CN114324629A - 一种蜂蜜中总苦参碱残留量的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种蜂蜜中总苦参碱残留量的检测方法，包括以下步骤：样品前处理、样品的提纯、样品的净化和基质校准溶液制备与检测；本发明采用氨水碱化样品，使得样品能够得到很好的净化，而且样品浓缩时间短，方法简便、快速；本检测方法能够很好的满足蜂蜜中总苦参碱(苦参碱+氧化苦参碱)残留量的日常质量监控的需求。
Description
[技术领域]
本发明属于分析化学技术领域，具体地说是一种蜂蜜中总苦参碱残留量的检测方法。
[背景技术]
苦参碱也叫苦参素、苦参杀虫剂等，英文通用名称matrine。其作为一种重要的生物农药，已成为国家政策优先支持的产品。它是由中草药植物苦参的根、茎叶、果实经乙醇等有机溶剂提取制成的，其成分主要是苦参碱、氧化苦参碱等多种生物碱。纯品为白色粉末，无致突变作用，无胚胎毒性，无致畸作用，有弱蓄积性。苦参碱属于广谱高效的植物杀虫剂，害虫接触药剂后可使神经中枢麻痹，蛋白质凝固堵塞气孔窒息而死；同时可与常用的化学合成农药复配，可表现出显著的增效作用，能够大大降低化学农药的使用量；对人畜低毒，具触杀和胃毒作用，对各种作物上的菜青虫、蚜虫、红蜘蛛等有明显防治效果，也可防治地下害虫。苦参碱属低毒植物源农药，对人体伤害较小，因此在我国无公害生态果蔬园大面积推广使用。但生物农药也存在毒副作用，研究表明高剂量的苦参碱对小鼠生殖细胞有损伤作用，能诱发精子畸变。苦参碱在蜂蜜中的滥用导致食品安全隐患，蜂蜜中苦参碱残留风险评估以及最大残留限量值(MRL)的制定势在必行。虽然在现行的GB2763《食品中农药最大残留限量》中仅对一些蔬菜、水果基质给出了苦参碱残留限量要求，尚未涉及蜂蜜，但依然要引起我们的重视。
苦参碱属于碱性水溶性化合物，具有比较强的碱性，在水中有良好的溶解性，溶于冷水、乙醇、乙醚、氯仿和苯，难溶于石油醚。常规的蜂蜜中农残检测方法显然不适用。而且很少有文献报道蜂蜜中的苦参碱残留量的检测方法，因此，如何建立一个快速准确检测蜂蜜中总苦参碱残留量的方法迫在眉睫。
[发明内容]
本发明的目的就是要提供一种快速检测蜂蜜中总苦参碱残留量的方法，不仅测定方法简便、快速，而且能够实现蜂蜜中总苦参碱含量的准确测定，满足蜂蜜中总苦参碱(苦参碱+氧化苦参碱)残留量的日常质量监控的需求。
为实现上述目的，本发明设计了一种快速检测蜂蜜中总苦参碱残留量的方法，包括以下步骤：
(1)样品前处理：称取蜂蜜样品2g置于50ml玻璃离心瓶中，于190℃条件下加热30min，加热结束后冷却至室温，向玻璃离心瓶中加入10ml总苦参碱提取液1TMT-E1，轻轻混匀至溶解蜂蜜样品，将溶解的混合溶液转入50ml塑料离心瓶中，再用1-5ml总苦参碱提取液1TMT-E1冲洗玻璃离心瓶壁，冲洗液合并至50ml塑料离心瓶中；
(2)样品的提纯：向步骤(1)中的塑料离心瓶中加入15mL总苦参碱提取液2TMT-E2，充分振荡提取1-2min，再加入10g无水硫酸钠，充分振荡提取1-2min，震荡结束后置于离心机中4500r.p.m转速下离心分离5分钟，待离心后静置分层吸出上层液体置于50ml鸡心瓶中，于40℃下旋转蒸发2-3min；
(3)样品的净化：向步骤(2)中的鸡心瓶中加入1.2mL溶解液，置于40Hz震动频率的超声机中边超声震荡边旋转鸡心瓶，超声震荡结束后，将所得的混合液用一次性吸管吸出置于事先放有100mgC18填料和100mg乙二胺-N-丙基硅烷PSA填料的10ml玻璃试管中，再将玻璃试管置于旋涡混合仪上旋涡混合2min脱色3-5次，脱色完成后置于离心机中4500r.p.m转速下离心分离2分钟，待离心后静置分层吸出上层液体置于试管中，待用；其中，溶解液的配比为：乙腈和甲苯的体积用量比为(1-6)：1；
(4)基质校准溶液制备与检测：取两份10mg/L苦参碱标准溶液，分别用蒸馏水稀释成200μg/L标准溶液和2000μg/L标准溶液，称取7份阴性山花蜂蜜，每份蜂蜜含量为2g，前4份中分别加入200μg/L标准溶液50μL、100μL、200μL、500μL，中间2份中分别加入2000μg/L标准溶液100μL、200μL，配制成5μg/kg、10μg/kg、20μg/kg、50μg/kg、100μg/kg和200μg/kg系列阴性基质标准溶液，最后一份不添加任何标准溶液，作为阴性质控，按上述(1)、(2)、(3)步骤制备阴性样品提取液，再根据处理过的蜂蜜样品中添加的苦参碱浓度为横坐标进行气相色谱-串联质谱分析，苦参碱峰面积作为纵坐标，用于绘制阴性基质标准曲线，得到的线性方程为：y＝1195.5x-1089.1，相关系数R2＝0.9989。
在步骤(2)中，其两次充分振荡提取过程中保持温度为20-30℃，防止结块。
在步骤(1)中，总苦参碱提取液1TMT-E1的配置为：量取分析纯28％氨水15mL，加水至1000mL即可。
在步骤(2)中，总苦参碱提取液2TMT-E2为：二氯甲烷或者三氯甲烷中的任何一种，分析纯。
在步骤(4)中，所述气相色谱-串联质谱仪的测定条件为：
1)气相色谱柱采用HP-5MS色谱柱，规格为柱长30m，柱内径0.25mm，粒径0.25μm或者性能相当的色谱柱；
2)柱N2流量：1.5ml/min；
3)升温程序见下表：
4)质谱仪参数：进样口温度270℃，辅助加热器280℃，EI源，轰击能量70eV，离子源温度280℃，溶剂延迟4min；
5)检测方式:多反应监测(dMRM)；247/150为推荐定量离子对。
由净化溶液中苦参碱的浓度换算到样品溶液中苦参碱的含量，根据基质标准溶液进行基质效应的校准，采用离子对定量，用于绘制阴性基质标准曲线，得到的线性方程为：y＝1195.5x-1089.1，相关系数R2＝0.9989。
本发明同现有技术相比，本发明采用氨水碱化蜂蜜，通过液液萃取将蜂蜜中的苦参碱提取到二氯甲烷中，而蜂蜜中的糖、色素、水分不被提取，使得样品能够得到很好的净化，而且样品浓缩时间短，仅需2-3分钟，方法简便、快速；本检测方法能够很好的满足蜂蜜中总苦参碱(苦参碱+氧化苦参碱)残留量的日常质量监控的需求，值得推广应用。
[附图说明]
图1是标准曲线图；
图2是使用气相色谱-串联质谱仪检测蜂蜜样品中苦参碱残留量所得的色谱图；
图3是使用气相色谱-串联质谱仪检测蜂蜜样品中苦参碱残留量所得的质谱图。
[具体实施方式]
本发明属于分析化学领域，具体地说是对蜂蜜中苦参碱含量的测定，其原理为：将样品中残留的苦参碱用氨水和二氯甲烷提取，提取液经固相萃取柱净化和乙腈-甲苯(5+1，V/V)稀释后，用气相色谱-质谱仪测定样品中苦参碱的含量。具体包括以下步骤：(1)样品前处理：称取蜂蜜样品2g置于50ml玻璃离心瓶中，于190℃条件下加热30min，加热结束后冷却至室温，向玻璃离心瓶中加入10ml总苦参碱提取液1TMT-E1，轻轻混匀至溶解蜂蜜样品，将溶解的混合溶液转入50ml塑料离心瓶中，再用1-5ml总苦参碱提取液1TMT-E1冲洗玻璃离心瓶壁，冲洗液合并至50ml塑料离心瓶中；
(2)样品的提纯：向步骤(1)中的塑料离心瓶中加入15mL总苦参碱提取液2TMT-E2，充分振荡提取1-2min，再加入10g无水硫酸钠，充分振荡提取1-2min，震荡结束后置于离心机中4500r.p.m转速下离心分离5分钟，待离心后静置分层吸出上层液体置于50ml鸡心瓶中，于40℃下旋转蒸发2-3min；
(3)样品的净化：向步骤(2)中的鸡心瓶中加入1.2mL溶解液，置于40Hz震动频率的超声机中边超声震荡边旋转鸡心瓶，超声震荡结束后，将所得的混合液用一次性吸管吸出置于事先放有100mgC18填料和100mg乙二胺-N-丙基硅烷PSA填料的10ml玻璃试管中，再将玻璃试管置于旋涡混合仪上旋涡混合2min脱色3-5次，脱色完成后置于离心机中4500r.p.m转速下离心分离2分钟，待离心后静置分层吸出上层液体置于试管中，待用；其中，溶解液的配比为：乙腈和甲苯的体积用量比为(1-6)：1；
(4)基质校准溶液制备与检测：取两份10mg/L苦参碱标准溶液，分别用蒸馏水稀释成200μg/L标准溶液和2000μg/L标准溶液，称取7份阴性山花蜂蜜，每份蜂蜜含量为2g，前4份中分别加入200μg/L标准溶液50μL、100μL、200μL、500μL，中间2份中分别加入2000μg/L标准溶液100μL、200μL，配制成5μg/kg、10μg/kg、20μg/kg、50μg/kg、100μg/kg和200μg/kg系列阴性基质标准溶液，最后一份不添加任何标准溶液，作为阴性质控，按上述(1)、(2)、(3)步骤制备阴性样品提取液，再根据处理过的蜂蜜样品中添加的苦参碱浓度为横坐标进行气相色谱-串联质谱分析，苦参碱峰面积作为纵坐标，用于绘制阴性基质标准曲线，得到的线性方程为：y＝1195.5x-1089.1，相关系数R2＝0.9989。
在步骤(2)中，其两次充分振荡提取过程中保持温度为20-30℃，防止结块。
在步骤(1)中，总苦参碱提取液1TMT-E1的配置为：量取分析纯28％氨水15mL，加水至1000mL。
在步骤(2)中，总苦参碱提取液2TMT-E2的配置为：二氯甲烷或三氯甲烷，分析纯。
在步骤(4)中，所述气相色谱-串联质谱仪的测定条件为：
1)气相色谱柱采用HP-5MS色谱柱，规格为柱长30m，柱内径0.25mm，粒径0.25μm或者性能相当的色谱柱；
2)柱N2流量：1.5ml/min；
3)升温程序见下表：
质谱仪参数：进样口温度270℃，辅助加热器280℃，EI源，轰击能量70eV，离子源温度280℃，溶剂延迟4min；
检测方式:多反应监测(dMRM)；247/150为推荐定量离子对。
下面结合具体实施例对本发明作以下进一步说明：
实施例1：茴香蜂蜜中苦参碱残留量的测定
(1)样品前处理：称取蜂蜜样品2g置于50ml玻璃离心瓶中，于190℃条件下加热30min，加热结束后冷却至室温，向玻璃离心瓶中加入10ml总苦参碱提取液1TMT-E1，轻轻混匀至溶解蜂蜜样品，将溶解的混合溶液转入50ml塑料离心瓶中，再用3ml总苦参碱提取液1TMT-E1冲洗玻璃离心瓶壁，冲洗液合并至50ml塑料离心瓶中；
(2)样品的提纯：向步骤(1)中的塑料离心瓶中加入15mL总苦参碱提取液2TMT-E2，充分振荡提取1-2min，再加入10g无水硫酸钠，充分振荡提取1-2min，震荡结束后置于离心机中4500r.p.m转速下离心分离5分钟，待离心后静置分层吸出上层液体置于50ml鸡心瓶中，于40℃下旋转蒸发2-3min；
(3)样品的净化：向步骤(2)中的鸡心瓶中加入1.2mL溶解液，置于40Hz震动频率的超声机中边超声震荡边旋转鸡心瓶，超声震荡结束后，将所得的混合液用一次性吸管吸出置于事先放有100mgC18填料和100mg乙二胺-N-丙基硅烷PSA填料的10ml玻璃试管中，再将玻璃试管置于旋涡混合仪上旋涡混合2min脱色4次，脱色完成后置于离心机中4500r.p.m转速下离心分离2分钟，待离心后静置分层吸出上层液体置于试管中，待用；其中，溶解液的配比为：乙腈和甲苯的体积用量比为5：1；
(4)基质校准溶液制备与检测：取两份10mg/L苦参碱标准溶液，分别用蒸馏水稀释成200μg/L标准溶液和2000μg/L标准溶液，称取7份阴性山花蜂蜜，每份蜂蜜含量为2g，前4份中分别加入200μg/L标准溶液50μL、100μL、200μL、500μL，中间2份中分别加入2000μg/L标准溶液100μL、200μL，配制成5μg/kg、10μg/kg、20μg/kg、50μg/kg、100μg/kg和200μg/kg系列阴性基质标准溶液，最后一份不添加任何标准溶液，作为阴性质控，按上述(1)、(2)、(3)步骤制备阴性样品提取液，再根据处理过的蜂蜜样品中添加的苦参碱浓度为横坐标进行气相色谱-串联质谱分析，苦参碱峰面积作为纵坐标，用于绘制阴性基质标准曲线，得到的线性方程为：y＝1195.5x-1089.1，相关系数R2＝0.9989。
在步骤(2)中，其两次充分振荡提取过程中保持温度为25℃，防止结块。
在步骤(1)中，总苦参碱提取液1TMT-E1的配置为：量取分析纯28％氨水15mL，加水至1000mL。
在步骤(2)中，总苦参碱提取液2TMT-E2的配置为：二氯甲烷，分析纯。
在步骤(4)中，所述气相色谱-串联质谱仪的测定条件为：
1)气相色谱柱采用HP-5MS色谱柱，规格为柱长30m，柱内径0.25mm，粒径0.25μm；
2)柱N2流量：1.5ml/min；
3)升温程序见下表：
质谱仪参数：进样口温度270℃，辅助加热器280℃，EI源，轰击能量70eV，离子源温度280℃，溶剂延迟4min；
检测方式:多反应监测(dMRM)；247/150为推荐定量离子对。
使用基质校准溶液对基质效应进行校正，采用离子对定量。采用线性方程：y＝1195.5x-1089.1，相关系数R2＝0.9989。根据样品提取溶液中苦参碱的浓度，计算样品中苦参碱的含量。经检测，该蜂蜜样品中未检出有苦参碱。
为验证该方法的准确性，将本方法的实施例1的检测结果与intertek天祥检验集团(http://www.intertek.com/)进行比较，得出其阳性结果的比值约70％，阴性样品的检测结果一致。其回收率高达90％以上，符合GB/T27404有关检测准确度的要求。
本方法已经应用于生产实践，指导企业的原料收购和生产过程中苦参碱含量的控制，产品得以顺利出口。
本发明并不受上述实施方式的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种蜂蜜中总苦参碱残留量的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)样品前处理：称取蜂蜜样品2g置于50ml玻璃离心瓶中，于190℃条件下加热30min，加热结束后冷却至室温，向玻璃离心瓶中加入10ml总苦参碱提取液1TMT-E1，轻轻混匀至溶解蜂蜜样品，将溶解的混合溶液转入50ml塑料离心瓶中，再用1-5ml总苦参碱提取液1TMT-E1冲洗玻璃离心瓶壁，冲洗液合并至50ml塑料离心瓶中；
(2)样品的提纯：向步骤(1)中的塑料离心瓶中加入15mL总苦参碱提取液2TMT-E2，充分振荡提取1-2min，再加入10g无水硫酸钠，充分振荡提取1-2min，震荡结束后置于离心机中4500r.p.m转速下离心分离5分钟，待离心后静置分层吸出上层液体置于50ml鸡心瓶中，于40℃下旋转蒸发2-3min；
(3)样品的净化：向步骤(2)中的鸡心瓶中加入1.2mL溶解液，置于40Hz震动频率的超声机中边超声震荡边旋转鸡心瓶，超声震荡结束后，将所得的混合液用一次性吸管吸出置于事先放有100mg C18填料和100mg乙二胺-N-丙基硅烷PSA填料的10ml玻璃试管中，再将玻璃试管置于旋涡混合仪上旋涡混合2min脱色3-5次，脱色完成后置于离心机中4500r.p.m转速下离心分离2分钟，待离心后静置分层吸出上层液体置于试管中，待用；其中，溶解液的配比为：乙腈和甲苯的体积用量比为(1-6)：1；
(4)基质校准溶液制备与检测：取两份10mg/L苦参碱标准溶液，分别用蒸馏水稀释成200μg/L标准溶液和2000μg/L标准溶液，称取7份阴性山花蜂蜜，每份蜂蜜含量为2g，前4份中分别加入200μg/L标准溶液50μL、100μL、200μL、500μL，中间2份中分别加入2000μg/L标准溶液100μL、200μL，配制成5μg/kg、10μg/kg、20μg/kg、50μg/kg、100μg/kg和200μg/kg系列阴性基质标准溶液，最后一份不添加任何标准溶液，作为阴性质控，按上述(1)、(2)、(3)步骤制备阴性样品提取液，再根据处理过的蜂蜜样品中添加的苦参碱浓度为横坐标进行气相色谱-串联质谱分析，苦参碱峰面积作为纵坐标，用于绘制阴性基质标准曲线，得到的线性方程为：y＝1195.5x-1089.1，相关系数R2＝0.9989。
2.根据权力要求1所述的一种蜂蜜中总苦参碱残留量的检测方法，其特征在于，在步骤(2)中，其两次充分振荡提取过程中保持温度为20-30℃，防止结块。
3.根据权力要求1所述的一种蜂蜜中总苦参碱残留量的检测方法，其特征在于，在步骤(1)中，总苦参碱提取液1TMT-E1的配置为：量取分析纯28％氨水15mL，加水至1000mL即可。
4.根据权力要求1所述的一种蜂蜜中总苦参碱残留量的检测方法，其特征在于，在步骤(2)中，总苦参碱提取液2TMT-E2为：二氯甲烷或者三氯甲烷中的任何一种，分析纯。
5.根据权力要求1所述的一种蜂蜜中总苦参碱残留量的检测方法，其特征在于，在步骤(4)中，所述气相色谱-串联质谱仪的测定条件为：
1)气相色谱柱采用HP-5MS色谱柱，规格为柱长30m，柱内径0.25mm，粒径0.25μm或者性能相当的色谱柱；
2)柱N2流量：1.5ml/min；
3)升温程序见下表：
4)质谱仪参数：进样口温度270℃，辅助加热器280℃，EI源，轰击能量70eV，离子源温度280℃，溶剂延迟4min；
5)检测方式:多反应监测(dMRM)；247/150为推荐定量离子对。
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