调节类产品。

上述的组合物，以重量份计算，所述违禁药品：人参提取物：西洋参提取物：刺五加提取物优选：所述人参提取物、西洋参提取物和刺五加提取物的含量均为50-150g/Kg,违禁药品的含量范围为5-60mg/kg，其余成分为玉米淀粉(玉米淀粉为市售普通级别淀粉，优选符合GB/T 8885-2008食用玉米淀粉规定)。

经过反复试验证明，在本组合物中，如果去掉一种成分将减少10％到30％产品覆盖率，如果再增加一种成分将降低该方法检出的专属性，影响定量结果准确性，事宜，本发明的组合物和成分比例为最佳组合。

上述标准样品的组分范围是基于申请人多年的数据积累来确定的，因为不同的保健品所含有的基质是不同的，其中提取物基质(人参提取物、西洋参提取物、刺五加提取物)的含量尚无定论，发明人对收到的保健品进行测试后进行统计，确定了上述含量的含量范围，其中过低的基提取物含量无法模拟保健品中的基质含量，过高的提取物含量会导致后续检测中液相信号的干扰，不利于检测结果的测定。

所述玉米淀粉为基质，用来稀释人参提取物、西洋参提取物、刺五加提取物以及违禁药品在组合物中的含量的，根据上述成分在组合物的配置含量进行玉米淀粉含量的调整。

所述人参提取物、西洋参提取物、刺五加提取物均为市售产品(例如商品名“人参提取物”厂家可选自上海康汀生物科技有限公司、国药集团化学试剂有限公司、湖北远成药业有限公司等厂家；商品名“西洋参提取物”生产厂家可选自南京生利德生物科技有限公司、湖北巨胜科技有限公司和上海昕凯医药科技有限公司等厂家；商品名“刺五加提取物”生产厂家可选自福州腾远生物科技有限公司、陕西斯诺特生物技术有限公司、陕西德润康科技发展有限公司等厂家。),并优选符合以下质量标准要求的产品。本领域普通技术人员可根据相应的成本条件和实验需求，筛选符合要求的原料生产商的产品，或者按照常规提取工艺提取得到符合以下质量要求的提取物。

人参提取物检测方法：

色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以水为流动相B，按下表进行梯度洗脱；检测波长为203nm。理论板数按人参皂苷Rg1峰计算应不低于6000。

对照品溶液的制备精密称取人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Re对照品及人参皂苷Rb1对照品，加甲醇制成每1ml各含0.2mg的混合溶液，摇匀，即得。

供试品溶液的制备取本品粉末约1g，精密称定，置索氏提取器中，加三氯甲烷加热回流3小时，弃去三氯甲烷液，药渣挥干溶剂，连同滤纸筒移入100ml锥形瓶中，精密加水饱和正丁醇50m1，密塞，放置过夜，超声处理(功率250W，频率50kHz)30分钟，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液25ml，置蒸发皿中蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至5ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

测定法分别精密吸取对照品溶液10μl与供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

含量测定结果：人参皂苷Re,人参皂苷Rg1总量大于等于0.40％；人参皂苷Rb1大于等于0.50％。

西洋参提取物检测方法：色谱条件与系统适用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B；按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为203nm；柱温40℃。理论板数按人参皂苷Rb1峰计算应不低于5000。

对照品溶液的制备：精密称取人参皂苷Rg1、人参皂苷Re对照品、人参皂苷Rb1对照品适量，加甲醇制成每1ml各含人参皂苷Rg10.1mg、人参皂苷Re0.4mg、人参皂苷Rb11mg的溶液，即得。

供试品溶液的制备：取本品约1g，精密称定，置容量瓶中，精密加入水饱和的正丁醇50ml，称定重量，超声溶解0.5小时，放冷，再称定重量，用水饱和正丁醇补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液25ml，置蒸发皿中，蒸干。残渣加50％甲醇适量使溶解，并转移至10ml量瓶中，加50％甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

测定法：分别精密吸取对照品溶液10μl、供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

含量测定结果：人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1的总量大于等于3.0％。

刺五加提取物检测方法：用95％乙醇作溶剂，照醇溶性浸出物测定法项下的热浸法(见中国药典2010年版一部附录ⅩA)测定，乙醇浸出物大于等于16.0％。

违禁药品为那红地那非、红地那非、伐地那非、羟基豪莫西地那非、西地那非、豪莫西地那非、氨基他达拉非、他达拉非、硫代艾地那非、伪伐地那非和那莫西地那非的一种或一种以上的药品混合。

本发明提供上述组合物的制备方法，其中，由以下步骤组成：

1)称取玉米淀粉，粉碎至20-100目，优选35目，过筛备用；

2)称取违禁药品，溶于无水乙醇中，配制成违禁药品溶液；

3)称取人参提取物、西洋参提取物和刺五加提取物，用乙醇混合成混悬溶液；

4)将无水乙醇加入搅拌釜，加入步骤2)所述违禁药品溶液和步骤3)混悬溶液，边加边搅拌，加入玉米淀粉，边加边搅拌，至玉米淀粉溶解完全，继续搅拌，并回收乙醇；

5)回收乙醇后，过筛挤压制粒，制粒干燥；

6)制粒过筛20-100目，优选60目，得到所述组合物。

步骤1)要求外观干燥、疏松、混合均匀、色泽一致

步骤2)配制比例根据加入药品的溶解度和制备的质控样的含量而定，一般不超过2mg/mL，混合均匀，适当储藏条件保证稳定性(如低温、避光等)。

步骤3)中药材提取物的混悬液不粘稠易倾倒，混悬微粒细微均匀，下沉后不结块，稍加振摇能均匀分散，而且每一批次质控样制备时，按比例加入的中药提取物混悬液全部加入到反应釜中。

步骤4)将无水乙醇加入搅拌釜，加入违禁药品溶液和混悬溶液缓慢加入搅拌釜中，边加边搅拌，在缓缓加入玉米淀粉，边加边搅拌，至玉米淀粉溶解完全加入后，继续搅拌进行混合；每一批质控样制备时加入不少于6L无水乙醇，搅拌速度600转/分。

步骤5)水浴加热，回收乙醇。过筛挤压制粒，湿粒粒度应较均匀，外观检查无异物。

将制粒进行干燥；干燥程度根据加入目标化合物的稳定性质差异略有不同，一般不超过3％。

步骤6)过筛；再过筛20-100目，优选60目，得到标准样品。

该组合物可以作为一种质控样，用于检验各个实验室对于保健品中违禁药品的的检测能力，最终为检测结果提供测试条件的参照。

本发明进一步提供了一种组合物在免疫调节产品中违禁药品的检测中的应用。

进一步地，在上述应用中，所述应用由以下步骤组成：

1)根据所要测定的违禁药品，配置所述违禁药品的组合物，建立含有不同含量违禁药品的组合物；

2)违禁药品的组合物预处理：称取所述组合物，溶于乙腈溶解后，超声混匀，过滤等待进样；

3)称取违禁药品，建立违禁药品的标准曲线；

4)采用液质联用的方法进行，所述液相方法为：色谱柱为C18柱，1.8μm，100mm×2.1mm，或性能相当者；A为0.1％甲酸10mM乙酸铵水溶液、B为乙腈，流速0.3ml/ml,洗脱梯度，0min，90％A：10％B；2min，90％A：10％B；2.1min，65％A：35％B；4min，65％A：35％B；4.1min，60％A：40％B；6.5min，60％A：40％B；7min，20％A：80％B；9min，20％A：80％B；9.1min，10％A：90％B；12min，10％A：90％B；

质谱条件：电离方式为电喷雾正离子模式；检测方式为多反应监测(MRM)；雾化气压力为30psi；离子喷雾电压为3500V；干燥气温度为350℃；干燥气流速为8L/min。

5)根据组合物的检测结果，确定实验室的检测条件，比照违禁药品的标准曲线和供试品中液相质谱的出峰条件和质谱情况，测定供试品中是否含有违禁成分。

所述组合物的优点在于，在不同检测机构中提供一种指标性物质，该指标性物质中含有确定的违禁药品和以及保健品相似的基质，用于检测环境和检测仪器的测试，能够确定不同检测机构的检测水平，指示其改善工艺和检测方法等，提高该检测机构的检测水平以及提高其结果的可靠性。

具体实施方式

下面实验例用于进一步说明本发明但不限于本发明。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明范围。

实施例1

组合物：标准样品A，所述人参提取物：西洋参提取物：刺五加提取物的含量均为100g/Kg，违禁药品的含量范围为40mg/kg，其余成分为玉米淀粉，根据提供的制备方法进行配置。

以下为国家食品药品监督管理局的批准方法(方法1)

对照品的制备，将含有那红地那非、红地那非、伐地那非、羟基豪莫西地那非、西地那非、豪莫西地那非、氨基他达拉非、他达拉非、硫代艾地那非、伪伐地那非和那莫西地那非的供试品，各成分分别为约10mg，置50ml量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，用50％乙腈水溶液稀释指出每1ml含5μg的溶液，即得。

市场供试品溶液的制备，精密称取一次服用量，研细后转移至50ml量瓶中，加入乙腈约40ml，超声处理15分钟，冷至室温，用乙腈稀释至刻度，摇匀，滤过；

测定法分别精密称量供试品溶液及对照品溶液各10μl注入液质联用仪，记录液相色谱图和一、二级质谱图。

结果判断采用比较供试品与对照品的色谱图、一级质谱图和二级质谱图的方法进行定性分析，确定供试品中添加的化学成分。在没有对照品情况下，若供试品质谱图中出现了表中相应的准分子离子峰及三个以上二级质谱特征碎片离子时，可结合DAD光谱确定供试品中添加的化学成分。

供试品液相出峰顺序：1-那红地那非；2-红地那非；3-伐地那非；4-羟基豪莫西地那非；5-西地那非；6-豪莫西地那非；7-氨基他达那非；8-他达拉非；9-硫代艾地那非；10-伪伐地那非；11-那莫西地那非。

表1 质谱离子峰和碎片离子表

该类方法在近年来非法添加行为呈现出的新驱势下，暴露出一定不足。例如根据上述方法常常无法检测得到市面上的保健品中含有的违禁药品，原因是非法添加药物剂量的随意性很强，有些产品添加剂量极低，采用质谱全扫描模式灵敏度较低，容易产生漏筛。

方法(2)本实验中的方法：

水为GB/T 6682规定的一级水

试剂

乙腈：色谱纯

甲酸：质谱级

乙酸铵：质谱级

0.1％甲酸10mM乙酸铵水溶液：称取乙酸铵0.7708g于1000ml量瓶中，加入甲酸1ml，摇匀，用0.22μm有机相滤膜过滤后备用。

标准品

那红地那非、红地那非、伐地那非、羟基豪莫西地那非、西地那非、豪莫西地那非、氨基他达拉非、他达拉非、硫代艾地那非、伪伐地那非和那莫西地那非，HPLC纯度≥98％。

标准储备液

分别称取那红地那非、红地那非、伐地那非、羟基豪莫西地那非、西地那非、豪莫西地那非、氨基他达拉非、他达拉非、硫代艾地那非、伪伐地那非和那莫西地那非标准品0.1g(精确至0.0001g)，用乙腈溶解，并转移至100ml容量瓶中，定容至刻度，此溶液含量为1mg/mL。储存于4℃冰箱中，有效期3个月。

混合标准系列工作液：分别准确量取那红地那非、红地那非、伐地那非、羟基豪莫西地那非、西地那非、豪莫西地那非、氨基他达拉非、他达拉非、硫代艾地那非、伪伐地那非和那莫西地那非标准储备液，加入人参提取物、西洋参提取物、刺五加提取物，制备成标准样品，用乙腈稀释为1ng/ml、2ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml的标准混合溶液，临用时配制。

试样制备

准确称取2g试样(精确至0.01g)于50ml容量瓶，加入40ml乙腈，超声20min，冷却至室温，用乙腈定容至刻度，摇匀，上清液经0.22μm有机相滤膜过滤。去续滤液1.0ml于50ml容量瓶中，用乙腈定容至刻度，供液相色谱-串联质谱仪测定。

色谱条件

色谱柱：C18柱，1.8μm，100mm×2.1mm(内径)，或性能相当者；

流动相：A为0.1％甲酸10mM乙酸铵水溶液，B为乙腈，洗脱梯度见表2；

流速：0.3ml/min；

进样量：5μL。

表2 梯度洗脱

时间(min)	流速(mL/min)	流动相A(％)	流动相B(％)
				0	0.3	90	10
2	0.3	90	10
				2.1	0.3	65	35
4	0.3	65	35
				4.1	0.3	60	40
6.5	0.3	60	40
				7	0.3	20	80
9	0.3	20	80
				9.1	0.3	10	90
12	0.3	10	90

质谱条件

电离方式：电喷雾正离子模式；

检测方式：多反应监测(MRM)；

雾化气压力：30psi；

离子喷雾电压：3500V；

干燥气温度：350℃；

干燥气流速：8L/min；

定性离子对、定量离子、碎裂电压和碰撞能力见表3。

表3

定性测定

按照上述条件测定试样和标准样品，试样中色谱峰保留时间与标准样品中某一组分一致(变化范围在±2.5％以内)；试样中离子对的相对丰度与标准样品的相对丰度一致，相对丰度偏差不超过表4规定的范围，则可判定试样中存在该组分。

表4

相对离子丰度(％)	>50	>20-50	>10-20	≤10
					允许的最大偏差(％)	±20	±25	±30	±50

定量测定

将标准样品分别按照仪器条件进行测定，绘制相应的标准溶液的色谱峰面积。以标准溶液的含量为横坐标，以色谱峰的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

将试样溶液按照仪器条件进行测定，得到相应的样品溶液的色谱峰面积。根据标准曲线得到待测液中组分的含量，平行测定次数不少于两次；试样待测液响应值高于标准曲线线性范围，应用乙腈稀释后进行分析。

结果计算

X＝C×V×1000/m

式中：X为试样中某组分的含量，单位为微克每千克(μg/kg)；

C为标准样品中某组分的含量，单位为微克每毫升(μg/ml)；

V为试样溶液定容体积，单位为毫升(ml)；

m为试样称取质量，单位为克(g)；

计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。

精密度

在重复条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10％。

根据对市售保健食品调研结果，去掉一种成分将减少10％到30％产品覆盖率，增加一种成分将降低方法检出的专属性，影响定量结果准确性，因此本组合物中的原料具有特殊性。

为了验证标准样品的有效性：

在鉴定免疫调节产品中违禁产品前，申请人分别采用上述方法和标准样品A对检测机构进行了检测能力进行鉴定。

申请人找到寻找相同等级的检测机构甲-戊，分别使用标准样品A，A的配置为：(那红地那非、红地那非、伐地那非、羟基豪莫西地那非、西地那非、豪莫西地那非、氨基他达拉非、他达拉非、硫代艾地那非、伪伐地那非和那莫西地那非各含量均为40mg/Kg，人参提取物、西洋参提取物、刺五加提取物含量各为100g/Kg，其余为玉米淀粉)；检测方法分别为国家现行试验方法(方法1)和实验室方法(方法2)，甲检测机构无法检测出A中的某些ppb级违禁药品((“某些”比如为那红地那非、红地那非、伐地那非等上述一种或者多种ppb级违禁药品成分，因与本发明欲保护内容关联不密切，因此数据不再一一列举，暂欠奉))；乙-戊可以完全检测出B中的违禁药品；选用的10种抗疲劳保健品(违禁产品已知ppb级)进行分别检测，检测结果发现，甲检测机构的漏检率为30％；乙-戊检测机构的漏检率为0(漏检判定：未检测出已含有的违禁产品或少检测出已含有的违禁产品，均为漏检。)，因此标准样品A能够准确反映出五家检测的违禁产品的检测水平，有效促进甲检测机构的检测水平的提升。

Claims (9)

1.一种用于检测产品中违禁药品的组合物，其特征在于，所述组合物由违禁药品、人参提取物、西洋参提取物、刺五加提取物和玉米淀粉组成，所述玉米淀粉为组合物的基质，玉米淀粉的用量是用来满足所述人参提取物、西洋参提取物和刺五加提取物在该组合物中含量均为50-150g/Kg,所述违禁药品的含量为5-60mg/kg。

2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述人参提取物、西洋参提取物和刺五加提取物的含量均为75-125g/Kg，违禁药品的含量范围为20-50mg/kg。

3.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述人参提取物、西洋参提取物和刺五加提取物的含量均为100g/Kg，违禁药品的含量范围为40mg/kg。

4.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物为固体形式。

5.根据权利要求1-4任一所述的组合物，其特征在于，所述违禁药物为那红地那非、红地那非、伐地那非、羟基豪莫西地那非、西地那非、豪莫西地那非、氨基他打拉非、他达拉非、硫代艾地那非、伪伐地那非和那莫西地那非的一种或一种以上的混合物。

6.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述产品为免疫调节类产品。

7.一种权利要求1所述组合物的制备方法，其特征在于，由以下方法组成：

1)称取玉米淀粉，粉碎至20-100目，优选35目，过筛备用；

2)称取违禁药品，溶于无水乙醇中，配制成违禁药品溶液；

3)称取人参提取物、西洋参提取物和刺五加提取物，用乙醇混合成混悬溶液；

4)将无水乙醇加入搅拌釜，加入步骤2)所述违禁药品溶液和步骤3)混悬溶液，边加边搅拌，加入玉米淀粉，边加边搅拌，至玉米淀粉溶解完全，继续搅拌，并回收乙醇；

5)回收乙醇后，过筛挤压制粒，制粒干燥；

6)制粒过筛20-100目，优选60目，得到所述组合物。

8.一种权利要求1所述产品中违禁药品的组合物在检测免疫调节产品中违禁药品中的应用。

9.一种权利要求8所述应用，其特征在于，所述应用由以下步骤组成：

1)根据所要测定的违禁药品，配置所述违禁药品的组合物，建立含有不同含量违禁药品的组合物；

2)违禁药品的组合物预处理：称取所述组合物，溶于乙腈溶解后，超声混匀，过滤等待进样；

3)称取违禁药品，建立违禁药品的标准曲线；

4)采用液质联用的方法进行，所述液相方法为：色谱柱为C18柱，1.8μm，100mm×2.1mm，或性能相当者；A为0.1％甲酸10mM乙酸铵水溶液、B为乙腈，流速0.3ml/ml,洗脱梯度，0min，90％A：10％B；2min，90％A：10％B；2.1min，65％A：35％B；4min，65％A：35％B；4.1min，60％A：40％B；6.5min，60％A：40％B；7min，20％A：80％B；9min，20％A：80％B；9.1min，10％A：90％B；12min，10％A：90％B；

质谱条件：电离方式为电喷雾正离子模式；检测方式为多反应监测(MRM)；雾化气压力为30psi；离子喷雾电压为3500V；干燥气温度为350℃；干燥气流速为8L/min。

5)根据组合物的检测结果，确定实验室的检测条件，比照违禁药品的标准曲线和供试品中液相质谱的出峰条件和质谱情况，测定供试品中是否含有违禁成分。