CN106324144B - 亲水作用色谱-串联质谱法检测乳粉及婴幼儿配方乳粉中氯酸盐、高氯酸盐和溴酸盐的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种亲水作用色谱‑串联质谱法用于检测乳粉及婴幼儿配方乳粉中氯酸盐、高氯酸盐和溴酸盐的检测方法，属于分析检测领域。该方法用乙醇沉淀蛋白、基质分散法进行样品净化，采用新型亲水作用色谱分离材料，结合亲水作用色谱‑串联质谱检测技术分离和分析乳粉及婴幼儿配方乳粉中氯酸盐、高氯酸盐和溴酸盐，具有操作简单、省时、灵敏度高、重复性较好、定性定量准确的优点。乳粉及婴幼儿配方乳粉中氯酸盐、高氯酸盐和溴酸盐的方法回收率为90.1％～110％，相对标准偏差均小于6.7％，所建立的分析方法可用于乳粉及婴幼儿配方乳粉中氯酸盐、高氯酸盐和溴酸盐的检测。

Description

亲水作用色谱-串联质谱法检测乳粉及婴幼儿配方乳粉中氯 酸盐、高氯酸盐和溴酸盐的方法

技术领域

本发明属于食品分析技术领域，涉及乳粉及婴幼儿配方乳粉中氯酸盐、高氯酸盐和溴酸盐的同时检测方法，具体涉及一种亲水作用色谱-串联质谱法检测乳粉及婴幼儿配方乳粉中氯酸盐、高氯酸盐和溴酸盐的方法。

背景技术

高氯酸盐、氯酸盐和溴酸盐属于污染物，美国环保局制订的安全限制标准是高氯酸盐在饮用水中的含量为24.5µg/L，我国GB 5749-2006生活饮用水卫生标准规定其中溴酸盐和氯酸盐的限量分别是0.01和0.7mg/L，其他食品中暂无相关限量。乳粉及婴幼儿配方乳粉的原料为生乳，经过浓缩、添加营养成分等多步生产工艺，其中原料乳可能含有微量的高氯酸盐、氯酸盐和溴酸盐，而且在生产过程中可能使用消毒剂对管道、器皿进行清洗，导致终产品中含有一定量的高氯酸盐、氯酸盐和溴酸盐。高氯酸盐被广泛用于军工、核电、纺织印染、电镀工作等领域，具有强稳定性、易溶于水等特点，已成为普遍关注的环境污染物。高氯酸盐是一种甲状腺毒素，影响胎儿、儿童脑部的发育，甚至造成脑部的损伤。

食品在加工包装过程中涉及各种器皿的清洗和消毒，氯酸盐为二氧化氯原料带入，对人体有害。国际癌症研究中心（IARC）已将其列为中等毒性化合物。

溴酸盐是一种具有致癌性的饮用水消毒副产物，也是一种面粉添加剂，能显著改善面粉制品的烘焙效果。1992 年世界卫生组织确认溴酸根是一种氧化性致癌物，2005 年7月1日我国已全面禁止使用溴酸钾作为面粉添加剂。

目前，这三种阴离子的检测技术主要是离子色谱或离子色谱-质谱法，也有少量采用反相液相色谱或者阴离子交换色谱对其中的一种或两种进行分离，亲水作用色谱相比上述技术具有更好的质谱兼容性，因此发展乳粉及婴幼儿配方乳粉中这三种阴离子的高灵敏度检测方法，采用新型色谱分离材料，建立三种阴离子同时检测的亲水作用色谱-质谱/质谱检测方法，将提高检测通量和灵敏度，并可在此基础上调研其中相关物质的含量范围，为风险评估提供有效数据，为制定相关限量、控制风险奠定基础，更好的服务监管。

发明内容

本发明的目的是针对现有检测技术的不足，采用简单、高通量前处理方法，利用亲水作用色谱实现对目标阴离子的有效保留，并利用亲水作用色谱与质谱的高兼容性，实现质谱的高灵敏度检测，建立简便、实用、可行的乳粉及婴幼儿配方乳粉中氯酸盐、高氯酸盐和溴酸盐的高灵敏度测定方法。

本发明的目的是通过以下方案来实现的：

一种亲水作用色谱-串联质谱法检测乳粉及婴幼儿配方乳粉中氯酸盐、高氯酸盐和溴酸盐的方法，包括以下步骤：

1）样品的提取及净化：取样品经水提取、乙醇沉淀蛋白后，采用固相基质分散去除脂类杂质，得到待测样品溶液，备用；

2）标准溶液的配制：分别取氯酸盐标准品、高氯酸盐标准品和溴酸盐标准品，采用水制备为100µg/mL标准溶液，分别再用水逐级稀释得到1～100ng/mL浓度的加标用标准溶液，备用。

3）配制基质加标溶液：取不含氯酸盐、高氯酸盐和溴酸盐的空白待测样品溶液，然后加入氯酸盐、高氯酸盐和溴酸盐的加标用标准溶液，配制为一系列的基质加标溶液，备用；

4）样品的分析：将步骤1）待测样品溶液，采用基于亲水作用色谱原理的高效液相色谱对待测组分进行分离，三重四级杆串联质谱检测，得样品谱图，检测氯酸盐、高氯酸盐和溴酸盐中三种阴离子；

5）绘制基质加标曲线：采用步骤4）检测条件测定步骤3）配制的不同浓度的基质加标样品溶液，得到标准谱图，形成基质加标曲线，采用基质加标外标法同时实现定性定量分析，根据标准谱图中保留时间确定步骤4）待测组分溶液中氯酸盐、高氯酸盐和溴酸盐种类，以外标法计算步骤4）待测组分溶液中氯酸盐、高氯酸盐和溴酸盐的含量。

步骤1）中，所述的提取及净化具体方法为：称取样品1.0 g于15 mL离心管中，准确加入5.0 mL水，混匀，超声提取15min。准确移取1.0 mL溶液于另一离心管中，加入1.0 mL无水乙醇，混匀后，加入0.2 g C18填料，混匀，8000转/分钟离心5分钟，取清液过0.22 µm有机滤膜，得到待测样品溶液。

步骤4）中，

高效液相色谱条件：

色谱柱：TE-Cys，100mm×2.1mm i. d，5 µm；流动相A：90%甲醇-水-10mM甲酸铵；流动相B：水-10mM甲酸铵；流动相流速：0.2mL/min；梯度洗脱；柱温：30-35℃；进样量：2µL；

质谱分析条件：

离子化模式：ESI- ；喷雾电压：-4.5kV；脱溶剂气温度：500 ℃；雾化气(GS 1)：55psi；辅助雾化气(GS 2)：55 psi；气帘气：45 psi；碰撞气：12 psi。扫描方式：多反应监测（MRM）。

步骤4）中，高效液相色谱，梯度洗脱条件为

。

上述亲水作用色谱-串联质谱法检测乳粉及婴幼儿配方乳粉中氯酸盐、高氯酸盐和溴酸盐的方法，测得氯酸盐、高氯酸盐和溴酸盐的检出限均为10μg/kg。

本发明亲水作用色谱-串联质谱法检测乳粉及婴幼儿配方乳粉中氯酸盐、高氯酸盐和溴酸盐的方法，氯酸盐的回收率在91.3%-106.9%范围内，高氯酸盐回收率在90.1%-110%范围内，溴酸盐回收率在91.2%-104.7%范围内，测定结果均具有良好的重现性，氯酸盐、高氯酸盐和溴酸盐的RSD分别为3.27%、6.70%和5.24%。本发明方法能够精确测定乳粉及婴幼儿配方乳粉中氯酸盐、高氯酸盐和溴酸盐的含量。

本发明的有益效果：

(1)操作简单、通量高

样品经水提取、乙醇沉淀蛋白后，采用固相基质分散去除脂类杂质，结合亲水作用色谱-串联质谱法分析测定食品中的氯酸盐、高氯酸盐和溴酸盐。与过去文献上报道的利用离子色谱或者阴离子交换液相色谱的测定方法相比，省去了SPE柱净化过程，具有操作简单的特点，而且实现了三种阴离子的同时检测，检验通量提高三倍以上。

(2)大幅降低检测成本

之前的氯酸盐、高氯酸盐和溴酸盐检测方法标准（SN/T 4049-2014、SN/T 4089-2015、GB/T 20188-2006）需要三次提取、三根SPE柱净化、三次检测，而本发明只需提取、沉淀蛋白、固相基质分散三个步骤，即可上机测试，节省了原方法中成本最高的固相萃取柱，检测成本不到原来的1/10。

(3)定性定量准确

本发明采用亲水作用色谱分离，三重四级杆串联质谱法检测，基质加标外标法定量，结果准确度高且稳定，克服了原来离子色谱定量可能存在的干扰和假阳性问题，可用于乳粉及婴幼儿配方乳粉中氯酸盐、高氯酸盐和溴酸盐的同时定性定量。

（4）检测灵敏度高

之前的氯酸盐、高氯酸盐和溴酸盐检测方法标准（SN/T 4049-2014、SN/T 4089-2015、GB/T 20188-2006）检出限分别是0.5mg/kg, 3.0µg/kg和0.5mg/kg，本方法三种阴离子的检出限均为10µg/kg，除高氯酸盐外，其他两种阴离子灵敏度均较现有标准方法提高50倍。

附图说明

图1为氯酸盐、高氯酸盐和溴酸盐标准溶液的MRM色谱图；

图2为氯酸盐、高氯酸盐和溴酸盐的空白基质溶液MRM色谱图；

图3为氯酸盐、高氯酸盐和溴酸盐的基质加标溶液MRM色谱图。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行进一步说明：

实施例1

婴幼儿配方乳粉中氯酸盐、高氯酸盐和溴酸盐检测：

1、材料与试剂

色谱柱： TE-Cys（100mm×2.1mm i. d, 5 µm)（中国科学院大连化学物理研究所研制）。

氯酸盐标准品、高氯酸盐标准品和溴酸盐标准品分别购自济南众标科技有限公司、上海安谱实验科技股份有限公司和中国计量科学研究院，浓度均为1mg/mL；甲醇、甲酸、甲酸铵（色谱纯）；超纯水：Mili-Q超纯水机制备；氮气（>99.999%）。

2、仪器和设备

超高效液相色谱-串联质谱仪，配有电喷雾（ESI）电离源(ABI 5500，美国AB公司)，液相色谱分离模式为亲水作用色谱，检测器为三重四级杆串联质谱；分析天平：感量为0.01g；离心机。

3、亲水作用高效液相色谱-串联质谱法检测婴幼儿配方乳粉中氯酸盐、高氯酸盐和溴酸盐的方法，步骤为：

1）样品的提取及净化：称取婴幼儿配方乳粉1.0 g于15 mL离心管中，准确加入5.0mL水，混匀，超声提取15min。准确移取1.0 mL溶液于另一离心管中，加入1.0 mL无水乙醇，混匀后，加入0.2 g C18填料，混匀，8000转/分钟离心5分钟，取清液过0.22 µm有机滤膜，得到待测样品溶液，备用。

2）标准溶液的配制： 分别准确移取1mL氯酸盐标准品、高氯酸盐标准品和溴酸盐标准品的标准储备溶液（1mg/mL）于10mL容量瓶中，用水稀释得到浓度为100µg/mL的标准溶液，分别再用水逐级稀释得到1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL和100ng/mL等七个浓度水平的加标用标准溶液，备用；

3）配制基质加标溶液：取不含氯酸盐、高氯酸盐和溴酸盐的空白待测样品溶液，然后加入步骤2）氯酸盐、高氯酸盐和溴酸盐的加标用标准溶液，配制为一系列的基质加标溶液，备用；

4）样品的分析：将步骤1）待测样品溶液，采用基于亲水作用色谱原理的高效液相色谱对待测组分进行分离，三重四级杆串联质谱检测，得样品谱图，检测氯酸盐、高氯酸盐和溴酸盐中三种阴离子；

高效液相色谱和质谱条件

i）高效液相色谱条件

色谱柱：TE-Cys（100mm×2.1mm i. d, 5 µm)；流动相：90%甲醇/水溶液（含10mM甲酸铵）（A）、水（含10mM甲酸铵）（B），梯度洗脱，梯度条件见表1；柱温：30℃，进样体积：2μL。

表1 液相色谱梯度条件

ii）质谱条件

离子化模式：ESI^-；喷雾电压：-4.5kV；脱溶剂气温度：500 ℃；雾化气(GS 1)：55psi；辅助雾化气(GS 2)：55 psi；气帘气：45 psi；碰撞气：12 psi。扫描方式：多反应监测（MRM）

每种季铵盐的定性定量离子对、裂解电压、驻留时间及碰撞能量见表2。

表2 氯酸盐、高氯酸盐和溴酸盐的质谱参数

5）绘制基质加标曲线：采用步骤4）检测条件测定步骤3）配制的不同浓度的基质加标样品溶液，得到标准谱图，形成基质加标曲线，采用基质加标外标法同时实现定性定量分析，根据标准谱图中保留时间确定步骤4）待测组分溶液中氯酸盐、高氯酸盐和溴酸盐种类，以外标法计算步骤4）待测组分溶液中氯酸盐、高氯酸盐和溴酸盐的含量。

超高效液相色谱-串联质谱仪进行检测时，由于基质效应的影响，导致目标化合物发生离子增强或抑制作用，因此采用基质加标外标法定量。取空白样品，准确移取添加氯酸盐、高氯酸盐和溴酸盐的标准储备液适量，配制一系列的基质加标样品，按照步骤3）制备基质加标溶液，形成基质加标曲线。

4、定性及定量结果分析

4.1基质加标曲线

采用不含氯酸盐、高氯酸盐和溴酸盐的婴幼儿配方乳粉样品，分别加入1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL和100ng/mL等七个浓度水平的标准溶液，按照上述方法步骤进行检测，获得质量色谱图，质量色谱图中定量离子对的色谱峰面积y为纵坐标，以基质加标溶液相应离子的浓度值（ng/mL）x为横坐标，作标准曲线，获得氯酸盐、高氯酸盐和溴酸盐的线性回归方程（如表3所示）。

表3 婴幼儿配方乳粉基质加标曲线

4.2 样品检测

（1）定性分析

实施例1待测婴幼儿配方乳粉样品预处理为待测样品溶液，用超高效液相色谱-串联质谱仪，按照上述方法给出的步骤测定，获得样品质量色谱图。

若样品质量色谱图中存在与标准质量色谱图中的色谱峰相应的色谱峰；则表明样品中含有氯酸盐、高氯酸盐或溴酸盐。相应的色谱峰是指：样品色谱峰的保留时间与标准色谱峰的保留时间比较，变化范围在±2.5％之内；而且试样色谱峰的相对丰度比与相应标准色谱峰相比，偏差不超过表4规定的范围。标准色谱峰是指标准质量色谱图中的目标物的色谱峰。

实施例1待测婴幼儿配方乳粉样品中分析可知含有氯酸盐、高氯酸盐，不含溴酸盐。

表4定性时相对离子丰度的最大允许偏差

（2）定量计算

采用外标法定量：根据样品质量色谱图中定量离子色谱峰的面积，采用表3的回归方程，计算得到实施例1待测婴幼儿配方乳粉样品中氯酸盐、高氯酸盐和溴酸盐的浓度分别为351µg/kg，162µg/kg和未检出（＜10µg/kg）。

实施例2

乳粉中氯酸盐、高氯酸盐和溴酸盐检测：

采用跟实施例1相同的实验条件和定性定量方法，对乳粉中的氯酸盐、高氯酸盐和溴酸盐进行检测。得到的氯酸盐、高氯酸盐和溴酸盐的线性回归方程（如表5所示）。

表5乳粉基质加标曲线

采用与实施例1相同的定性定量方法，计算得到氯酸盐、高氯酸盐和溴酸盐的浓度分别为851µg/kg，146µg/kg和35µg/kg。

本发明检测方法回收率、精密度和检出限测定：

空白样品：婴幼儿配方乳粉（婴配）、乳粉和羊乳粉

采用基质加标外标法定量，统计氯酸盐、高氯酸盐和溴酸盐的回收率（回收率：实测值/加入量*100％），结果如表5所示。由表5可见，氯酸盐的回收率在91.3%-106.9%范围内，高氯酸盐回收率在90.1%- 110%范围内，溴酸盐回收率在91.2%-104.7%范围内。

对不同样品重复测定6次，测定结果均具有良好的重现性，氯酸盐、高氯酸盐和溴酸盐的RSD分别为3.27%、6.70%和5.24%。

采用在空白样品中添加目标化合物的方法，测得氯酸盐、高氯酸盐和溴酸盐的检出限均为10 μg/kg。

表6 加标回收实验结果

Claims (4)

1.一种亲水作用色谱-串联质谱法检测乳粉及婴幼儿配方乳粉中氯酸盐、高氯酸盐和溴酸盐的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）样品的提取及净化：取样品经水提取、乙醇沉淀蛋白后，采用固相基质分散去除脂类杂质，得到待测样品溶液，备用；

2）标准溶液的配制：分别取氯酸盐标准品、高氯酸盐标准品和溴酸盐标准品，采用水制备为100µg/mL标准溶液，分别再用水逐级稀释得到1～100ng/mL浓度的加标用标准溶液，备用；

3）配制基质加标溶液：取不含氯酸盐、高氯酸盐和溴酸盐的空白待测样品溶液，然后加入氯酸盐、高氯酸盐和溴酸盐的加标用标准溶液，配制为一系列的基质加标溶液，备用；

4）样品的分析：将步骤1）待测样品溶液，采用基于亲水作用色谱原理的高效液相色谱对待测组分进行分离，三重四级杆串联质谱检测，得样品谱图，检测氯酸盐、高氯酸盐和溴酸盐中三种阴离子；

所述高效液相色谱条件：

色谱柱：TE-Cys，100mm×2.1mm i. d，5 µm；流动相A：90%甲醇-水-10mM甲酸铵；流动相B：水-10mM甲酸铵；流动相流速：0.2mL/min；梯度洗脱；柱温：30-35℃；进样量：2µL；

所述的梯度洗脱，条件为

；

质谱分析条件：

离子化模式：ESI- ；喷雾电压：-4.5kV；脱溶剂气温度：500 ℃；雾化气(GS 1)：55 psi；辅助雾化气(GS 2)：55 psi；气帘气：45 psi；碰撞气：12 psi；

扫描方式：多反应监测（MRM）；

5）绘制基质加标曲线：采用步骤4）检测条件测定步骤3）配制的不同浓度的基质加标样品溶液，得到标准谱图，形成基质加标曲线，采用基质加标外标法同时实现定性定量分析，根据标准谱图中保留时间确定步骤4）待测组分溶液中氯酸盐、高氯酸盐和溴酸盐种类，以外标法计算步骤4）待测组分溶液中氯酸盐、高氯酸盐和溴酸盐的含量。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1）中，所述的提取及净化具体方法为：称取样品1.0 g于15 mL离心管中，准确加入5.0 mL水，混匀，超声提取15min；准确移取1.0mL溶液于另一离心管中，加入1.0 mL无水乙醇，混匀后，加入0.2 g C18填料，混匀，8000转/分钟离心5分钟，取清液过0.22 µm有机滤膜，得到待测样品溶液。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：氯酸盐、高氯酸盐和溴酸盐的检出限均为10μg/kg。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：氯酸盐的回收率在91.3%-106.9%范围内，高氯酸盐回收率在90.1%- 110%范围内，溴酸盐回收率在91.2%-104.7%范围内，氯酸盐、高氯酸盐和溴酸盐的RSD分别为3.27%、6.70%和5.24%。