CN111189941B - 一种快速检测茶叶中苦参碱残留量的方法 - Google Patents

一种快速检测茶叶中苦参碱残留量的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种快速检测茶叶中苦参碱残留量的方法，包括以下步骤：1)样品预处理：样品用粉碎机粉碎后过2.0mm筛，混合均匀装入自封袋中，密封备用；2)样品的提取：取样品，用氨水和乙腈提取；3)样品的净化：将提取液过FaPEx净化柱后，用氨水‑乙腈溶液稀释混匀；4)基质校准溶液制备：称取不含苦参碱的阴性茶叶样品，按照上述步骤制备阴性样品提取液，用于配制苦参碱基质标准溶液；5)采用液相色谱‑串联质谱法测定样品溶液中苦参碱的浓度；6)根据样品溶液中苦参碱的浓度，计算样品中苦参碱的残留量；本发明测定方法快速、简单，能够实现茶叶中苦参碱含量的准确测定，解决了茶叶中苦参碱残留量检测方法操作繁复冗长的问题。

Description

一种快速检测茶叶中苦参碱残留量的方法
[技术领域]
本发明属于分析化学技术领域，具体地说是一种快速检测茶叶中苦参碱残留量的方法。
[背景技术]
随着使用传统化学药物的弊端日益凸显，在农业生产中寻求相对安全、高效低毒的替代品成为必然趋势。与化学药物相比，生物农药通常被认为无公害、无污染、无残留，不易产生抗性，因而被认为是化学药物理想的替代品，生物农药的发展方兴未艾。但生物农药也存在毒副作用。
苦参碱是一种高效广谱植物源杀虫剂，对2～3龄茶毛虫具有速效性和持久性，对茶尺蠖2龄幼虫和茶假眼小绿叶蝉低龄若虫有显著的毒杀作用。苦参碱属低毒植物源农药，对人体伤害较小，因此在我国无公害生态茶园、有机茶园大面积推广使用。但生物农药也存在毒副作用，研究表明高剂量的苦参碱对小鼠生殖细胞有损伤作用，能诱发精子畸变。苦参碱在茶叶中的滥用导致食品安全隐患，茶叶中苦参碱残留风险评估以及最大残留限量值(MRL)的制定势在必行。虽然在现行的GB 2763《食品中农药最大残留限量》中仅对一些蔬菜、水果基质给出了苦参碱残留限量要求，尚未涉及茶叶，但国外对苦参碱的限量要求和含量检测也越来越重视。欧盟法规已对茶叶中苦参碱的残留限量做出明确要求，限量为0.01mg/kg。
苦参碱属于碱性水溶性化合物，具有比较强的碱性，在水中有良好的溶解性，溶于冷水、乙醇、乙醚、氯仿和苯，难溶于石油醚。作为生物碱，其碱性强弱，不但与杂环结构中N原子结合状态有关，也与N原子所处的化学环境有关，常规的茶叶中农残检测方法显然不适用。对于茶叶中苦参碱残留量的检测，目前没有标准方法可循。虽有少量文献报道了茶叶中苦参碱残留量的质谱检测方法，但由于茶叶基质的复杂性及苦参碱本身性质的特殊性，报道中采用了繁复的前处理步骤以降低茶叶基质对苦参碱提取效率的影响来保持苦参碱在提取过程中的稳定性。该方法检测步骤冗长，增加了测定结果不确定性，也为实验室对大批量茶叶进行苦参碱残留量检测带来了困难。因此，如何建立一个快速准确检测茶叶中苦参碱残留量的方法迫在眉睫。
[发明内容]
本发明的目的就是要解决上述的不足而提供一种快速检测茶叶中苦参碱残留量的方法，不仅测定方法快速、简单，而且能够实现茶叶中苦参碱含量的准确测定，解决了茶叶中苦参碱残留量检测方法操作繁复冗长的问题。
为实现上述目的设计一种快速检测茶叶中苦参碱残留量的方法，包括以下步骤：1)样品预处理：将茶叶样品用粉碎机粉碎后过2.0mm筛，混合均匀，装入洁净干燥的自封袋中，密封备用；2)样品的提取：称取样品，用氨水和乙腈提取；3)样品的净化：将步骤2)所得的提取液过FaPEx-TEA净化柱后，采用氨水-乙腈溶液稀释，混匀；4)基质标准溶液制备：称取不含苦参碱的阴性样品，根据步骤1)至步骤3)制备阴性样品提取液，用于配制苦参碱基质标准溶液；5)采用液相色谱-串联质谱仪测定样品溶液中苦参碱的浓度；6)根据步骤5)所得的样品溶液中苦参碱的浓度，经由步骤4)得到的基质标准溶液校正，即可计算样品中苦参碱的残留量。
进一步地，步骤2)中，称取均匀试样0.5g，置于50mL离心管中，加入2mL氨水，涡旋均匀，静置10min，再加入18mL乙腈，涡旋均匀，然后以6000r/min离心8min，取上清液过0.45μm滤膜于50mL离心管中。
进一步地，步骤3)中，取2mL上清液分两次通过FaPEx-TEA净化柱，收集净化液，取500μL净化液，加入氨水-乙腈溶液稀释定容到1mL，混匀后供液相色谱-串联质谱仪分析。
进一步地，步骤3)中，所述氨水-乙腈溶液以氨水/乙腈(v/v)＝1∶9。
进一步地，步骤4)中，若样品为阳性，按照步骤1)、2)、3)制备阴性样品提取液，再根据样品中苦参碱残留物的浓度，移取适量的苦参碱标准中间溶液，用阴性样品提取液配制成等同浓度的基质标准溶液进行液相色谱-串联质谱分析，用于计算样品中苦参碱的实际残留量。
进一步地，步骤5)中，所述液相色谱-串联质谱仪的测定条件为：
1)液相色谱柱采用C18柱，规格为柱长10cm，柱内径3.0mm，粒径3.5μm；
2)液相色谱柱温度设定为25℃；
3)进样量：50μL；
4)流速：0.3mL/min；
5)流动相条件见下表：
Figure BDA0002380701070000031
6)运行时间：15min
7)质谱参数见下表：
Figure BDA0002380701070000041
进一步地，步骤5)中，由净化溶液中苦参碱的浓度换算到样品溶液中苦参碱的含量，根据基质标准溶液进行基质效应的校准，采用外标法定量，最低定量浓度为0.01mg/kg。
进一步地，步骤6)中，通过比较样品峰和标准品峰的保留时间、特征离子对及离子对丰度比，确定样品中是否检出苦参碱，再使用基质标准溶液对基质效应进行校正，采用外标法定量。
本发明同现有技术相比，针对现有方法中茶叶中苦参碱含量检测方法操作复杂冗长这一问题，提供了一种经提取、快速净化后直接用液相色谱-质谱测定茶叶中苦参碱残留量的方法，该方法用碱性溶液和有机溶剂提取，提取液经FaPEx净化，采用液相色谱-串联质谱仪测定茶叶中苦参碱残留量，不仅测定方法快速、简单，而且能够实现茶叶中苦参碱含量的准确测定，其最低定量浓度为0.01mg/kg，解决了茶叶中苦参碱残留量检测方法操作繁复冗长的问题，完全能够满足对茶叶中苦参碱残留量监测的要求，值得推广应用。
[附图说明]
图1是本发明实施例2中使用液相色谱-串联质谱仪检测绿茶样品中苦参碱残留量所得的TIC色谱图；
图2是本发明实施例2中使用液相色谱-串联质谱仪检测绿茶样品中苦参碱残留量所得的质谱图；
图3是本发明液相色谱-串联质谱仪检测标准溶液，所得苦参碱TIC色谱图。
[具体实施方式]
本发明属于分析化学领域，具体地说是对茶叶中苦参碱含量的测定，其原理为：将样品中残留的苦参碱用氨水和乙腈提取，提取液经FaPEx固相萃取柱净化和氨水-乙腈(1+9，V/V)稀释后，用液相色谱-质谱仪测定样品中苦参碱的含量。具体包括以下步骤：
1)样品预处理：将茶叶样品用粉碎机粉碎后过2.0mm筛，混合均匀，装入洁净干燥的自封袋中，密封备用；
2)样品的提取：称取样品，用氨水和乙腈提取；
3)样品的净化：将步骤2)所得的提取液过FaPEx-TEA净化柱后，采用氨水-乙腈溶液稀释，混匀；
4)基质标准溶液制备：称取不含苦参碱的阴性样品，根据步骤1)至步骤3)制备阴性样品提取液，用于配制苦参碱基质标准溶液；
5)采用液相色谱-串联质谱仪测定样品溶液中苦参碱的浓度；
6)根据步骤5)所得的样品溶液中苦参碱的浓度，经由步骤4)得到的基质标准溶液校正，即可计算样品中苦参碱的残留量。
步骤4)中，若样品为阳性，按照步骤1)、2)、3)制备阴性样品提取液，再根据样品中苦参碱残留物的浓度，移取适量的苦参碱标准中间溶液，用阴性样品提取液配制成等同浓度的基质标准溶液进行液相色谱-串联质谱分析，用于计算样品中苦参碱的实际残留量；该溶液需要现配现用。步骤5)中，由净化溶液中苦参碱的浓度换算到样品溶液中苦参碱的含量，根据基质标准溶液进行基质效应的校准，采用外标法定量，最低定量浓度为0.01mg/kg。
液相色谱-质谱仪的测定条件为：
1)液相色谱柱采用C18柱，规格为柱长10cm，柱内径3.0mm，粒径3.5μm；
2)液相色谱柱温度设定为25℃；
3)进样量：50μL
4)流速：0.3mL/min
5)流动相条件见下表：
Figure BDA0002380701070000061
6)运行时间：15min
7)质谱参数见下表：
Figure BDA0002380701070000062
Figure BDA0002380701070000071
下面结合具体实施例对本发明作以下进一步说明：
实施例1：红茶中苦参碱残留量的测定
1.样品溶液的制备：
将红茶用粉碎机打碎过2.0mm筛,混匀，装入洁净干燥的自封袋中，密封备用。称取均匀试样0.5g(精确至0.0005g)，置于50mL离心管中，加入2mL氨水，涡旋混匀,静置10min，再加入18mL乙腈,涡旋混匀,然后以6000r/min离心8min，取上清液过0.45μm滤膜于50mL离心管中。取2mL上清液分两次通过FaPEx-TEA净化柱，收集净化液，取500μL净化液，加入氨水-乙腈(1：9，V/V)溶液稀释至1mL，供液相色谱-串联质谱仪分析。
2.设定仪器参数：
1)液相色谱柱采用C18柱，规格为柱长10cm，柱内径3.0mm，粒径3.5μm；
2)液相色谱柱温度设定为25℃；
3)进样量：50μL
4)流速：0.3mL/min
5)流动相条件见下表：
Figure BDA0002380701070000072
6)运行时间：15min
7)质谱参数见下表：
Figure BDA0002380701070000081
3.定性和定量
1)定性：通过比较样品峰和标准品峰的保留时间、特征离子对及离子对丰度比，确定样品中是否检出苦参碱。
2)定量：使用基质校准溶液对基质效应进行校正，采用外标法定量。
4.计算
根据样品提取溶液中苦参碱的浓度，计算样品中苦参碱的含量。经检测，该红茶样品中未检出有苦参碱。
实施例2：绿茶中苦参碱的测定
1.样品的制备：
将绿茶用粉碎机打碎过2.0mm筛，混匀，装入洁净干燥的自封袋中，密封备用。称取均匀试样0.5g(精确至0.0005g)，置于50mL离心管中，加入2mL氨水，涡旋混匀,静置10min，加入18mL乙腈,涡旋均匀,以6000r/min离心8min，取上清液过0.45μm滤膜于50mL离心管中。取2mL上清液分两次通过FaPEx-TEA净化柱，收集净化液。取500μL净化液，加入氨水-乙腈(1+9，V/V)溶液稀释至1mL，供液相色谱-质谱仪分析。
2.设定仪器参数：
1)液相色谱柱采用C18柱，规格为柱长10cm，柱内径3.0mm，粒径3.5μm；
2)液相色谱柱温度设定为25℃；
3)进样量：50μL
4)流速：0.3mL/min
5)流动相条件见下表：
Figure BDA0002380701070000091
6)运行时间：15min
7)质谱参数见下表：
Figure BDA0002380701070000092
3.定性和定量
1)定性：通过比较样品峰和标准品峰的保留时间、特征离子对及离子对丰度比，确定样品中是否检出苦参碱。
2)定量：使用基质校准溶液对基质效应进行校正，采用外标法定量。
4.计算
经检测，该绿茶样品中含有苦参碱。根据样品提取溶液中苦参碱的浓度，计算样品中苦参碱的含量为0.042mg/kg。如附图1和附图2所示，为使用液相色谱-串联质谱仪检测绿茶样品中苦参碱含量所得的TIC色谱图和质谱图。
本发明并不受上述实施方式的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种快速检测茶叶中苦参碱残留量的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)样品预处理：将茶叶样品用粉碎机粉碎后过2.0mm筛，混合均匀，装入洁净干燥的自封袋中，密封备用；
2)样品的提取：称取样品，用氨水和乙腈提取；
3)样品的净化：将步骤2)所得的提取液过FaPEx-TEA净化柱后，采用氨水-乙腈溶液稀释，混匀；
4)基质标准溶液制备：称取不含苦参碱的阴性样品，根据步骤1)至步骤3)制备阴性样品提取液，用于配制苦参碱基质标准溶液；
5)采用液相色谱-串联质谱仪测定样品溶液中苦参碱的浓度；
6)根据步骤5)所得的样品溶液中苦参碱的浓度，经由步骤4)得到的基质标准溶液校正，即可计算样品中苦参碱的残留量；
步骤2)中，称取均匀试样0.5g，置于50mL离心管中，加入2mL氨水，涡旋均匀，静置10min，再加入18mL乙腈，涡旋均匀，然后以6000r/min离心8min，取上清液过0.45μm滤膜于50mL离心管中；
步骤3)中，取2mL上清液分两次通过FaPEx-TEA净化柱，收集净化液，取500μL净化液，加入氨水-乙腈溶液稀释定容到1mL，混匀后供液相色谱-串联质谱仪分析；
步骤3)中，所述氨水-乙腈溶液以氨水/乙腈v/v＝1∶9；
步骤5)中，所述液相色谱-串联质谱仪的测定条件为：
1)液相色谱柱采用C18柱，规格为柱长10cm，柱内径3.0mm，粒径3.5μm；
2)液相色谱柱温度设定为25℃；
3)进样量：50μL；
4)流速：0.3mL/min；
5)流动相条件见下表：
Figure FDA0003581290240000021
6)运行时间：15min
7)质谱参数见下表：
Figure FDA0003581290240000022
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤4)中，若样品为阳性，按照步骤1)、2)、3)制备阴性样品提取液，再根据样品中苦参碱残留物的浓度，移取适量的苦参碱标准中间溶液，用阴性样品提取液配制成等同浓度的基质标准溶液进行液相色谱-串联质谱分析，用于计算样品中苦参碱的实际残留量。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤5)中，由净化溶液中苦参碱的浓度换算到样品溶液中苦参碱的含量，根据基质标准溶液进行基质效应的校准，采用外标法定量，最低定量浓度为0.01mg/kg。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤6)中，通过比较样品峰和标准品峰的保留时间、特征离子对及离子对丰度比，确定样品中是否检出苦参碱，再使用基质标准溶液对基质效应进行校正，采用外标法定量。
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