CN112255325A - 乳制品中残留兽药含量的检测方法 - Google Patents

乳制品中残留兽药含量的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于食品检测领域，公开了一种乳制品中残留兽药含量的检测方法，先用乙腈萃取乳制品中的残留兽药，再经活化后的固相萃取柱吸附，所得流出液经蒸干、乙腈溶解、过滤、测定即可。本发明通过使用活化后的固相萃取柱吸附去除乳制品中的强疏水性干扰物及杂质，获得目标物残留兽药，方法操作简便、高效、对残留兽药回收率高，解决了检测乳制品中残留兽药所需前处理过程繁琐的问题。本发明适合检测乳制品中残留兽药的含量。

Description

乳制品中残留兽药含量的检测方法
技术领域
本发明属于食品检测领域，涉及乳制品检测，具体地说是一种乳制品中残留兽药含量的检测方法。
背景技术
随居民生活水平提高，人们对食品安全也更加关注，尤其在乳制品消费时更加小心。而牛奶中的残留兽药主要来自于奶牛疾病的预防和治疗过程中所使用的药物。为保障乳制品质量安全，国家不断增加牛奶中兽药残留检测种类，如：GB 31650和250公告的发布与实施，相应的检测技术和要求也不断提高。
目前，采用液相色谱检测方法对残留兽药进行分析，但液相色谱检测方法存在前处理操作复杂，消耗有机溶剂多，检测时间长，上机杂质干扰多，回收率低，灵敏度低等问题。且生乳样品基质复杂，所检测的物质为国家禁用或有限量值，样品含量很低，液相色谱检测方法检出限高，灵敏度低，无法满足痕量检测，当前处理操作不到位时，还会污染仪器。
发明内容
本发明的目的，是要提供一种乳制品中残留兽药含量的检测方法，以解决检测乳制品中残留兽药所需的前处理过程繁琐的问题。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种乳制品中残留兽药含量的检测方法，包括依次进行的以下步骤：
1)取待测乳制品加入乙腈，经振荡提取、离心分层，得待净化液；
2)待净化液移至分别用乙腈和氨水活化后的Oasis MAX固相萃取柱，再用含甲酸的乙腈溶液进行洗脱，所收集的流出液经蒸干、乙腈溶解(加入乙腈后经涡旋溶解)、过滤，得待测液；
3)待测液上样于高效液相色谱-串联质谱仪测定，得测定结果。
作为一种限定，所述残留兽药为三氯苯达唑、硝碘酚腈、碘醚柳胺、氯氰碘柳胺、水杨酸钠和托曲珠利；
所述检测方法可以用于测定所述残留兽药中的任一种或几种；
其中，
三氯苯达唑的线性回归方程是Y＝68101.5X-7364.99，R2＝0.997051；
硝碘酚腈的线性回归方程是Y＝3197.98X-372.555，R2＝0.995707；
碘醚柳胺的线性回归方程是Y＝5810.77X-408.196，R2＝0.996118；
氯氰碘柳胺的线性回归方程是Y＝4564.52X-212.032，R2＝0.997202；
水杨酸钠的线性回归方程是Y＝4597.82X-115.005，R2＝0.992213；
托曲珠利的线性回归方程是Y＝6719.78X-156.499，R2＝0.996632。
作为另一种限定，步骤1)中，离心分层后，所得上清液中还需加入氨水，制得待净化液；
步骤2)中，用含甲酸的乙腈溶液洗脱前，还需分别使用甲醇和水分别淋洗装有待净化液的Oasis MAX固相萃取柱。
作为进一步限定，步骤1)中，待测乳制品与氨水的重量体积比为1g：1～2mL；
步骤2)中，淋洗所用的甲醇和水的量均为2～5mL；
步骤1)和步骤2)中，氨水的浓度均为5～10％。
作为第三种限定，步骤1)中，待测乳制品与乙腈的重量体积比为1g：3～5mL；
步骤2)中，活化Oasis MAX固相萃取柱所用的乙腈和氨水的量均为2～4mL；
含甲酸的乙腈溶液的用量为2～5mL；
含甲酸的乙腈溶液中甲酸的浓度为4～6％；
洗脱所用的含甲酸的乙腈溶液的量为2～5mL。
作为第四种限定，步骤2)中，所述蒸干是采用氮气浓缩蒸发至干；
所述乙腈溶解，是加入乙腈定容后，进行涡旋溶解；
所述过滤是采用微孔滤膜过滤。
作为进一步限定，蒸干的温度为40～55℃；微孔滤膜的孔径为0.45μm或0.22μm。
作为第五种限定，步骤1)中，振荡提取的时间为5～10min；离心的转速为5000～10000r/min、时间为5～10min、温度为0～25℃。
作为第六种限定，高效液相色谱-串联质谱仪的测定条件为：
①高效液相色谱条件：色谱柱为Waters UPLC BEH C18亚乙基桥杂化颗粒色谱柱或Waters XBridge C18色谱柱，流速0.3mL/min，柱温30℃，进样体积5μL，洗脱为梯度洗脱；A相流动相为含0.1％甲酸的水溶液，B相流动相为乙腈；
②质谱条件为电离方式：离子源为电喷雾离子源，检测方式为多离子反应监测，毛细管电压为2.00kV，锥孔反吹气为150L/h，脱溶剂气温度为450℃、流量为900L/h。
作为进一步限定，所述梯度洗脱的运行时间共10min，其中，
0.00～6.00min时，使用70％的A相流动相和30％的B相流动相进行洗脱；
6.00～8.00min时，使用100％的B相流动相进行洗脱；
8.00～10.00min时，使用70％的A相流动相和30％的B相流动相进行洗脱。
由于采用了上述技术方案，本发明与现有技术相比，所取得的技术进步在于：
本发明通过乙腈萃取乳制品中兽药残留，再使用乙腈和氨水活化后的固相萃取柱进行吸附，能够有效去除乳制品中的强疏水性干扰物(如大量蛋白质、脂肪、有机酸等)和杂质，但不吸附目标物残留兽药(三氯苯达唑、硝碘酚腈、碘醚柳胺、氯氰碘柳胺、水杨酸钠和托曲珠利)。本方法能够萃取获得乳制品中的全部目标残留兽药，且本发明所采用高效液相色谱-串联质谱仪进行测定，目标残留兽药中的每一种兽药都能很好的测定出保留时间和保留峰值。本发明通过简单的方法去除乳制品中杂质获得含有残留兽药的目标物，再用高效液相色谱-串联质谱仪进行检测。本发明净化试样纯度高，测试结果杂峰少，减少了对仪器的污染。本发明操作简便、高效，标准曲线线性R2均大于0.996，对兽药残留回收率高，能够满足生乳中6种兽药残留的同时测定，为乳制品的安全监管提供有效的方法支撑。
本发明的检测方法适用于检测生乳中残留兽药的含量。
附图说明
图1是本发明实施例1中兽药混合标准品标准液中碘醚柳胺的MRM色谱图；
图2是本发明实施例1中兽药混合标准品标准液中氯氰碘柳胺的MRM色谱图；
图3是本发明实施例1中兽药混合标准品标准液中水杨酸钠的MRM色谱图；
图4是本发明实施例1中兽药混合标准品标准液中托曲珠利的MRM色谱图；
图5是本发明实施例1中兽药混合标准品标准液中硝碘酚腈的MRM色谱图；
图6是本发明实施例1中兽药混合标准品标准液中三氯苯达唑的MRM色谱图；
图7是本发明实施例1中碘醚柳胺的标准曲线；
图8是本发明实施例1中氯氰碘柳胺的标准曲线；
图9是本发明实施例1中水杨酸钠的标准曲线；
图10是本发明实施例1中托曲珠利的标准曲线；
图11是本发明实施例1中硝碘酚腈的标准曲线；
图12是本发明实施例1中三氯苯达唑的标准曲线。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明做进一步详细说明，应当理解所描述的实施例仅用于解释本发明，并不限定本发明。
下述实施例中所有的试剂如无特殊说明均为现有市售试剂，试验方法无特殊说明均采用现有的试验方法。
兽药混合标准品：纯度≥95.0％，品牌：Sigma，兽药混合标准品组分为三氯苯达唑、硝碘酚腈、碘醚柳胺、氯氰碘柳胺、水杨酸钠和托曲珠利，各组分分别配制为100μg/mL。
高效液相色谱—串联质谱仪，配有电喷雾离子源(xevo TQ-XS，Waters)；
Oasis MAX固相萃取柱(Waters)；
N-EVAP 116氮吹仪(美国Organomation公司)。
实施例1一种乳制品中残留兽药含量的检测方法
一)兽药混合标准品的检测
分别取1mg兽药混合标准品置于10mL容量瓶中，加入甲醇定容至刻度，即得兽药标准品储备液(浓度为100μg/mL)；分别移取10μL兽药标准储备液置于10mL容量瓶中，加入甲醇定容至刻度，即得混合兽药标准中间液(浓度为100ng/mL)。
分别移取0μL、2.5μL、5μL、10μL、25μL、50μL、100μL混合兽药标准中间液，用空白基质溶液配制成浓度系列分别为0.0ng/mL、0.5ng/mL、1.0ng/mL、2.0ng/mL、5.0ng/mL、10.0ng/mL、20.0ng/mL的基质混合标准系列工作液，临用前现配。
将6种兽药混合物标准品标准液分别上样于高效液相色谱-串联质谱仪测定，得到不同兽药混合物标准品标准液对应的谱图及保留时间，兽药标准品标准液中含有的不同兽药组分对应的色谱图及保留时间，参见图1～图6；
测定条件为：
高效液相色谱条件：色谱柱为Waters UPLC BEH C18亚乙基桥杂化颗粒色谱柱(也可用Waters XBridge C18色谱柱代替)，50mm×2.1mm，粒径为1.7μm；
流速为0.3mL/min；
柱温为30℃；
进样体积为5μL；
运行时间共10min。
A相流动相为含0.1％甲酸的水溶液，B相流动相为乙腈，梯度洗脱程序见表1；
表1流动相及梯度洗脱程序
时间(min) A相占流动相的体积百分比(％) B相占流动相的体积百分比(％)
0.00 70.0 30.0
6.00 0.0 100.0
8.00 70.0 30.0
10.0 70.0 30.0
质谱条件：离子源为电喷雾离子源(ESI)；
检测方式为多离子反应监测(MRM)，毛细管电压为2.00kV，锥孔反吹气为150L/h，脱溶剂气温度为450℃、流量为900L/h。不同兽药对应的离子选择参数见表2：
表2不同兽药对应的离子选择参数一览表
Figure BDA0002672977580000061
Figure BDA0002672977580000071
测定结果：
(1)定性测定
按照上述条件测定待测液和兽药混合标准品标准液，待测液中不同兽药的色谱峰保留时间与兽药混合标准品标准液中对应的兽药的保留时间应一致，允许偏差小于±2.0％；在扣除背景后的待测液色谱图中，各兽药定性离子的相对丰度与浓度接近的同样条件下得到的兽药混合标准品标准液中对应兽药的色谱图，最大允许相对偏差不超过表2中规定的范围，则可判断待测液中存在对应的相应的兽药，如果不能确证，应重新进样，以扫描方式(有足够灵敏度)、采用增加其他确证离子的方式或用其他灵敏度更高的分析仪器来确证。
表3定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差
Figure BDA0002672977580000072
根据测定待测液中兽药的含量，选定含有相近浓度的相应兽药的兽药混合标准品标准液进行高效液相色谱-串联质谱仪测定、分析。待测液中的兽药和兽药混合标准品标准液中相应兽药的响应值在仪器检测的线性范围内。对兽药混合标准品标准液及待测液等体积进样测定。待测液测定的兽药色谱图与兽药混合标准品标准液测定的相应兽药色谱图的保留时间一致，丰度几乎一致，则证明待测液中含有相应的兽药。
兽药混合物标准品标准液中各兽药的保留时间如下：三氯苯达唑保留时间为3.21min，硝碘酚腈保留时间为1.80min，碘醚柳胺保留时间为5.76min，氯氰碘柳胺保留时间为5.31min，水杨酸钠保留时间为1.06min，托曲珠利保留时间为2.69min。
(2)定量测定
实验采用外标法单离子定量测定，为减少基质的影响，定量用标准应采用空白待测液(乙腈)配制兽药混合标准品标准溶液。取6种兽药混合物标准品标准液进行高效液相色谱-串联质谱仪测定、分析。兽药混合标准品标准液中的任一兽药的响应值均应在仪器检测的线性范围内，以兽药混合标准品标准液中任一兽药的峰面积为纵坐标，相应兽药的浓度为横坐标，绘制标准工作曲线，参见图7～12，得到线性回归方程，具体见下表：
表4残留兽药各组分线性回归方程一览表
兽药组分 回归方程 相关系数R<sup>2</sup>
三氯苯达唑 Y＝68101.5X-7364.99 0.997051
硝碘酚腈 Y＝3197.98X-372.555 0.995707
碘醚柳胺 Y＝5810.77X-408.196 0.996118
氯氰碘柳胺 Y＝4564.52X-212.032 0.997207
水杨酸钠 Y＝4597.82X-115.005 0.992213
托曲珠利 Y＝6719.78X-156.499 0.996632
二)乳制品中残留兽药含量的检测
本实施例为一种乳制品中残留兽药含量的检测方法，因三氯苯达唑、硝碘酚腈、碘醚柳胺、氯氰碘柳胺、水杨酸钠和托曲珠利6种兽药为泌乳期禁用或有限量值要求，未找到含有6种兽药的阳性样本，本实施例采用加标的方式，制备得到阳性样本，本实施包括依次进行的以下步骤：
1)取1g生牛乳加至离心管中，加入20μL浓度为100ng/mL的兽药混合物标准中间液(2μg/kg)，置于振荡器中剧烈振荡5min，充分混匀，制得阳性样本(标记为M1)；
取1g待测液(M1)置于50mL离心管中，再量取5mL含乙腈加至离心管中，然后将离心管置于振荡器中剧烈振荡10min，对乳制品中的残留兽药进行萃取，再将离心管移至离心机中，4℃温度下10000r/min离心5min，分层所得上清液中加入1mL氨水，经涡旋混匀，得待净化液。
按上述步骤进行操作，可以打破乳制品在含水时形成的水包油结构，从而使乳制品中含有的残留兽药从水包油结构的包裹中裸露出来，溶解到乙腈中，加入1mL氨水营造碱性环境，有助于Oasis MAX固相萃取柱更好锁住目标物。
2)取3mL乙腈和3mL氨水对Oasis MAX固相萃取柱进行活化。
移取待净化液至活化后的Oasis MAX固相萃取柱中，分别使用3mL水和3mL甲醇进行淋洗，弃去全部流出液，再用4mL含5％甲酸的乙腈溶液进行洗脱，所收集的流出液放入氮吹仪中，45℃氮气浓缩蒸发至干，再加入乙腈定容至1.0mL，经涡旋至完全溶解，然后经0.22μm的有机微孔滤膜过滤，得待测液。
选用活化后的Oasis MAX固相萃取柱针对性去除乳制品中的强疏水性干扰物(如大量蛋白质、脂肪、有机酸等)，但不吸附残留兽药，从而通过简单的方法去除乳制品中杂质，减少目标物(残留兽药)的损失；通过采用氮吹浓缩蒸发避免了有毒气体挥发进入人体损害健康。
进一步地，采用有机微孔滤膜过滤去除有机溶液中的细小颗粒物质，对色谱柱和仪器起到保护作用。
3)将待测液上样于色谱柱为Waters UPLC BEH C18亚乙基桥杂化颗粒色谱柱的高效液相色谱-串联质谱仪测定，得到待测液的测定结果。测定条件与兽药标准品标准液的测定条件完全相同。
本实施例测定结果如下：
(1)定性测定
本次试验测定结果，待测液中各兽药的保留时间如下：三氯苯达唑保留时间为3.21min，硝碘酚腈保留时间为1.80min，碘醚柳胺保留时间为5.76min，氯氰碘柳胺保留时间为5.31min，水杨酸钠保留时间为1.06min，托曲珠利保留时间为2.69min，兽药所选择的离子均出现，而且所选择的离子丰度比与兽药混合标准品中相应兽药的离子丰度比在最大允许偏差范围内。因此，证明本次测试的乳制品中含有的残留兽药包括三氯苯达唑、硝碘酚腈、碘醚柳胺、氯氰碘柳胺、水杨酸钠和托曲珠利。
(2)定量测定
待测液中兽药各组分的响应值均应在仪器检测的线性范围内，将待测液测定的兽药各组分的峰面积代入相应兽药的线性回归方程，计算得待测液中兽药各组分的含量，具体见下表：
表5乳制品中残留兽药各组分含量一览表
残留兽药组分 测定结果(μg/kg)
三氯苯达唑 1.89
硝碘酚腈 1.96
碘醚柳胺 2.01
氯氰碘柳胺 1.82
水杨酸钠 2.05
托曲珠利 1.97
本实施例的检测方法适用于检测乳制品中残留兽药的含量。
实施例2～5乳制品中残留兽药含量的检测方法
实施例2～5分别为一种乳制品中残留兽药含量的检测方法，它们的步骤与实施例1基本相同，不同之处仅在于工艺参数的不同，具体详见表6：
表6实施例2～5各项参数一览表
Figure BDA0002672977580000111
Figure BDA0002672977580000121
/代表无需加标。
实施例2～5的测定结果如下：
实施例2的测定结果：
(1)定性测定结果：
实施例2中，待测液中各兽药的保留时间如下：三氯苯达唑保留时间为3.21min，硝碘酚腈保留时间为1.80min，碘醚柳胺保留时间为5.76min，氯氰碘柳胺保留时间为5.31min，水杨酸钠保留时间为1.06min，托曲珠利保留时间为2.69min。因此，证明本次测试的乳制品中含有的残留兽药包括三氯苯达唑、硝碘酚腈、碘醚柳胺、氯氰碘柳胺、水杨酸钠和托曲珠利。
(2)定量测定结果：
将实施例2中待测液测定的兽药各组分的峰面积代入线性回归方程，计算得待测液中兽药各组分的含量，具体见下表：
表7实施例2的乳制品中残留兽药各组分含量一览表
残留兽药组分 测定结果(μg/kg)
三氯苯达唑 3.89
硝碘酚腈 3.92
碘醚柳胺 3.78
氯氰碘柳胺 4.02
水杨酸钠 3.96
托曲珠利 3.72
实施例3的测定结果：
(1)定性测定结果：
实施例2中，待测液中各兽药的保留时间如下：三氯苯达唑保留时间为3.21min，硝碘酚腈保留时间为1.80min，碘醚柳胺保留时间为5.76min，氯氰碘柳胺保留时间为5.31min，水杨酸钠保留时间为1.06min，托曲珠利保留时间为2.69min。因此，证明本次测试的乳制品中含有的残留兽药包括三氯苯达唑、硝碘酚腈、碘醚柳胺、氯氰碘柳胺、水杨酸钠和托曲珠利。
(2)定量测定结果：
将实施例3中待测液测定的兽药各组分的峰面积代入线性回归方程，计算得待测液中兽药各组分的含量，具体见下表：
表8实施例3的乳制品中残留兽药各组分含量一览表
残留兽药组分 测定结果(μg/kg)
三氯苯达唑 8.08
硝碘酚腈 7.98
碘醚柳胺 8.01
氯氰碘柳胺 7.82
水杨酸钠 7.34
托曲珠利 7.27
实施例4的测定结果：
实施例4中，待测液中未检测出三氯苯达唑、硝碘酚腈、碘醚柳胺、氯氰碘柳胺、水杨酸钠和托曲珠利六种残留兽药中的任意一种。
实施例5的测定结果：
实施例4中，待测液中未检测出三氯苯达唑、硝碘酚腈、碘醚柳胺、氯氰碘柳胺、水杨酸钠和托曲珠利六种残留兽药中的任意一种。
实施例2～5其它部分的内容，与实施例1相同。
需要注意，实施例1～5，仅是本发明的较佳实施例，并非是对本发明所作的其他形式的限定，任何熟悉本专业的技术人员都可能利用上述技术内容作为启示加以变更或改型为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明权利要求的技术实质，对以上实施例所作出的简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明权利要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种乳制品中残留兽药含量的检测方法，其特征在于，该检测方法包括依次进行的以下步骤：
1）取待测乳制品加入乙腈，经振荡提取、离心分层，得待净化液；
2）待净化液移至分别用乙腈和氨水活化后的固相萃取柱，再用含甲酸的乙腈溶液进行洗脱，所收集的流出液经蒸干、乙腈溶解、过滤，得待测液；
3）待测液上样于高效液相色谱-串联质谱仪测定，得测定结果。
2.根据权利要求1所述的乳制品中残留兽药含量的检测方法，其特征在于，所述残留兽药为三氯苯达唑、硝碘酚腈、碘醚柳胺、氯氰碘柳胺、水杨酸钠和托曲珠利，其中，
三氯苯达唑的线性回归方程是Y=68101.5X-7364.99，R2=0.997051；
硝碘酚腈的线性回归方程是Y=3197.98X-372.555，R2=0.995707；
碘醚柳胺的线性回归方程是Y=5810.77X-408.196，R2=0.996118；
氯氰碘柳胺的线性回归方程是Y=4564.52X-212.032，R2=0.997202；
水杨酸钠的线性回归方程是Y=4597.82X-115.005，R2=0.992213；
托曲珠利的线性回归方程是Y=6719.78X-156.499，R2=0.996632。
3.根据权利要求1或2所述的乳制品中残留兽药含量的检测方法，其特征在于，
步骤1）中，离心分层后，所得上清液中还需加入氨水，制得待净化液；
步骤2）中，用含甲酸的乙腈溶液洗脱前，还需分别使用甲醇和水分别淋洗装有待净化液的固相萃取柱。
4.根据权利要求3所述的乳制品中残留兽药含量的检测方法，其特征在于，
步骤1）中，待测乳制品与氨水的重量体积比为1g：1~2mL；
步骤2）中，淋洗所用的甲醇和水的量均为2~5mL；
步骤1）和步骤2）中，氨水的浓度均为5~10%。
5.根据权利要求1或2所述的乳制品中残留兽药含量的检测方法，其特征在于，
步骤1）中，待测乳制品与乙腈的重量体积比为1g：3~5mL；
步骤2）中，活化固相萃取柱所用的乙腈和氨水的量均为2~4mL；
含甲酸的乙腈溶液的用量为2~5mL；
含甲酸的乙腈溶液中甲酸的浓度为4~6%。
6.根据权利要求1或2所述的乳制品中残留兽药含量的检测方法，其特征在于，
步骤2）中，所述蒸干是采用氮气浓缩蒸发至干；
所述乙腈溶解，是加入乙腈定容后溶解；
所述过滤是采用微孔滤膜过滤。
7.根据权利要求6所述的乳制品中残留兽药含量的检测方法，其特征在于，蒸干的温度为35~45℃；微孔滤膜的孔径为有机系滤膜0.45 μm或0.22 μm。
8.根据权利要求1或2所述的乳制品中残留兽药含量的检测方法，其特征在于，步骤1）中，振荡提取的时间为5~10min；离心的转速为5000~10000r/min、时间为5~10min、温度为0~25℃。
9.根据权利要求1或2所述的乳制品中残留兽药含量的检测方法，其特征在于，高效液相色谱-串联质谱仪的测定条件为：
①高效液相色谱条件：色谱柱为Waters UPLC BEH C18亚乙基桥杂化颗粒色谱柱或Waters XBridge C18色谱柱，流速0.3 mL/min，柱温30℃，进样体积5μL；A相流动相为含0.1%甲酸的水溶液，B相流动相为乙腈，洗脱方式为梯度洗脱；
②质谱条件为电离方式：离子源为电喷雾离子源，检测方式为多离子反应监测，毛细管电压为2.00 kV，锥孔反吹气为150 L/h，脱溶剂气温度为450℃、流量为900 L/h。
10.根据权利要求9所述的乳制品中残留兽药含量的检测方法，其特征在于，所述梯度洗脱的运行时间共10min，其中，
0.00~6.00min时，使用70%的A相流动相和30%的B相流动相进行洗脱；
6.00~8.00min时，使用100%的B相流动相进行洗脱；
8.00~10.00min时，使用70%的A相流动相和30%的B相流动相进行洗脱。
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