CN114814033A - 一种基于lc-ms的多黏菌素b1、b2的检测方法及试剂盒 - Google Patents
一种基于lc-ms的多黏菌素b1、b2的检测方法及试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN114814033A CN114814033A CN202210476003.7A CN202210476003A CN114814033A CN 114814033 A CN114814033 A CN 114814033A CN 202210476003 A CN202210476003 A CN 202210476003A CN 114814033 A CN114814033 A CN 114814033A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- polymyxin
- mobile phase
- stock solution
- sample
- detection method
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108700018363 polymyxin B(1) Proteins 0.000 title claims abstract description 46
- WQVJHHACXVLGBL-GOVYWFKWSA-N polymyxin B1 Polymers N1C(=O)[C@H](CCN)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCN)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCN)NC(=O)CCCC[C@H](C)CC)CCNC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCN)NC(=O)[C@H](CCN)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1CC1=CC=CC=C1 WQVJHHACXVLGBL-GOVYWFKWSA-N 0.000 title claims abstract description 46
- 108010089148 polymyxin B2 Proteins 0.000 title claims abstract description 39
- SGPYLFWAQBAXCZ-RUDZPDEXSA-N polymyxin B2 Chemical compound N1C(=O)[C@H](CCN)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCN)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCN)NC(=O)CCCCC(C)C)CCNC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCN)NC(=O)[C@H](CCN)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1CC1=CC=CC=C1 SGPYLFWAQBAXCZ-RUDZPDEXSA-N 0.000 title claims abstract description 39
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 36
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 title claims abstract description 16
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims abstract description 20
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 18
- 238000001294 liquid chromatography-tandem mass spectrometry Methods 0.000 claims abstract description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 claims abstract description 3
- 239000012071 phase Substances 0.000 claims description 45
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 claims description 27
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 25
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 24
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 238000007865 diluting Methods 0.000 claims description 13
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 13
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 13
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 claims description 11
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 9
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 claims description 8
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 6
- XBJFCYDKBDVADW-UHFFFAOYSA-N acetonitrile;formic acid Chemical compound CC#N.OC=O XBJFCYDKBDVADW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 claims description 4
- 239000012716 precipitator Substances 0.000 claims description 4
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 claims description 3
- SVWLIIFHXFGESG-UHFFFAOYSA-N formic acid;methanol Chemical compound OC.OC=O SVWLIIFHXFGESG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 2
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 claims description 2
- 238000000889 atomisation Methods 0.000 claims 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 claims 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 claims 1
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 31
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 6
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 abstract description 4
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 abstract description 3
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 abstract description 3
- 101001096022 Homo sapiens Phospholipase B1, membrane-associated Proteins 0.000 description 13
- 102100037883 Phospholipase B1, membrane-associated Human genes 0.000 description 13
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 101150027765 PLB2 gene Proteins 0.000 description 11
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 10
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 6
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010093965 Polymyxin B Proteins 0.000 description 5
- 229920000024 polymyxin B Polymers 0.000 description 5
- 229960005266 polymyxin b Drugs 0.000 description 5
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 5
- 108010040201 Polymyxins Proteins 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 3
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 238000012950 reanalysis Methods 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 238000004885 tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 238000001195 ultra high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108010078777 Colistin Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000606790 Haemophilus Species 0.000 description 1
- 241000588748 Klebsiella Species 0.000 description 1
- 206010029155 Nephropathy toxic Diseases 0.000 description 1
- 206010034133 Pathogen resistance Diseases 0.000 description 1
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 description 1
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000010812 external standard method Methods 0.000 description 1
- 231100000086 high toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 1
- 230000002262 irrigation Effects 0.000 description 1
- 238000003973 irrigation Methods 0.000 description 1
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- JORAUNFTUVJTNG-BSTBCYLQSA-N n-[(2s)-4-amino-1-[[(2s,3r)-1-[[(2s)-4-amino-1-oxo-1-[[(3s,6s,9s,12s,15r,18s,21s)-6,9,18-tris(2-aminoethyl)-3-[(1r)-1-hydroxyethyl]-12,15-bis(2-methylpropyl)-2,5,8,11,14,17,20-heptaoxo-1,4,7,10,13,16,19-heptazacyclotricos-21-yl]amino]butan-2-yl]amino]-3-h Polymers CC(C)CCCCC(=O)N[C@@H](CCN)C(=O)N[C@H]([C@@H](C)O)CN[C@@H](CCN)C(=O)N[C@H]1CCNC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCN)NC(=O)[C@H](CCN)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCN)NC1=O.CCC(C)CCCCC(=O)N[C@@H](CCN)C(=O)N[C@H]([C@@H](C)O)CN[C@@H](CCN)C(=O)N[C@H]1CCNC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCN)NC(=O)[C@H](CCN)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCN)NC1=O JORAUNFTUVJTNG-BSTBCYLQSA-N 0.000 description 1
- YKQOSKADJPQZHB-YNWHQGOSSA-N n-[(2s)-4-amino-1-[[(2s,3r)-1-[[(2s)-4-amino-1-oxo-1-[[(3s,6s,9s,12s,15r,18s,21s)-6,9,18-tris(2-aminoethyl)-3-[(1s)-1-hydroxyethyl]-12,15-bis(2-methylpropyl)-2,5,8,11,14,17,20-heptaoxo-1,4,7,10,13,16,19-heptazacyclotricos-21-yl]amino]butan-2-yl]amino]-3-h Polymers CCC(C)CCCC(=O)N[C@@H](CCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCN)C(=O)N[C@H]1CCNC(=O)[C@H]([C@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCN)NC(=O)[C@H](CCN)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCN)NC1=O YKQOSKADJPQZHB-YNWHQGOSSA-N 0.000 description 1
- 230000007694 nephrotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000417 nephrotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- XDJYMJULXQKGMM-UHFFFAOYSA-N polymyxin E1 Natural products CCC(C)CCCCC(=O)NC(CCN)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)NC(CCN)C(=O)NC1CCNC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C(CCN)NC(=O)C(CCN)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CCN)NC1=O XDJYMJULXQKGMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 239000013062 quality control Sample Substances 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 208000013223 septicemia Diseases 0.000 description 1
- 230000003595 spectral effect Effects 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 1
- 230000001360 synchronised effect Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
- G01N30/06—Preparation
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/62—Detectors specially adapted therefor
- G01N30/72—Mass spectrometers
- G01N30/7233—Mass spectrometers interfaced to liquid or supercritical fluid chromatograph
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/86—Signal analysis
- G01N30/8675—Evaluation, i.e. decoding of the signal into analytical information
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/88—Integrated analysis systems specially adapted therefor, not covered by a single one of the groups G01N30/04 - G01N30/86
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N2030/022—Column chromatography characterised by the kind of separation mechanism
- G01N2030/027—Liquid chromatography
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
- G01N30/02—Column chromatography
- G01N30/04—Preparation or injection of sample to be analysed
- G01N30/06—Preparation
- G01N2030/065—Preparation using different phases to separate parts of sample
Landscapes
- Physics & Mathematics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Library & Information Science (AREA)
- Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
Abstract
本发明公开了一种基于LC‑MS的多黏菌素B1、B2的检测方法包括如下步骤：获得待测样品，利用液相色谱‑串联质谱技术对待测样品进行检测。采用本发明的方法同时检测多粘菌素B1和多粘菌素B2的浓度，灵敏度高、特异性强、准确且前处理过程简单，无需额外添加内标物，3.0min之内完成血清中多粘菌素B1和多粘菌素B2药物的分离和检测，准确度与精密度基本满足要求，可用于临床上血清中多粘菌素B1和多粘菌素B2的定量分析，为临床上多粘菌素B1和多粘菌素B2浓度监测提供简单快速的检测方法。
Description
技术领域
本发明属于药物检测技术领域，具体涉及一种基于LC-MS的多黏菌素B1、B2 的检测方法及试剂盒。
背景技术
多粘菌素B是一种对绿脓杆菌、大肠杆菌、克雷伯氏杆菌及嗜血杆菌等多种阴性菌有抑制作用的抗生素，对其他抗生素耐药的菌株对该品也敏感。但由于其严重的肾 毒性及神经阻滞作用，多粘菌素B仅用于烧伤合并败血症时短期抢救用，或供局部喷 雾冲洗外用。因此对其药物浓度准确监测，对治疗效果提升以及毒性反应的避免有重 大意义。
传统检测方法对于多粘菌素B的检测方法一般为液相色谱串联分光光度计方法，并且存在以下局限性：其相对串联质谱方法而言灵敏度低，特异性差，逐步被临床所 淘汰；无法区分多黏菌素B1以及B2，得不到更准确的结果，逐渐被临床所淘汰；现 在检测方法多采用相色谱串联质谱方法。但是大多数的方法只对一个药物浓度进行监 测，对于毒性大的这种药物，不能准确反映药代动力学的结果；并且检测方法耗时长， 对于大批量样本，时间稍微延长就会大大增加检测时间。
CN 111830153 A公开了一种检测血清中多粘菌素B1和多粘菌素B2浓度的方法：取预处理的血清，先利用超高效液相色谱将待测物与血清基质分离，再利用质谱内标 定量法，根据已经建立的校准曲线，即可计算出多粘菌素B1和多粘菌素B2的含量； 所采用的内标物为多粘菌素E；尽管CN 111830153 A所公开的方法采用超高效液相色 谱进行检测，与传统检测方法不同，但是该方法需要额外添加内标物，极大增加了检 测步骤，不利于大批量样品检测。另一方面，CN1111830153A测定多粘菌素B1和B2 色谱分离时间为5min，对于大量样本的分析检测时，效率不高，不利于大批量处理。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种基于LC-MS的多 黏菌素B1、B2的检测方法及试剂盒。
为了达到上述目的，本发明采用如下技术手段：
一种基于LC-MS的多黏菌素B1、B2的检测方法，包括如下步骤：
获得待测样品，利用液相色谱-串联质谱技术对待测样品进行检测；
其中，液相色谱条件如下：
色谱柱：ACE Excel-2 C18-PFP柱，100×2.1mm，粒径2.6μm；
流动相A：0.1％甲酸水溶液；
流动相B：0.1％甲酸乙腈溶液；
强洗溶液：50％异丙醇；
采用梯度洗脱，流速为0.4mL/min，柱温为40℃，进样2μL。
所述梯度洗脱的洗脱梯度如下：0-0.3min，流动相A体积分数保持85％，流动相 B体积分数保持15％；0.3-1.5min，流动相A体积分数由85％下降至40％，流动相B 体积分数由15％上升至60％；1.5-1.9min，流动相A体积分数保持40％，流动相B体 积分数保持60％；1.9-2min，流动相A体积分数由40％上升至85％，流动相B体积分 数由60％下降至15％；保持流动相A和流动相B的体积分数到3min停止。
优选地，所述质谱的条件如下：离子源：电喷雾离子源，正离子模式；毛细管电 压：5500V；离子源温度(TEM)：450℃；离子源雾化气(GS1)：50psi；离子源加 热辅助气(GS2)：50psi；气帘气(CUR)：30psi；碰撞气(CAD)：8psi；扫描模 式：MRM。
所述检测方法还包括获得待测样本的步骤：精密量取生物样品50μL置于洁净离心管中；分别加入200μL的沉淀剂，充分混匀5min，4℃的条件下以转速为12000rpm 离心5min；吸取上清液150μL置于96孔板中，即可得到待测样品。
优选地，所述生物样品选自人血清样品和人血浆样品中的一种。
进一步优选地，所述生物样品的采样要求如下：用真空负压黄色帽采血管(分离胶)采集空腹多黏菌素B服用者(用药者需在持续用药3天以上的第四次服药前和服 药后2小时分别采血)的静脉血0.5-3.0mL，获得血清标本；并在2h内采用离心沉淀 法(4000rpm/min，10min)分离血清，分装，并注意避光保存。
优选地，所述沉淀剂为浓度为1％的甲酸甲醇溶液与乙腈按体积比为1：2混合得到。
所述检测方法还包括获得标准品和质控品，并进行检测的步骤：所述标准品和质控品分别由混标储备液与空白基质逐级稀释得到；所述混标储备液由多黏菌素B1单 标储备液和多黏菌素B2单标储备液按体积比2：1混合而成，其中多黏菌素B1单标 储备液的浓度为1mg/mL；多黏菌素B2单标储备液的浓度为1mg/mL。
优选地，所述空白基质为空白人血清或过滤人血清。
优选地，所述标准品由W1和空白基质配制而成；充分混匀W1，用空白基质逐 级稀释得到W2、W3、W4、W5、W6、W7、W8和W9；其中W2由700μL W1和 300μL空白基质组成；W3由400μLW1和600μL空白基质组成；W4由200μL W1 和800μL空白基质组成；W5由100μL W1和900μL空白基质组成；W6由160μL W1和1840μL空白基质组成；W7由500μL W6和500μL空白基质组成；W8由250 μL W6和750μL空白基质组成；W9由150μL W6和1050μL空白基质组成。
优选地，所述质控品由空白基质稀释W1得到；用空白基质稀释W1，分别得到 高浓度质控(HQC)、中浓度质控(MQC)和低浓度质控(LQC)样品；其中，HQC 由800μL的W1和200μL空白基质组成；MQC由200μL的W1和800μL空白基 质组成；LQC由50μL的W1和950μL空白基质组成。
数据分析方法如下：通过外标法定量，计算公式为AUC： -1.346+12.096*C0h+12.460*C2h；C0h＝C0hPLB1+C0hPLB2，C2h＝C2hPLB1+C2hPLB2，式 中C0h为初始给药时浓度；C2h为给药2h后的浓度；C0hPLB1为初始给药时PLB1浓度； C2hPLB1为给药2h后的PLB1浓度；C0hPLB2为初始给药时PLB2浓度；C2hPLB2为 给药2h后的PLB2浓度。
对超限数据进行原因查找，并进行复测重分析处理；对超过标曲最高点浓度的样品进行稀释处理，用空白基质进行稀释，根据测试的结果进行估算，选择合适的稀释 倍数(2倍，5倍，10倍)；低于检出限的样品，则认为样本中未检出多黏菌素B1 或多黏菌素B2。
一种基于LC-MS/MS检测多黏菌素B1和多黏菌素B2的试剂盒，包括混合标准 品、流动相A、流动相B、沉淀剂，其中，所述混合标准品中多黏菌素B1和多黏菌 素B2的浓度分别为1mg/mL，所述流动相A为0.1％甲酸水溶液；所述流动相B为0.1％ 甲酸乙腈溶液，所述沉淀剂由浓度为1％的甲酸甲醇溶液与乙腈按体积比为1：2混合 得到。
本发明的有益效果
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
采用本发明的方法同时检测多粘菌素B1和多粘菌素B2的浓度，灵敏度高、特异 性强、准确且前处理过程简单，无需额外添加内标物，3.0min之内完成血清中多粘菌 素B1和多粘菌素B2药物的分离和检测，准确度与精密度基本满足要求，可用于血清 中多粘菌素B1和多粘菌素B2的定量分析，为多粘菌素B1和多粘菌素B2浓度监测 提供简单快速的检测方法。本发明的分析时间为3min，以一天24小时计算，本方法 能够多测定190份样品，效率高，适合大批量的样本处理。
附图说明
图1左边示出了W3的多粘菌素B1的MRM谱图；右边示出了W2的多粘菌素 B1的MRM谱图；
图2左边示出了W3的多粘菌素B2的MRM谱图；右边示出了W2的多粘菌素 B2的MRM谱图；
图3示出了待测样品的MRM谱图；
图4示出了多粘菌素B1的标准曲线图；
图5示出了多粘菌素B2的标准曲线图。
具体实施方式
除非另有说明、从上下文暗示或属于现有技术的惯例，否则本申请中所有的份数和百分比都基于重量，且所用的测试和表征方法都是与本申请的提交日期同步的。在 适用的情况下，本申请中涉及的任何专利、专利申请或公开的内容全部结合于此作为 参考，且其等价的同族专利也引入作为参考，特别这些文献所披露的关于本领域中的 合成技术、产物和加工设计、聚合物、共聚单体、引发剂或催化剂等的定义。如果现 有技术中披露的具体术语的定义与本申请中提供的任何定义不 一致，则以本申请中提供的术语定义为准。
本申请中的数字范围是近似值，因此除非另有说明，否则其可包括范围以外的数值。数值范围包括以1个单位增加的从下限值到上限值的所有数值，条件是在任意较 低值与任意较高值之间存在至少2个单位的间隔。例如，如果记载组分、物理或其它 性质(如分子量，熔体指数等)是100至1000，意味着明确列举了所有的单个数值， 例如100，101，102等，以及所有的子范围，例如100到166，155到170，198到200 等。对于包含小于1的数值或者包含大于1的分数(例如1.1，1.5等)的范围，则适 当地将1个单位看作0.0001，0.001，0.01或者0.1。对于包含小于10(例如1到5) 的个位数的范围，通常将1个单位看作0.1。这些仅仅是想要表达的内容的具体示例， 并且所列举的最低值与最高值之间的数值的所有可能的组合都被认为清楚记载在本申 请中。
关于化学化合物使用时，除非明确地说明，否则单数包括所有的异构形式，反之亦然(例如，“己烷”单独地或共同地包括己烷的全部异构体)。另外，除非明确地 说明，否则用“一个”，“一种”或“该”形容的名词也包括其复数形式。
术语“包含”，“包括”，“具有”以及它们的派生词不排除任何其它的组分、 步骤或过程的存在，且与这些其它的组分、步骤或过程是否在本申请中披露无关。为 消除任何疑问，除非明确说明，否则本申请中所有使用术语“包含”，“包括”，或 “具有”的组合物可以包含任何附加的添加剂、辅料或化合物。相反，出来对操作性 能所必要的那些，术语“基本上由……组成”将任何其他组分、步骤或过程排除在任 何该术语下文叙述的范围之外。术语“由……组成”不包括未具体描述或列出的任何 组分、步骤或过程。除非明确说明，否则术语“或”指列出的单独成员或其任何组合。
为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。
实施例
以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实 施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开 的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明 的精神或范围。
除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并 入。
那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的 发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。
方法学研究实验的样本来自于杭州度安医学检验实验室有限公司送检的血清，血浆样本。
本发明所采用的仪器设备包括：
Sciex 4500MD三重四级杆质谱仪(美国，Sciex公司)，包括岛津高效液相色谱系 统(日本，Shimadzu Scientific公司)；
KQ-500E超声波清洗器(中国，昆山市超声仪器有限公司)；
1-14KS/3-18KS台式高速冷冻离心机(德国，SIGMA)；
EVortex-Genie2涡旋混合器(美国，Scientific Industries Company)；
Cascada I超纯水制备系统(加拿大，颇尔富迪生物分析仪器有限公司)；
QUINTIX125D-1CN电子天平(德国，赛多利斯科学仪器有限公司)。
本发明所使用的试剂和耗材包括：甲醇：纯度≥98％，HPLC级(货号1.06007.4008，Merk，Germany)；甲酸：纯度≥98.0％，色谱级(货号F112034-100mL，阿拉丁，中 国)；乙腈：纯度≥99.9％，HPLC级(货号1.00030.4000，Merk，Germany)；250 μL 96孔板及密封垫购自博纳艾杰尔；1.5mL离心管购自Axygen；移液器(德国， EPPENDORF)。
本发明的标准品：多黏菌素B1(PolyMyxin B1，PLB1，95％，厂家：TRC，含盐， 换算因子：1.234)；多黏菌素B2(PolyMyxin B2，PLB2，95％，厂家：TRC，含盐， 换算因子：1.256)；
实施例1
一种基于LC-MS的多黏菌素B1、B2的检测方法，包括以下步骤：
(1)单储备液的配制
多黏菌素B1单标储备液由12.34mg的多黏菌素B1用1mL水溶解后，用甲醇定 容到10mL得到；多黏菌素B2单标储备液由12.56mg的多黏菌素B2用1mL水溶解 后，用甲醇定容到10mL得到，具体见表1。
表1，单储备液的配制
(2)混标储备液的配制
由80μL多黏菌素B1单标储备液和40μL多黏菌素B2单标储备液混合而成； 所述混标储备液最高点A，B组(W1)的配制如表2所示。
表2，混标储备液最高点A，B组(W1)的配制
(3)标准品的配制
由W1和空白基质配制而成；充分混匀W1，逐级稀释得到各个浓度的标准品， 配制方法见表3，浓度见表5，50μL分装后密封保存于-80℃冰箱。(单位均为μg/mL)
表3，标准品的配制
| 目标物 | W2 | W3 | W4 | W5 | W6 | W7 | W8 | W9 |
| 加入量(μL) | 700W1 | 400W1 | 200W1 | 100W1 | 160W1 | 500W6 | 250W6 | 150W6 |
| 空白基质(μL) | 300 | 600 | 800 | 900 | 1840 | 500 | 750 | 1050 |
(4)质控品的配制
用空白基质稀释W1，分别得到高浓度质控(HQC)、中浓度质控(MQC)和低 浓度质控(LQC)样品，配制方法见表4，浓度见表5。
表4，质控样品配制
| HQC | MQC | LQC | |
| 加入量(μL) | 800W1 | 200W1 | 50W1 |
| 空白基质(μL) | 200 | 800 | 950 |
表5，标准品以及质控品的浓度
| 项目 | W1 | W2 | W3 | W4 | W5 | W6 | W7 | W8 | W9 | QCL | QCM | QCH |
| PLB1(μg/mL) | 20 | 14 | 8 | 4 | 2 | 1.6 | 0.8 | 0.4 | 0.2 | 4 | 4 | 16 |
| PLB1(μg/mL) | 10 | 7 | 4 | 2 | 1 | 0.8 | 0.4 | 0.2 | 0.1 | 0.5 | 2 | 8 |
(5)血清样本的采集与处理
用真空负压黄色帽采血管(分离胶)采集空腹多黏菌素B服用者(用药者需在持 续用药3天以上的第四次服药前和服药后2小时分别采血)的静脉血0.5-3.0mL，获得 血清标本；并在2h内采用离心沉淀法(4000rpm/min，10min)分离血清，分装，并注 意避光保存。
(6)待测样品制备
精密量血清样本50μL分别置于洁净离心管中；分别加入200μL的沉淀剂，充 分混匀5min，4℃的条件下以转速为12000rpm离心5min；分别吸取上清液150μL 置于96孔板中，即可得到待测样品；其中，沉淀剂由10ml甲醇、20ml乙腈和30μL 甲酸充分混匀得到。
标准品、质控品进行上述同样的处理。
(7)仪器检测
使用三重四级杆质谱仪，对待测样品进行分析检测。
液相色谱条件如下：
色谱柱：ACE Excel-2 C18-PFP柱，100×2.1mm，粒径2.6μm；
流动相A：0.1％甲酸水溶液；
流动相B：0.1％甲酸乙腈溶液；
强洗溶液：50％异丙醇；
采用梯度洗脱，流速为0.4mL/min，柱温为40℃，进样2μL。
梯度洗脱的洗脱梯度如下：0-0.3min，流动相A体积分数保持85％，流动相B体积分数保持15％；0.3-1.5min，流动相A体积分数由85％下降至40％，流动相B体积分数 由15％上升至60％；1.5-1.9min，流动相A体积分数保持40％，流动相B体积分数保 持60％；1.9-2min，流动相A体积分数由40％上升至85％，流动相B体积分数由60％ 下降至15％；保持流动相A和流动相B的体积分数到3min停止。
质谱的条件如下：离子源：电喷雾离子源，正离子模式；毛细管电压：5500V； 离子源温度(TEM)：450℃；离子源雾化气(GS1)：50psi；离子源加热辅助气(GS2)： 50psi；气帘气(CUR)：30psi；碰撞气(CAD)：8psi；扫描模式：MRM。通过注 射标稀释标准品溶液进行质谱参数优化，条件如下表6所示：
表6，定量离子对信息
如图1和图2所示，在该检测条件下，W2和W3中的PLB1的出峰时间在1.76min； PLB2的出峰时间在1.72min.
如图3所示，多粘菌素B1和多粘菌素B2在此检测条件下能够相对分离，并且多 粘菌素B1具有明显的识别特性。本发明通过对目标物的出峰时间和离子对进行检测， 灵敏度高，并且无需额外添加内标物就能够达到准确定量。
(8)定量计算
利用检测后的W1-W9的标准品绘制标准曲线方程，以标准品浓度为X轴，峰面 积为Y轴，进行线性回归分析，得到标准曲线和标准曲线方程。标准曲线方程如下表 7所示；标准曲线如图4和图5所示。
表7，标准曲线方程
通过标准曲线计算出PLB1和PLB2的浓度，根据计算公式为AUC： -1.346+12.096*C0h+12.460*C2h；C0h＝C0hPLB1+C0hPLB2，C2h＝C2hPLB1+C2hPLB2通过 仪器软件处理数据。
对超限数据进行原因查找，并进行复测重分析处理；对超过标曲最高点浓度的样品进行稀释处理，用空白基质进行稀释，根据测试的结果进行估算，选择合适的稀释 倍数(2倍，5倍，10倍)；低于标曲最低点浓度的样品，按照实际值出报告；低于 检出限的样品，按照未检出出报告。
对本发明检测方法的精密度和准确度进行检测：
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术 人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书 所限定的范围。
Claims (9)
1.一种基于LC-MS的多黏菌素B1、B2的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
获得待测样品，利用液相色谱-串联质谱技术对待测样品进行检测；
其中，液相色谱条件如下：
色谱柱：ACE Excel-2 C18-PFP柱，100×2.1mm，粒径2.6μm；
流动相A：0.1％甲酸水溶液；
流动相B：0.1％甲酸乙腈溶液；
强洗溶液：50％异丙醇；
采用梯度洗脱，流速为0.4mL/min，柱温为40℃，进样2μL；其中，所述梯度洗脱的洗脱梯度如下：0-0.3min，流动相A体积分数保持85％，流动相B体积分数保持15％；0.3-1.5min，流动相A体积分数由85％下降至40％，流动相B体积分数由15％上升至60％；1.5-1.9min，流动相A体积分数保持40％，流动相B体积分数保持60％；1.9-2min，流动相A体积分数由40％上升至85％，流动相B体积分数由60％下降至15％；保持流动相A和流动相B的体积分数到3min停止。
2.根据权利要求1所述的一种基于LC-MS的多黏菌素B1、B2的检测方法，其特征在于，质谱的条件如下：离子源：电喷雾离子源，正离子模式；毛细管电压：5500V；离子源温度：450℃；离子源雾化气：50psi；离子源加热辅助气：50psi；气帘气：30psi；碰撞气：8psi；扫描模式：MRM。
3.根据权利要求1所述的一种基于LC-MS的多黏菌素B1、B2的检测方法，其特征在于，所述检测方法还包括获得待测样本的步骤：精密量取生物样品50μL置于洁净离心管中；加入沉淀剂，充分混匀，4℃的条件下以转速为12000rpm离心5min；吸取上清液150μL置于96孔板中，即可得到待测样品。
4.根据权利要求3所述的一种基于LC-MS的多黏菌素B1、B2的检测方法，其特征在于，所述生物样品选自人血清样品或人血浆样品。
5.根据权利要求3所述的一种基于LC-MS的多黏菌素B1、B2的检测方法，其特征在于，所述沉淀剂为浓度为1％的甲酸甲醇溶液与乙腈按体积比为1：2混合得到。
6.根据权利要求1所述的一种基于LC-MS的多黏菌素B1、B2的检测方法，其特征在于，所述检测方法还包括获得标准品和质控品，并进行检测的步骤。
7.根据权利要求6所述的一种基于LC-MS的多黏菌素B1、B2的检测方法，其特征在于，所述标准品和质控品分别由混标储备液与空白基质逐级稀释得到；所述混标储备液由多黏菌素B1单标储备液和多黏菌素B2单标储备液按体积比2：1混合而成，其中多黏菌素B1单标储备液的浓度为1mg/mL；多黏菌素B2单标储备液的浓度为1mg/mL。
8.根据权利要求7所述的一种基于LC-MS的多黏菌素B1、B2的检测方法，其特征在于，所述空白基质为空白人血清或过滤人血清。
9.一种基于LC-MS/MS检测多黏菌素B1和多黏菌素B2的试剂盒，其特征在于，包括混合储备液、流动相A、流动相B、沉淀剂，其中，所述所述混标储备液由多黏菌素B1单标储备液和多黏菌素B2单标储备液按体积比2：1混合而成，其中多黏菌素B1单标储备液的浓度为1mg/mL；多黏菌素B2单标储备液的浓度为1mg/mL，所述流动相A为0.1％甲酸水溶液；所述流动相B为0.1％甲酸乙腈溶液，所述沉淀剂由浓度为1％的甲酸甲醇溶液与乙腈按体积比为1：2混合得到。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210476003.7A CN114814033A (zh) | 2022-04-29 | 2022-04-29 | 一种基于lc-ms的多黏菌素b1、b2的检测方法及试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210476003.7A CN114814033A (zh) | 2022-04-29 | 2022-04-29 | 一种基于lc-ms的多黏菌素b1、b2的检测方法及试剂盒 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN114814033A true CN114814033A (zh) | 2022-07-29 |
Family
ID=82510628
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210476003.7A Pending CN114814033A (zh) | 2022-04-29 | 2022-04-29 | 一种基于lc-ms的多黏菌素b1、b2的检测方法及试剂盒 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN114814033A (zh) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111665307A (zh) * | 2020-07-14 | 2020-09-15 | 南京品生医疗科技有限公司 | 一种检测血清中多粘菌素b1和多粘菌素b2浓度的试剂盒 |
| CN111830153A (zh) * | 2020-07-14 | 2020-10-27 | 南京品生医学检验实验室有限公司 | 一种检测血清中多粘菌素b1和多粘菌素b2浓度的方法 |
| WO2021135732A1 (zh) * | 2020-01-02 | 2021-07-08 | 上海上药第一生化药业有限公司 | 多黏菌素b组分或其盐及其制备方法和应用 |
| CN114791470A (zh) * | 2022-06-24 | 2022-07-26 | 北京和合医学诊断技术股份有限公司 | 一种高效液相色谱串联质谱检测血液中多粘菌素的方法和应用 |
-
2022
- 2022-04-29 CN CN202210476003.7A patent/CN114814033A/zh active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2021135732A1 (zh) * | 2020-01-02 | 2021-07-08 | 上海上药第一生化药业有限公司 | 多黏菌素b组分或其盐及其制备方法和应用 |
| CN111665307A (zh) * | 2020-07-14 | 2020-09-15 | 南京品生医疗科技有限公司 | 一种检测血清中多粘菌素b1和多粘菌素b2浓度的试剂盒 |
| CN111830153A (zh) * | 2020-07-14 | 2020-10-27 | 南京品生医学检验实验室有限公司 | 一种检测血清中多粘菌素b1和多粘菌素b2浓度的方法 |
| CN114791470A (zh) * | 2022-06-24 | 2022-07-26 | 北京和合医学诊断技术股份有限公司 | 一种高效液相色谱串联质谱检测血液中多粘菌素的方法和应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 梁雪琪等: "液相色谱―串联质谱法测定牛奶中粘杆菌素和多粘菌素B的残留量", 《现代农业科技》 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN110554123A (zh) | 一种快速检测全血中免疫抑制剂的方法、试剂盒及其应用 | |
| CN108802162B (zh) | 通过内部标准物质谱检测微生物的方法 | |
| WO2023102741A1 (zh) | 一种药物中亚硝胺类杂质的检测方法 | |
| CN111398450A (zh) | 超高效液相色谱串联质谱技术检测尿液中8种儿茶酚胺及其代谢物的试剂盒 | |
| CN111766311A (zh) | 一种超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中抗结核病药物的方法 | |
| CN113899834B (zh) | 一种药物中亚硝胺类杂质的检测方法 | |
| CN113917049A (zh) | 临床研究血浆样本中氯丙嗪及代谢物浓度的生物分析方法 | |
| CN111458417B (zh) | 联合检测待测样品中多种抗生素的方法及试剂盒 | |
| CN102337341A (zh) | Maldi-tof质谱双内标及其定量检测方法 | |
| CN111830153A (zh) | 一种检测血清中多粘菌素b1和多粘菌素b2浓度的方法 | |
| CN114814033A (zh) | 一种基于lc-ms的多黏菌素b1、b2的检测方法及试剂盒 | |
| CN114740127A (zh) | 一种基于lc-ms/ms检测5种抗肿瘤药物的试剂盒和方法 | |
| CN114740125A (zh) | 一种基于lc-ms的10种心血管药物血清的检测方法及其试剂盒 | |
| CN114624361A (zh) | 同时测定人血浆中别嘌醇和氧别嘌醇浓度的方法 | |
| CN112505223B (zh) | 一种同时检测食品中毒黄素和米酵菌酸含量的方法 | |
| CN111474279B (zh) | 检测大环内酯抗生素化合物的方法和试剂盒 | |
| CN113109493A (zh) | 一种高效液相质谱联用测定血浆中利福平的方法 | |
| CN108918694B (zh) | 一种msx残留的hplc柱前衍生化检测方法 | |
| CN111413439A (zh) | 一种快速亲水相互作用色谱-串联质谱法测定血浆中二甲双胍的方法 | |
| CN115201344A (zh) | 测定小麦中呕吐毒素和/或其乙酰化产物含量的方法 | |
| CN111665307A (zh) | 一种检测血清中多粘菌素b1和多粘菌素b2浓度的试剂盒 | |
| CN114839295A (zh) | 一种基于lc-ms的人血清中阿米卡星的检测方法 | |
| CN114965759A (zh) | 一种基于lc-ms/ms检测32种抗生素的试剂盒和方法 | |
| CN115144494B (zh) | 一种哺乳动物乳中低聚糖的检测方法 | |
| CN114778746B (zh) | 液相色谱串联质谱法检测血液中9种生物碱的方法和应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20220729 |