CN106226409B - 清咳平喘颗粒的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种清咳平喘颗粒的检测方法。所述清咳平喘颗粒的原料药包含鱼腥草和苦杏仁，所述方法包括通过薄层色谱法检测所述清咳平喘颗粒中的鱼腥草和通过高效液相色谱法检测所述清咳平喘颗粒中的苦杏仁并测定苦杏仁苷的含量。本发明提供的检测方法重现性好、专属性强，符合准确、简便、灵敏、快速的原则，可以更有效的控制产品的质量。本发明提供的检测方法使清咳平喘颗粒的质量标准更加严格，检测项目更加全面，质控体系更加完备、科学。

Description

清咳平喘颗粒的检测方法
技术领域
本发明属于中药检测技术领域，涉及一种中药制剂的检测方法，尤其涉及一种清咳平喘颗粒的检测方法。
背景技术
清咳平喘颗粒为一种中药复方制剂，药品批准文号为国药准字Z20040047，现行质量标准编号为YBZ02472004-2009Z，该标准记载内容主要包括：
处方：
制法：以上十味，川贝母粉碎成粗粉，照流浸膏剂与浸膏剂项下的渗漉法(中国药典2005年版一部附录IO)，用70％的乙醇做溶剂，浸渍48小时后进行渗漉，收集漉液约1000ml，回收乙醇至无醇味，备用；鱼腥草用水蒸气蒸馏3小时，收集蒸馏液，分取挥发油与药液，另器保存；石膏加水煎煮半小时，加入浸泡1小时的麻黄等七味及川贝母、鱼腥草药渣，加水煎煮三次，每次2小时，合并煎液，滤过，滤液与鱼腥草药液合并，浓缩至相对密度为1.30～1.35(50℃)的清膏，加入上述川贝母浸膏，混匀，干燥，粉碎，加入蔗糖330g，糊精适量、拌匀，制成颗粒，干燥，喷入上述鱼腥草挥发油，制成1000g，既得。
性状：清咳平喘颗粒为棕色至棕褐色的颗粒；气微香，味苦、微甜。
主治：清热宣肺，止咳平喘。用于急性支气管炎、慢性支气管炎急性发作属痰热郁肺证。
症见：咳嗽气急，甚或喘息，咯痰色黄或不爽，发热，咽痛，便干，苔黄或黄腻等。
在清咳平喘颗粒的处方中，鱼腥草为三白草科植物蕺菜Houttuynia cordataThumb.的新鲜全草或干燥地上部分。具有清热解毒，利尿消肿等功效。现代药理实验表明，鱼腥草具有抗菌、抗病毒、提高机体免疫力等作用。苦杏仁：为蔷薇科植物山杏Prunusarmeniaca L.var.ansu Maxim.、西伯利亚杏Prunus sibirica L.、东北杏Prunusmandshurica(Maxim.)Koehne或杏Prunus armeniaca L.的干燥成熟种子。夏季采收成熟果实，除去果肉和核壳，取出种子，晒干。具有降气止咳平喘，润肠通便等功效。用于咳嗽气喘，胸满痰多，肠燥便秘。
现行质量标准YBZ02472004-2009Z中，采用薄层色谱法对清咳平喘颗粒中的苦杏仁、鱼腥草成分进行鉴别，但斑点颜色不明显，对鉴别结果的判定存在争议。
发明内容
为解决现有技术中存在的以上问题，提高药品质量标准，本发明分别对鱼腥草及苦杏仁的鉴别进行了深入研究，并提供了苦杏仁含量测定方法，采用高效液相色谱法对清咳平喘颗粒中苦杏仁进行鉴别和含量测定，并且对鱼腥草的薄层色谱法鉴别方法进行了改进。
因此，本发明的目的是提供一种清咳平喘颗粒的检测方法，本发明提供的检测方法重现性好、专属性强，符合准确、简便、灵敏、快速的原则，可以更有效的控制产品的质量。同时，本发明提供的检测方法使清咳平喘颗粒的质量标准更加严格，检测项目更加全面，质控体系更加完备、科学。
针对上述目的，本发明的技术方案如下：
一种清咳平喘颗粒的检测方法，其特征在于，所述方法包括通过薄层色谱法检测所述清咳平喘颗粒中的鱼腥草；和
通过高效液相色谱法检测所述清咳平喘颗粒中的苦杏仁并测定苦杏仁苷的含量；
其中，所述薄层色谱法中使用的展开剂为乙醚-氯仿-醋酸乙酯，其体积比为1～5：4～8：0.1～3，优选地体积比为3：6：1；
其中，所述HPLC的色谱的流动相A为6.25％乙腈水溶液，流动相B为甲醇；
所述HPLC的梯度洗脱条件如下，其中流动相比例均为体积百分比:
0～15min，流动相A为80％，流动相B为20％；
15～20min，流动相A为80～0％，流动相B为20～100％；
20～35min，流动相A为0～80％，流动相B为100～20％；
理论板数按苦杏仁苷峰计算不低于4500。
其中，所述通过薄层色谱法检测所述清咳平喘颗粒中的鱼腥草是通过包含以下步骤的方法实现的：
(1)取清咳平喘颗粒，研细，加水，超声离心后滤过，然后在滤液中加氢氧化钠试液，再加乙酸乙酯提取2次，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加乙酸乙酯溶解，作为供试品溶液；
(2)将步骤(1)得到的供试品溶液点样于硅胶薄层板，以乙醚-氯仿-醋酸乙酯为展开剂展开进行鉴别，所述展开剂的体积比为1～5：4～8：0.1～3，优选地体积比为3：6：1；
优选地，所述步骤(1)中还包括取鱼腥草对照药材，研细，加水，超声离心后滤过，然后在滤液中加氢氧化钠试液，再加乙酸乙酯提取2次，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加乙酸乙酯溶解，作为鱼腥草对照品溶液；
所述步骤(2)中还包括将鱼腥草对照药材溶液点样于硅胶薄层板，以乙醚-氯仿-醋酸乙酯为展开剂展开，所述展开剂的体积比为1～5：4～8：0.1～3，优选地体积比为3：6：1；
优选地，所述步骤(1)中还包括按清咳平喘颗粒的处方比例及制备工艺，配制不含鱼腥草的阴性样品，并按所述鱼腥草供试品溶液的配制方法制成鱼腥草阴性样品溶液；
所述步骤(2)中还包括将鱼腥草阴性样品溶液点样于硅胶薄层板，以乙醚-氯仿-醋酸乙酯为展开剂展开，所述展开剂的体积比为1～5：4～8：0.1～3，优选地体积比为3：6：1；
优选地，所述步骤(1)为：取清咳平喘颗粒5～20g，研细，加水15～40ml，超声10～30min，1000～3000r/min离心5～20min，滤过，滤液加氢氧化钠试液1～3ml，再加乙酸乙酯提取1～2次，每次10～30ml，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加乙酸乙酯1～3ml使溶解，作为供试品溶液；取鱼腥草对照药材0.5～2g，研细，加水15～40ml，超声10～30min，1000～3000r/min离心5～20min，滤过，滤液加氢氧化钠试液1～3ml，再加乙酸乙酯提取1～2次，每次10～30ml，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加乙酸乙酯1～3ml使溶解，作为鱼腥草对照药材溶液；按清咳平喘颗粒的处方比例及制备工艺，配制不含鱼腥草的阴性样品，并按所述鱼腥草供试品溶液的配制方法制成鱼腥草阴性样品溶液。
优选地，所述步骤(1)为：取清咳平喘颗粒10g，研细，加水25ml，超声20min，3000r/min离心10min，滤过，滤液加氢氧化钠试液2ml，再加乙酸乙酯提取2次，每次20ml，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加乙酸乙酯1ml使溶解，作为供试品溶液；取鱼腥草对照药材1g，研细，加水25ml，超声20min，3000r/min离心10min，滤过，滤液加氢氧化钠试液2ml，再加乙酸乙酯提取2次，每次20ml，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加乙酸乙酯1ml使溶解，作为鱼腥草对照药材溶液；按清咳平喘颗粒的处方比例及制备工艺，配制不含鱼腥草的阴性样品，并按所述鱼腥草供试品溶液的配制方法制成鱼腥草阴性样品溶液。
优选地，所述步骤(2)为：吸取步骤(1)中制得的样品溶液，将其分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙醚-氯仿-醋酸乙酯为展开剂，薄层板置展开缸中饱和，展开，取出，晾干，紫外光灯下检视，所述展开剂的体积比为1～5：4～8：0.1～3，优选地体积比为3：6：1。
优选地，所述步骤(2)中，所述吸取的样品溶液均为5～20μL，优选均为5μL；所述薄层板置展开缸中饱和0～40分钟，优选20分钟，展开，晾干，于365nm紫外光灯下检视。
本申请所述的氢氧化钠试液为《中国药典》附录中规定的配制方法，每版药典的规定相同，取氢氧化钠4.3g，加水使溶解成100ml，即得。
其中，所述通过高效液相色谱法检测所述清咳平喘颗粒中的苦杏仁并测定苦杏仁苷的含量是通过包含以下步骤的方法实现的：
(a)制备供试品溶液；
(b)制备对照品溶液；
(c)使用HPLC法测定，记录色谱图并计算苦杏仁苷的含量，
其中，所述HPLC的色谱的流动相A为6.25％乙腈水溶液，流动相B为甲醇；
所述HPLC的梯度洗脱条件如下，其中流动相比例均为体积百分比:
0～15min，流动相A为80％，流动相B为20％；
15～20min，流动相A为80～0％，流动相B为20～100％；
20～35min，流动相A为0～80％，流动相B为100～20％；
理论板数按苦杏仁苷峰计算不低于4500。
优选地，所述步骤(a)为：称取供试品0.2～0.5g，加入6～12ml 50％甲醇，称定重量，超声5～10分钟，称定重量，加50％甲醇补足减失重量，滤过，即可。
更优选地，所述步骤(a)为：精密称取供试品0.3g，加入10ml 50％甲醇，称定重量，超声10分钟，称定重量，加50％甲醇补足减失重量，过滤，然后将滤液过0.45μm滤膜，即可。
优选地，所述步骤(b)为：取苦杏仁苷对照品10mg，精密称定，置100ml容量瓶中，用50％甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得(每1ml含苦杏仁苷0.1mg)。
优选地，所述步骤(c)中：
所述HPLC的色谱条件还包括：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；
检测波长210nm；
进样量：5～20μL，优选为10μL；
流速：0.5-0.9mL/min，优选为0.7mL/min；
柱温为35～42℃，优选40℃。
在一个优选的实施方案中，所述通过高效液相色谱法检测所述清咳平喘颗粒中的苦杏仁并测定苦杏仁苷的含量是通过包括以下方法的步骤实现的：
(a)制备供试品溶液：精密称取装量差异项下的供试品0.3g，加入10ml50％甲醇，称定重量，超声10分钟，称定重量，加50％甲醇补足减失重量，滤过后，滤液过0.45μm滤膜，得到所述供试品溶液；
(b)制备对照品溶液：取苦杏仁苷对照品10mg，精密称定，置100ml容量瓶中，用50％甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得(每1ml含苦杏仁苷0.1mg)；
(c)使用HPLC法测定，记录色谱图并计算苦杏仁苷的含量：
所述HPLC的色谱条件如下：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；
其中，所述HPLC的色谱的流动相A为6.25％乙腈水溶液，流动相B为甲醇；
所述HPLC的梯度洗脱条件如下，其中流动相比例均为体积百分比:
0～15min，流动相A为80％，流动相B为20％；
15～20min，流动相A为80～0％，流动相B为20～100％；
20～35min，流动相A为0～80％，流动相B为100～20％；
检测波长210nm；
进样量：10μL；
流速：0.7mL/min；
柱温为40℃；
理论板数按苦杏仁苷峰计算不低于4500。
清咳平喘颗粒每袋含苦杏仁以苦杏仁苷(C20H27NO11)计，不得少于25mg。
优选地，所述清咳平喘颗粒的原料药组成为石膏、金荞麦、鱼腥草、麻黄(蜜炙)、炒苦杏仁、川贝母、矮地茶、枇杷叶、紫苏子(炒)、炙甘草。
优选地，所述清咳平喘颗粒的原料药组成按重量计为：
优选地，所述清咳平喘颗粒的制备方法为：取原料药，川贝母粉碎成粗粉，照流浸膏剂与浸膏剂渗漉法，用70％的乙醇做溶剂、浸渍48小时后进行渗漉，收集漉液约1000ml，回收乙醇至无醇味，备用；鱼腥草用水蒸气蒸馏3小时，收集蒸馏液，分取挥发油与药液，另器保存；石膏加水煎煮半小时，加入浸泡1小时的麻黄等七味及川贝母、鱼腥草药渣，加水煎煮三次，每次2小时，合并煎液，滤过，滤液与鱼腥草药液合并，浓缩至相对密度为1.30～1.35(50℃)的清膏，加入上述川贝母浸膏，混匀，干燥，粉碎，加入蔗糖330g，糊精适量、拌匀，制成颗粒，干燥，喷入上述鱼腥草挥发油、按药剂学常规方法，加入常规辅料，制成颗粒剂。
本发明分别对鱼腥草及苦杏仁的鉴别项进行修订，并增加苦杏仁含量测定项，同时采用高效液相色谱法对清咳平喘颗粒中苦杏仁进行鉴别并进行含量测定，并对鱼腥草的薄层色谱法鉴别进行改进。本发明提供的检测方法重现性好、专属性强，符合准确、简便、灵敏、快速的原则，可以更有效的控制产品的质量。同时，本发明提供的检测方法使清咳平喘颗粒的质量标准更加严格，检测项目更加全面，质控体系更加完备、科学。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1为本发明所述的鱼腥草鉴定薄层色谱图；
其中，图1中，1、2、3为使用方法①处理的对照品液，4、5、6为使用方法①制备的供试品溶液；
并且，图1中展开剂为：①正己烷-乙酸乙酯(9:1)
展距：8cm 点样量：均5μl
显色剂：①喷以二硝基苯肼试液至斑点清晰
薄层板：薄层板①
展开条件：T:20℃，RH:50～60％。
图2为本发明所述的鱼腥草鉴定薄层色谱图；
其中，图2中，1、2为使用方法②处理的对照品液；3、4、5为使用方法②制备的供试品溶液；6为使用方法①制备的阴性样品溶液
并且，图2中展开剂为：①正己烷-乙酸乙酯(9:1)；
展距：8cm 点样量：均5μl
显色剂：②喷以5％香草醛硫酸液，105℃烘干5min
薄层板：薄层板①
展开条件：T:20℃，RH:50～60％。
图3为本发明所述的鱼腥草鉴定薄层色谱图；
其中，图3中，1、2为使用方法③处理的对照品液；3、4、5为使用方法③制备的供试品溶液；6为使用方法②制备的阴性样品溶液
并且，图3中展开剂为：②三氯甲烷-甲醇(15:1)；
展距：8cm 点样量：均5μl
显色剂：③置紫外光灯(365nm)下检视
薄层板：薄层板①
展开条件：T:20℃，RH:50～60％。
图4为本发明所述的鱼腥草鉴定薄层色谱图；
其中，图4中，1、2为使用方法④处理的对照品液；3、4、5为使用方法④制备的供试品溶液；6为使用方法③制备的阴性样品溶液
并且，图4中展开剂为：③石油醚(60-90℃)-氯仿-醋酸乙酯-冰醋酸(7:4:3:0.3)；
展距：8cm 点样量：均5μl
显色剂：③置紫外光灯(365nm)下检视
薄层板：薄层板①
展开条件：T:20℃，RH:50～60％。
图5为本发明所述的鱼腥草鉴定薄层色谱图；
其中，图5中，1、2为使用方法④处理的对照品液；3、4、5为使用方法④制备的供试品溶液；6为使用方法③制备的阴性样品溶液
并且，图5中展开剂为：④三氯甲烷-甲酸(15:1)；
展距：8cm 点样量：均5μl
显色剂：③置紫外光灯(365nm)下检视
薄层板：薄层板①
展开条件：T:20℃，RH:50～60％。
图6为本发明所述的鱼腥草鉴定薄层色谱图；
其中，图6中，1、2为使用方法④处理的对照品液；3、4为使用方法④制备的供试品溶液；5、6为使用方法③制备的阴性样品溶液
并且，图6中展开剂为：⑤三氯甲烷-甲醇-冰乙酸(75:12:0.5)；
展距：8cm 点样量：均5μl
显色剂：②喷以5％香草醛硫酸液，105℃烘干5min
薄层板：薄层板①
展开条件：T:20℃，RH:50～60％。
图7为本发明所述的鱼腥草鉴定薄层色谱图；
其中，图7中，1、2为使用方法④处理的对照品液；3、4为使用方法④制备的供试品溶液；5、6为使用方法③制备的阴性样品溶液
并且，图7中展开剂为：⑥正己烷-乙酸乙酯(9:1)；
展距：8cm 点样量：均5μl
显色剂：①喷以二硝基苯肼试液至斑点清晰
薄层板：薄层板①
展开条件：T:20℃，RH:50～60％。
图8为本发明所述的鱼腥草鉴定薄层色谱图；
其中，图8中，1、2为使用方法⑤处理的对照品液；3、4、5为使用方法⑤制备的供试品溶液；6为使用方法④制备的阴性样品溶液
并且，图8中展开剂为：⑨乙醚-氯仿-乙酸乙酯(3:6:1)；
展距：8cm 点样量：均5μl
显色剂：③置紫外光灯(365nm)下检视
薄层板：薄层板①
展开条件：T:20℃，RH:50～60％。
图9为本发明所述的鱼腥草鉴定薄层色谱图；
其中，图9中，1、2为使用方法⑤处理的对照品液；3、4、5为使用方法⑤制备的供试品溶液；6为使用方法④制备的阴性样品溶液
并且，图9中展开剂为：⑦乙醚-氯仿-乙酸乙酯(3:6:1)；
展距：8cm 点样量：均5μl
显色剂：③置紫外光灯(365nm)下检视
薄层板：薄层板②
展开条件：T:20℃，RH:50～60％。
图10为本发明所述的苦杏仁苷对照品紫外扫描图；
图11为本发明所述的使用不同的方法制备的样品溶液色谱图；
图12为本发明所述的使用不同的方法制备的样品溶液色谱图；
图13为本发明所述的使用不同的流动相制备的苦杏仁对照品和供试品的色谱图；
其中图a为苦杏仁苷对照品色谱图，图b为供试品色谱图；
图14为本发明所述的使用不同的流动相制备的苦杏仁对照品和供试品的色谱图；
其中图a为苦杏仁苷对照品色谱图，图b为供试品色谱图；
图15为本发明所述的使用不同的流动相制备的苦杏仁对照品和供试品的色谱图；
其中图a为苦杏仁苷对照品色谱图，图b为供试品色谱图；
图16为本发明所述的使用不同的流动相制备的苦杏仁对照品和供试品的色谱图；
其中图a为苦杏仁苷对照品色谱图，图b为供试品色谱图；
图17为本发明所述的使用不同的流动相制备的苦杏仁对照品和供试品的色谱图；
其中图a为苦杏仁苷对照品色谱图，图b为供试品色谱图；
图18为本发明所述的使用Hyper Clone C18(250×4.6，5um)色谱柱的苦杏仁对照品和供试品的色谱图；
其中图a为苦杏仁苷对照品色谱图，图b为供试品色谱图；
图19为本发明所述的使用Diamonsil C18(250×4.6，5um)色谱柱的苦杏仁对照品和供试品的色谱图；
其中图a为苦杏仁苷对照品色谱图，图b为供试品色谱图；
图20为本发明所述的使用Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18(250×4.6，5um)色谱柱的苦杏仁对照品和供试品的色谱图；
其中图a为苦杏仁苷对照品色谱图，图b为供试品色谱图；
图21为本发明所述的使用不同的进样量的色谱图；
其中图a进样量为5μl，图b进样量为10μl，图c进样量为20μl；
图22为本发明所述的阴性对照样品的色谱图；
图23为本发明所述的运行时间为1.5小时的色谱图；
图24为本发明所述的苦杏仁苷的标准曲线；
图25为本发明所述的苦杏仁苷的对照品色谱图；
图26为本发明所述的苦杏仁苷颗粒(批号151101)的色谱图；
图27为本发明所述的苦杏仁苷颗粒(批号151102)的色谱图。
图28为本发明所述的苦杏仁苷颗粒(批号151103)的色谱图。
具体实施方式
除非另外说明，本发明实施例中所用的展开剂的比值均为体积比。
实验例1：鱼腥草薄层色谱检测
1.仪器
乳钵、电子秤、具塞锥形瓶、移液管、超声波提取仪、漏斗、滤纸、蒸发皿、点样器、硅胶G板、层析缸、喷雾瓶、电吹风。
2.对照药材
鱼腥草对照药材
3.试剂
乙醇、甲醇、乙醚、氯仿、正己烷、冰醋酸、石油醚、二硝基苯、环己烷、乙酸乙酯、香草醛、硫酸。
4.检验方法：
4.1 样品制备方法：
4.1.1 供试品溶液制备：
①取清咳平喘颗粒10g，研细，加乙醚30ml，回流提取1小时，滤过，滤渣备用，滤液低温蒸干，残渣加乙醚2ml使溶解，作为供试品溶液。
②取清咳平喘颗粒2g，研细，精密称量，加50％乙醇溶解，超声处理20min，过滤，蒸去乙醇，残渣加水溶解，加氯仿萃取两次，合并水层，氯仿层弃去。将水溶液蒸干，加入甲醇溶解，作为供试品溶液。
③取清咳平喘颗粒2g，研细，加入95％乙醇20ml，超声提取30min，滤过，滤液蒸干，残渣加95％乙醇1ml使溶解，作为供试品溶液。
④取清咳平喘颗粒3g，研细，加甲醇10ml，超声处理30min，滤过，滤液，低温挥干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。
⑤取清咳平喘颗粒10g，研细，加水25ml，超声20min，3000r/min离心10min，滤过，滤液加氢氧化钠试液2ml，再加乙酸乙酯提取2次，每次20ml，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加乙酸乙酯1ml使溶解，作为供试品溶液。
4.1.2 对照药材溶液制备：
①鱼腥草药材粉末1g，加乙醚浸渍1小时，滤过，滤液低温蒸干，残渣加乙醚2ml使溶解，作为对照药材溶液。
②取鱼腥草药材粉末1g，加50％乙醇溶解，超声处理20min，过滤，蒸去乙醇，残渣加水溶解，加氯仿萃取两次，合并水层，氯仿层弃去。将水溶液蒸干，作为对照药材溶液。
③取鱼腥草药材粉末1g，加入95％乙醇20ml，超声提取30min，滤过，滤液蒸干，残渣加95％乙醇1ml使溶解，作为对照药材溶液。
④取鱼腥草药材粉末2g，粉碎，加甲醇25ml，超声处理30min，滤过，滤液浓缩至干，残渣用1μl甲醇溶解，作为对照药材溶液。
⑤取鱼腥草药材粉末1g，加水25ml，超声20min，3000r/min离心10min，滤过，滤液加氢氧化钠试液2ml，再加乙酸乙酯提取2次，每次20ml，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加乙酸乙酯1ml使溶解，作为对照药材溶液。
4.1.3 阴性样品溶液制备：
①取鱼腥草阴性样品1g，加50％乙醇溶解，超声处理20min，过滤，蒸去乙醇，残渣加水溶解，加氯仿萃取两次，合并水层，氯仿层弃去。将水溶液蒸干，作为阴性样品溶液。
②取鱼腥草阴性样品1g，加入95％乙醇20ml，超声提取30min，滤过，滤液蒸干，残渣加95％乙醇1ml使溶解，作为阴性样品溶液。
③取鱼腥草阴性样品1g，加甲醇10ml，超声处理30min，滤过，滤液，低温挥干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为阴性样品溶液。
④取鱼腥草阴性样品1g，研细，加水25ml，超声20min，3000r/min离心10min，滤过，滤液加氢氧化钠试液2ml，再加乙酸乙酯提取2次，每次20ml，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加乙酸乙酯1ml使溶解，作为阴性样品溶液。
点样量：供试品溶液5μl，对照药材溶液5μl，阴性样品溶液5μl
4.2 展开剂考察：
①正己烷-乙酸乙酯(9:1)。
②三氯甲烷-甲醇(15:1)。
③石油醚(60-90℃)-氯仿-乙酸乙酯-冰醋酸(7:4:3:0.3)。
④三氯甲烷-甲酸(15:1)
⑤三氯甲烷-甲醇-冰乙酸(75:12:0.5)
⑥正己烷-乙酸乙酯(9:1)
⑦乙醚-氯仿-乙酸乙酯(3:6:1)。
4.3 显色及检视方法考察：
①喷以二硝基苯肼试液至斑点清晰。
②喷以5％香草醛硫酸液，105℃烘干5min。
③置紫外光灯(365nm)下检视。
4.4 薄层板考察：
①羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板(青岛海洋化工厂分厂，规格：100×100mm,厚度：0.20-0.25mm)。
②选用TCL Silica gel 60(Merck KGal 25Plastic sheets 20×20cm)。
5.实验结果：
5.1 实验结果如图1-9所示：
其中，图1中，1、2、3为使用方法①处理的对照品液；4、5、6为使用方法①制备的供试品溶液
并且，图1中展开剂为：①正己烷-乙酸乙酯(9:1)
展距：8cm 点样量：均5μl
显色剂：①喷以二硝基苯肼试液至斑点清晰
薄层板：薄层板①
展开条件：T:20℃，RH:50～60％。
其中，图2中，1、2为使用方法②处理的对照品液；3、4、5为使用方法②制备的供试品溶液；6为使用方法①制备的阴性样品溶液
并且，图2中展开剂为：①正己烷-乙酸乙酯(9:1)；
展距：8cm 点样量：均5μl
显色剂：②喷以5％香草醛硫酸液，105℃烘干5min
薄层板：薄层板①
展开条件：T:20℃，RH:50～60％。
其中，图3中，1、2为使用方法③处理的对照品液；3、4、5为使用方法③制备的供试品溶液；6为使用方法②制备的阴性样品溶液
并且，图3中展开剂为：②三氯甲烷-甲醇(15:1)；
展距：8cm 点样量：均5μl
显色剂：③置紫外光灯(365nm)下检视
薄层板：薄层板①
展开条件：T:20℃，RH:50～60％。
其中，图4中，1、2为使用方法④处理的对照品液；3、4、5为使用方法④制备的供试品溶液；6为使用方法③制备的阴性样品溶液
并且，图4中展开剂为：③石油醚(60-90℃)-氯仿-醋酸乙酯-冰醋酸(7:4:3:0.3)；
展距：8cm 点样量：均5μl
显色剂：③置紫外光灯(365nm)下检视
薄层板：薄层板①
展开条件：T:20℃，RH:50～60％。
其中，图5中，1、2为使用方法④处理的对照品液；3、4、5为使用方法④制备的供试品溶液；6为使用方法③制备的阴性样品溶液
并且，图5中展开剂为：④三氯甲烷-甲酸(15:1)；
展距：8cm 点样量：均5μl
显色剂：③置紫外光灯(365nm)下检视
薄层板：薄层板①
展开条件：T:20℃，RH:50～60％。
其中，图6中，1、2为使用方法④处理的对照品液；3、4为使用方法④制备的供试品溶液；5、6为使用方法③制备的阴性样品溶液
并且，图6中展开剂为：⑤三氯甲烷-甲醇-冰乙酸(75:12:0.5)；
展距：8cm 点样量：均5μl
显色剂：②喷以5％香草醛硫酸液，105℃烘干5min
薄层板：薄层板①
展开条件：T:20℃，RH:50～60％。
其中，图7中，1、2为使用方法④处理的对照品液；3、4为使用方法④制备的供试品溶液；5、6为使用方法③制备的阴性样品溶液
并且，图7中展开剂为：⑥正己烷-乙酸乙酯(9:1)；
展距：8cm 点样量：均5μl
显色剂：①喷以二硝基苯肼试液至斑点清晰
薄层板：薄层板①
展开条件：T:20℃，RH:50～60％。
其中，图8中，1、2为使用方法⑤处理的对照品液；3、4、5为使用方法⑤制备的供试品溶液；6为使用方法④制备的阴性样品溶液
并且，图8中展开剂为：⑨乙醚-氯仿-乙酸乙酯(3:6:1)；
展距：8cm 点样量：均5μl
显色剂：③置紫外光灯(365nm)下检视
薄层板：薄层板①
展开条件：T:20℃，RH:50～60％。
其中，图9中，1、2为使用方法⑤处理的对照品液；3、4、5为使用方法⑤制备的供试品溶液；6为使用方法④制备的阴性样品溶液
并且，图9中展开剂为：⑦乙醚-氯仿-乙酸乙酯(3:6:1)；
展距：8cm 点样量：均5μl
显色剂：③置紫外光灯(365nm)下检视
薄层板：薄层板②
展开条件：T:20℃，RH:50～60％。
5.2 结果分析：
5.2.1 五种样品制备方法，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，均显相同颜色的斑点。以制备方法⑤处理样品展开的色谱图，斑点比较清晰，故选择此方法进行展开剂考察。
5.2.2 通过对两种薄层板进行薄层色谱对比，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，均显相同颜色的斑点，斑点比较清晰，两者并无太大的差别。故从经济，实用的角度考虑，选择相对较为便宜的国产以羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板。
5.2.3 在五种展开条件下，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，均显相同颜色的斑点。以选用展开剂为乙醚-氯仿-乙酸乙酯(3:6:1)溶液，Rf值为0.5左右，斑点比较清晰。
5.4 最优方法：
在以上条件下反复试验，最终确定了鱼腥草的专属性薄层色谱法如下：
供试品溶液制备：取清咳平喘颗粒10g，研细，加水25ml，超声20min，滤过，滤液加氢氧化钠试液2ml，再加乙酸乙酯提取2次，每次20ml，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加乙酸乙酯1ml使溶解，作为供试品溶液。
阴性对照品溶液制备取鱼腥草阴性样品1g，研细，同法制成阴性样品溶液。
对照药材溶液制备另取鱼腥草药材1g，粉碎，同法制成对照药材溶液。
薄层鉴别方法照薄层色谱法(2010版《中国药典》一部附录VIB)试验，吸取上述三种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙醚-氯仿-醋酸乙酯(3:6:1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
实施例2 苦杏仁高效液相色谱鉴别及含量测定实验方法学研究
现行质量标准中对苦杏仁的鉴别采用了薄层色谱法，但薄层斑点显色不明显，因此研究初期拟对现有苦杏仁的薄层鉴别方法进行改进，而后发现薄层斑点显色仍不明显，于是本发明中采用高效液相色谱法鉴别清咳平喘颗粒中苦杏仁成分并进行含量测定，对检测方法中的检测波长、流动相、色谱柱、理论塔板数、样品处理方法等进行筛选研究和方法学验证，试验数据显示，该方法科学稳定，能够达到控制产品质量的目的。
按照2015年版《中国药典》一部附录XVIII A中药质量标准分析方法验证指导原则考察，具体内容如下。
2.1 仪器与试药：
LC-2010高效液相色谱仪、CLASS-VP工作站、梅特勒AB204-N电子天平、KQ-50B型超声波清洗器；
乙腈、甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯。
2.2 对照品的来源：
苦杏仁苷批号：008012-201004，来源于中国食品药品检定研究院。
2.3 测定波长选择：
苦杏仁苷对照品紫外扫描，最大吸收波长为210nm，同时参考药典和文献[1-6]苦杏仁苷的测定方法，多选择210nm波长处测定，因此，本实验选用210nm作为检测波长。见图10，其中图10为本发明所述的苦杏仁苷对照品紫外扫描图。
2.4 样品制备方法考察
2.4.1 不同处理方法：
方法一：取样品0.3g，加入50％甲醇10ml，超声20min，过滤，滤液过0.45um微孔滤膜，即可。结果见图11，为本发明所述的使用不同的方法制备的样品溶液色谱图。
方法二：取样品3g，加入10ml水溶解，过滤，滤液加至已经处理好的大孔吸附树脂柱(D101型1.5cm×12cm)，先以100ml水洗，弃去水洗液，继以50％乙醇50ml洗脱，先收集15ml弃去，收集剩余部分即可。结果见图12，为本发明所述的使用不同的方法制备的样品溶液色谱图。
结果：两种处理方法测得样品含量分别为：0.315％，0.276％，方法一测定结果较高，说明样品过树脂柱有部分吸附。两种方法液相分离效果没有差别，因此处理方法选用溶剂直接超声提取后，测定。
2.4.2 不同提取溶剂考察
选用水，甲醇，50％甲醇进行超声提取，均超声20分钟，结果见表1。
表1 不同提取溶剂
提取溶剂 水 50％甲醇 甲醇
含量(mg/袋) 30.05 30.50 26.30
结果：以50％甲醇做溶剂提取率最高，故选择50％甲醇作为提取溶剂。
2.4.3 超声时间的考察
选用50％甲醇作为提取溶剂，分别超声10、20、30min，结果见表2。
表2 提取时间考察结果
提取时间(min) 10 20 30
含量(mg/袋) 30.60 30.90 30.40
结果：三个提取时间，样品含量没有差别，表明超声10min，样品已提取完全。
2.5 不同流动相考察
流动相一：乙腈：0.1％磷酸(8:92)，流速为0.7ml/min。
结果见图13，为本发明所述的使用不同的流动相制备的苦杏仁对照品和供试品的色谱图；其中图a为苦杏仁苷对照品色谱图，图b为供试品色谱图。
流动相二：甲醇：水(20:80)，流速为1.0ml/min。
结果见图14，为本发明所述的使用不同的流动相制备的苦杏仁对照品和供试品的色谱图；其中图a为苦杏仁苷对照品色谱图，图b为供试品色谱图。
流动相三：水：甲醇：乙腈(75:20:5)，流速为0.7ml/min。
结果见图15，为本发明所述的使用不同的流动相制备的苦杏仁对照品和供试品的色谱图；其中图a为苦杏仁苷对照品色谱图，图b为供试品色谱图。
流动相四：水：甲醇：乙腈(75:20:5)0-15-30-35min，甲醇由20-20-80-20，流速为0.7ml/min。
结果见图16，为本发明所述的使用不同的流动相制备的苦杏仁对照品和供试品的色谱图；其中图a为苦杏仁苷对照品色谱图，图b为供试品色谱图。
流动相五：水：甲醇：乙腈(75:20:5)0-15-20-35min，甲醇由20-20-100-20，流速为0.7ml/min。
结果见图17，为本发明所述的使用不同的流动相制备的苦杏仁对照品和供试品的色谱图；其中图a为苦杏仁苷对照品色谱图，图b为供试品色谱图。
结论：采用流动相系统五，图谱上各主要色谱法分离效果较好，保留时间适中，分离度符合要求，故选择此流动相梯度洗脱。由于供试品药味较多，成分复杂，直接采用水：甲醇：乙腈(75:20:5)等度洗脱，有很多成分吸附在色谱柱上洗脱不下来，导致连续多次进样后，样品重现性及分离效果不好，为了保护色谱柱，延长其使用寿命，节约成本，同时保证样品的重现性，在每次走完一个样品后(15min)，采用梯度洗脱甲醇：6.25％乙腈溶液(其中水和乙腈预先按照75:5比例混合)在运行时间0-15-20-35min，甲醇比例由20％-20％-100％-20％，对色谱柱进行清洗。
2.6 不同色谱柱考察：
(1)Hyper Clone C18(250×4.6，5um)。
图18为本发明所述的使用Hyper Clone C18(250×4.6，5um)色谱柱的苦杏仁对照品和供试品的色谱图；其中图a为苦杏仁苷对照品色谱图，图b为供试品色谱图。
(2)Diamonsil C18(250×4.6，5um)。
图19为本发明所述的使用Diamonsil C18(250×4.6，5um)色谱柱的苦杏仁对照品和供试品的色谱图；
其中图a为苦杏仁苷对照品色谱图，图b为供试品色谱图；
(3)Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18(250×4.6，5um)。
图20为本发明所述的使用Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18(250×4.6，5um)色谱柱的苦杏仁对照品和供试品的色谱图；
其中图a为苦杏仁苷对照品色谱图，图b为供试品色谱图。
结论：实验考察了三种品牌色谱柱分离效果，结果Diamonsil C18分离效果最好。
2.7 不同进样量考察：
图21为本发明所述的使用不同的进样量的色谱图；
其中图a进样量为5μl，图b进样量为10μl，图c进样量为20μl；结论：实验考察不同进样量色谱分离效果，结果显示不同进样量对分离效果有一定影响，故最终选用进样量10μl。
2.8 阴性样品干扰情况考察：
按照上述色谱条件，考察阴性对照品干扰情况，结果为图22，显示阴性对照品色谱图中无与苦杏仁苷对应的色谱峰，表明阴性无干扰。
2.9 运行时间考察：
结果见图23，运行1.5小时。
2.10 方法学考察
2.10.1 线性关系考察
标准曲线的制备：
精密吸取上述对照品溶液2、4、8、12、16、20μl，注入液相色谱仪，以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。见表3和图24。标准曲线：Y＝1220222.699X+7508.378081，R＝0.99999。
表3 苦杏仁苷的标准曲线
进样量(ug) 峰面积
0.2 248713
0.4 494781
0.8 988533
1.2 1472227
1.6 1960468
2.0 2445709
2.10.2 耐用性试验
2.10.2.1 供试品溶液稳定性考察
精密吸取供试品溶液10μl。照上述色谱条件分别于0、2、4、6、8、10小时进样，结果见表4。
表4 供试品溶液稳定性考察结果
时间(小时) 峰面积 平均峰面积 RSD(％)
0 1165277
2 1165966
4 1160803 1164826 0.24
6 1164282
8 1168381
10 1164244
结果显示RSD值为0.24％，说明供试品溶液在10小时内，苦杏仁苷含量稳定。
2.10.2.2 仪器精密度考察
精密吸取供试品溶液10μl，照上述色谱条件重复进样6次，结果见表5。
表5 仪器精密度考察结果
次数 峰面积 平均峰面积 RSD(％)
1 1176041
2 1159405
3 1159041 1163002 0.61
4 1156198
5 1161778
6 1165547
结果显示RSD值为0.61％，说明仪器整个系统精密度良好。
2.10.3 精密度试验
2.10.3.1 重复性试验
同一分析人员在较短时间间隔内，精密称取装量差异项下的供试品6份，照正文方法操作，独立测定6次，结果见表6。
表6 重复性试验结果
结果显示RSD＝0.22％，表明该测定方法重复性良好。
2.10.3.2 中间精密度试验
同一实验室，不同时间，不同分析人员，不同设备，每次精密称取装量差异项下的供试品6份，照正文方法操作，独立测定6次，结果见表7。
表7 中间精密度试验结果
2.10.3.3 重现性试验：
不同实验室，不同分析人员，不同设备，三批供试品，照正文方法操作，结果见表8。
表8 重现性试验结果
结果显示RSD＝5.42％，表明该测定方法重现性良好。
2.10.4 准确度试验----回收率试验
精密称取装量差异项下的供试品6份，每份分别加入对照品溶液7ml(0.1mg/ml)，再加50％甲醇3ml，称定重量，超声提取10min，称定重量，补足减失重量，过滤，滤液过0.45μm滤膜，取10μl注入液相色谱仪，测定。
表9 回收率试验结果
结果显示RSD＝0.59％，表明该方法回收率良好。
2.11 三批样品测定
采用正文方法处理样品，进行测定，结果见表10和图25-28。
其中图25为本发明所述的苦杏仁苷的对照品色谱图；
图26为本发明所述的苦杏仁苷颗粒(批号151101)的色谱图；
图27为本发明所述的苦杏仁苷颗粒(批号151102)的色谱图。
图28为本发明所述的苦杏仁苷颗粒(批号151103)的色谱图。
表10 三批样品含量测定结果
清咳平喘颗粒每袋含苦杏仁以苦杏仁苷(C20H27NO11)计，不得少于25mg。

Claims (27)

1.一种清咳平喘颗粒的检测方法，所述清咳平喘颗粒的原料药包含鱼腥草和苦杏仁，其特征在于，所述方法包括通过薄层色谱法检测所述清咳平喘颗粒中的鱼腥草；和
通过高效液相色谱法检测所述清咳平喘颗粒中的苦杏仁并测定苦杏仁苷的含量；
其中，所述薄层色谱法使用的展开剂为乙醚-氯仿-醋酸乙酯，其体积比为1～5：4～8：0.1～3；
其中，所述HPLC的色谱的流动相A为6.25％乙腈水溶液，流动相B为甲醇；
所述HPLC的梯度洗脱条件如下，其中流动相比例均为体积百分比:
0～15min，流动相A为80％，流动相B为20％；
15～20min，流动相A为80～0％，流动相B为20～100％；
20～35min，流动相A为0～80％，流动相B为100～20％；
理论板数按苦杏仁苷峰计算不低于4500。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述薄层色谱法使用的展开剂为乙醚-氯仿-醋酸乙酯，其体积比为3：6：1。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述通过薄层色谱法检测所述清咳平喘颗粒中的鱼腥草是通过包含以下步骤的方法实现的：
(1)取清咳平喘颗粒，研细，加水，超声离心后滤过，然后在滤液中加氢氧化钠试液，再加乙酸乙酯提取2次，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加乙酸乙酯溶解，作为供试品溶液；
(2)将步骤(1)得到的供试品溶液点样于硅胶薄层板，以乙醚-氯仿-醋酸乙酯为展开剂展开进行鉴别，所述展开剂的体积比为1～5：4～8：0.1～3。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，在步骤(2)中，所述展开剂的体积比为3：6：1。
5.根据权利要求3所述的方法，其中所述步骤(1)中还包括取鱼腥草对照药材，研细，加水，超声离心后滤过，然后在滤液中加氢氧化钠试液，再加乙酸乙酯提取2次，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加乙酸乙酯溶解，作为鱼腥草对照品溶液；
步骤(2)中还包括将鱼腥草对照药材溶液点样于硅胶薄层板，以乙醚-氯仿-醋酸乙酯为展开剂展开，所述展开剂的体积比为1～5：4～8：0.1～3。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，在步骤(2)中，所述展开剂的体积比为3：6：1。
7.根据权利要求5所述的方法，其中，所述步骤(1)中还包括按清咳平喘颗粒的处方比例及制备工艺，配制不含鱼腥草的阴性样品，并按所述鱼腥草供试品溶液的配制方法制成鱼腥草阴性样品溶液；
步骤(2)中还包括将鱼腥草阴性样品溶液点样于硅胶薄层板，以乙醚-氯仿-醋酸乙酯为展开剂展开，所述展开剂的体积比为1～5：4～8：0.1～3。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，在步骤(2)中，所述展开剂的体积比为3：6：1。
9.根据权利要求3所述的方法，其中，所述步骤(1)为：取清咳平喘颗粒5～20g，研细，加水15～40ml，超声10～30min，1000～3000r/min离心5～20min，滤过，滤液加氢氧化钠试液1～3ml，再加乙酸乙酯提取2次，每次10～30ml，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加乙酸乙酯1～3ml使溶解，作为供试品溶液；取鱼腥草对照药材0.5～2g，研细，加水15～40ml，超声10～30min，1000～3000r/min离心5～20min，滤过，滤液加氢氧化钠试液1～3ml，再加乙酸乙酯提取2次，每次10～30ml，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加乙酸乙酯1～3ml使溶解，作为鱼腥草对照药材溶液；按清咳平喘颗粒的处方比例及制备工艺，配制不含鱼腥草的阴性样品，并按所述鱼腥草供试品溶液的配制方法制成鱼腥草阴性样品溶液。
10.根据权利要求3所述的方法，其中，所述步骤(1)为：取清咳平喘颗粒10g，研细，加水25ml，超声20min，3000r/min离心10min，滤过，滤液加氢氧化钠试液2ml，再加乙酸乙酯提取2次，每次20ml，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加乙酸乙酯1ml使溶解，作为供试品溶液；取鱼腥草对照药材1g，研细，加水25ml，超声20min，3000r/min离心10min，滤过，滤液加氢氧化钠试液2ml，再加乙酸乙酯提取2次，每次20ml，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加乙酸乙酯1ml使溶解，作为鱼腥草对照药材溶液；按清咳平喘颗粒的处方比例及制备工艺，配制不含鱼腥草的阴性样品，并按所述鱼腥草供试品溶液的配制方法制成鱼腥草阴性样品溶液。
11.根据权利要求3所述的方法，其中，所述步骤(2)为：吸取步骤(1)中制得的样品溶液，将其分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙醚-氯仿-醋酸乙酯为展开剂，将薄层板置于展开缸中饱和，展开，取出，晾干，紫外光灯下检视，所述展开剂的体积比为1～5：4～8：0.1～3。
12.根据权利要求11所述的方法，其中，在步骤(2)中，所述展开剂的体积比为3：6：1。
13.根据权利要求11所述的方法，其中，所述步骤(2)中，所述吸取的样品溶液均为5～20μL；所述薄层板置展开缸中饱和0～40分钟，展开，晾干，于365nm紫外光灯下检视。
14.根据权利要求13所述的方法，其中，所述步骤(2)中，所述吸取的样品溶液均为5μL。
15.根据权利要求13所述的方法，其中，所述步骤(2)中，所述薄层板置展开缸中饱和20分钟，展开，晾干，于365nm紫外光灯下检视。
16.根据权利要求1所述的方法，其中，通过高效液相色谱法检测所述清咳平喘颗粒中的苦杏仁并测定苦杏仁苷的含量是通过包含以下步骤的方法实现的：
(a)制备供试品溶液；
(b)制备对照品溶液；
(c)使用HPLC法测定，记录色谱图并计算苦杏仁苷的含量。
17.根据权利要求16所述的方法，其中，所述步骤(a)为：称取供试品0.2～0.5g，加入6～12ml 50％甲醇，称定重量，超声5～10分钟，称定重量，加50％甲醇补足减失重量，滤过，即可。
18.根据权利要求17所述的方法，其中，所述步骤(a)为：精密称取供试品0.3g，加入10ml 50％甲醇，称定重量，超声10分钟，称定重量，加50％甲醇补足减失重量，过滤，然后将滤液过0.45μm滤膜，即可。
19.根据权利要求16所述的方法，其中，所述步骤(b)为：取苦杏仁苷对照品10mg，精密称定，置100ml容量瓶中，用50％甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
20.根据权利要求16所述的方法，其中，所述步骤(c)中：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；
检测波长210nm；
进样量：5～20μL；
流速：0.5-0.9mL/min；
柱温为35～42℃。
21.根据权利要求20所述的方法，其中，所述步骤(c)中进样量为10μL。
22.根据权利要求20所述的方法，其中，所述步骤(c)中流速为0.7mL/min。
23.根据权利要求20所述的方法，其中，所述步骤(c)中柱温为40℃。
24.根据权利要求16所述的方法，其中，通过高效液相色谱法检测所述清咳平喘颗粒中的苦杏仁并测定苦杏仁苷的含量是通过包含以下步骤的方法实现的：
(a)制备供试品溶液：精密称取装量差异项下的供试品0.3g，加入10ml50％甲醇，称定重量，超声10分钟，称定重量，加50％甲醇补足减失重量，滤过后，滤液过0.45μm滤膜，得到所述供试品溶液；
(b)制备对照品溶液：取苦杏仁苷对照品10mg，精密称定，置100ml容量瓶中，用50％甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得；
(c)使用HPLC法测定，记录色谱图并计算苦杏仁苷的含量：
所述HPLC的色谱条件如下：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；
检测波长210nm；
进样量：10μL；
流速：0.7mL/min；
柱温为40℃。
25.根据权利要求1-24中任一项所述的方法，其中，所述清咳平喘颗粒的原料药组成为石膏、金荞麦、鱼腥草、麻黄(蜜炙)、炒苦杏仁、川贝母、矮地茶、枇杷叶、紫苏子(炒)、炙甘草。
26.根据权利要求25所述的方法，其中，所述清咳平喘颗粒的原料药组成按重量比计为：
27.根据权利要求25所述的方法，其中，所述清咳平喘颗粒的制备方法为：取原料药，川贝母粉碎成粗粉，照流浸膏剂与浸膏剂渗漉法，用70％的乙醇做溶剂、浸渍48小时后进行渗漉，收集漉液约1000ml，回收乙醇至无醇味，备用；鱼腥草用水蒸气蒸馏3小时，收集蒸馏液，分取挥发油与药液，另器保存；石膏加水煎煮半小时，加入浸泡1小时的麻黄(蜜炙)、金荞麦、炒苦杏仁、矮地茶、枇杷叶、紫苏子(炒)、炙甘草七味及川贝母、鱼腥草药渣，加水煎煮三次，每次2小时，合并煎液，滤过，滤液与鱼腥草药液合并，浓缩至相对密度为50℃下，1.30～1.35的清膏，加入上述川贝母浸膏，混匀，干燥，粉碎，加入蔗糖330g，糊精适量、拌匀，制成颗粒，干燥，喷入上述鱼腥草挥发油、按药剂学常规方法，加入常规辅料，制成颗粒剂。
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