NL8103931A - Werkwijze voor het analyseren van aflatoxinen in aardnoten door middel van hoge-druk-vloeistofchromatografie. - Google Patents

Description

«' f -1- vo 2267

Werkvijze voor het analyseren van. aflatoxinen in aardnoten door middel van hoge-druk-vloeistofchrcmatografie

De uitvinding heeft in het algemeen hetrekking op de kvran-titatieve en kwalitatieve detectie van aflatoxinen in aardnoten en is meer in het bijzonder gericht op een nieuve verbeterde verkvijze voor hetanalyseren van aflatoxinen in aardnoten door middel van 5 hoge-druk-vloeistofchranatografie.

Aflataxine is een hekend carcinogeen dat in voedsel, zoals afkcmstig van planten, hinnendringt als gevolg van de wijze waarop het voedsel vordt verbouvd, gehanteerd of opgeslagen. Aflataxine is geen velbewust toevoegsel maar in dergelijke algemene voedings-10 middelen, als aardnoten en mais een natuurlijke verontreiniging.

Aflatoxine is een algemene tern die hetrekking heeft op een groep van sterk taxische verhindingen die vorden gevomd door de schimmel Aspergillus flavus/parasiticus. Naast de oorspronkelijk gevonden aflatoxinen B1, B2, G1 en G2 zijn tevens een aantal 15 metabolieten cpgespoord vaarvan de structuren zijn onderzocht.

Deze vorden meestal gevomd in het veefsel na innemen door het zoog-dier van de hoofdverbinding B1, hoevel sommige 00k kunnen vorden gevomd door de schimmel of door een chemische behandeling van B1.

Van de vier oorspronkelijke aflatoxinen is B1 het meest algemeen 20 en cmvat gewoonlijk ongeveer 90% van het aflatoxine residu dat in verontreinigde voedingsmiddelen vordt vaargenmen en het is tevens het meest giftig. De biolcgisehe activiteit van aflatoxine B1 is ongeveer gelijk aan die van de andere aflatoxinen.

Teneinde de aanvezigheid van aflatoxinen in voedings-25 produkten zoals aardnoten te detecteren is het algemeen gebruikelijk regeimatige proeven aan monsters van aardnoten uit te voeren in de vora van een kvaiiteitscontrole. De maaentele methodology is echter tamelijk lang, en neemt meestal 2 1/2 uur in beslag, vaarbij de gevoeligheid in het 3-5 dpa. gebied ligt. 3ij voedsel ververkings-30 behandelingen is_ de lange analysetijd onbevredigend aangezien de test v6or de ververking van een lading noten moet vorden uitgevoerd.

Het is veel aantrekkeiijker de mogelijkheid te bezitten regelmatig 8103931 -2- * '* proeven op continue basis uit te voeren zodat deze min of meer ge-lijktijdig met de voedselverwerkingstrappen, zoals blancheren, rooste-ren en dergelijke kunnen worden uitgevoerd.

Het is aldus een hoofddoel van de uitvinding te voorzien 5 in een nieuwe en verbeterde werkwij ze voor. .het onderzoeken van aardnoten op de aanvezigheid van aflataxinen. Het is een ander doel van de uitvinding te voorzien in een nieuwe en verbeterde werkwijze voor het snel en efficient analyseren van aardnoten en dergelijke op de aanvezigheid van aflatoxinen door middel van hoge 10 druk vloeistofchrcmatografie. Het is nog een ander doel van de uitvinding te' voorzien in een werkwijze voor het op betrouvbare en accurate-wijze detecteren welke werkwijze qp continue basis kan worden uitgevoerd.

De uitvinding. heeft aldus betrekking op een werkvijze voor 15 het onderzoeken van aardnoten en dergelijke op de aanvezigheid van aflatoxinen, die deftrappen cmvat van het extraheren van eventuele in een monster van gemalen aardnoten of pindaboter aanvezige aflatoxinen met een methanol-water oplossing onder toepassing van een tissuemizer. Het geextraheerde monster wordt daarna gefiltreerd 20 en een aliquot van het filtraat overgebracht naar een scheidings-trechter. Storende stoffen worden door toevoeging van een zout-oplossing vervijderd. De gecombineerde waterige oplossing wordt daarna geextraheerd. met dichloormethaan. Het dichloormethaanextract wordt daarna drocggedampt, trifluorazijnzuur toegevoegd en het ver-25 kregen residu opgencmen in een mobiele fase. De oplossing wordt daarna gepasseerd door een minikolom voor filtratie en uiteindelijke reiniging. Het aliquot wordt daarna gelnjecteerd in het hoge-druk-vloeistofchromatografiesysteem voor het afscheiden van de vier aflatoxineccmponenten B1, B2, G1 en. 02. De kvantificering wordt uit-• SO gevoerd door toepassing van een fluorescentiedetector. De toevoeging van het trifluorazijnzuur katalyseert de hydratatie van de dubbele band in B1 en C-1 componenten onder vozming van het hemi-acetaal, dat met een grotere intensiteit fluoresceert.

Fig. 1 geeft de chemische structuur van aflatoxine B1 aan; 35 fig· 2 de chsaische structuur van aflatoxine B2; fig. 3 de chemische structuur van aflatoxine G1; fig. k de chemische structuur van aflatoxine G2; 8103931 . -,3- ’ ^ * -- ' - ' fig. 5 is een grafische veergave die een afdruk aangeeft van een hoge-drukvloeistofchrcmatogram vaarin de aflatoxineconcentraties . vorden veergegeven, onder toepassing van de uitvinding, en fig. 6 is een schema van de verkwijze.

5 De analytische procedure als hierin heschreven kan met voordeel worden toegepast bij een voedingsmiddelververking zoals in een fabriek vaar de aardnoten worden ondervorpen aan roosteren en/of blaacheren. Een fabriek van dit type ontvangt in het algemeen de gepelde noten in grote hoeveelheden die nadat zij in het begin gedurende 10 een betrekkelijk korte tijdsperiode in water zijn opgeslagen, warden gereinigd en door een roostoven gepasseert. Ka,het roosteren vorden de noten toegevoerd in blancheermachines, gezuiverd en daama gesor-teerd ter vervijdering van niet-geblancheerde noten of ander afval.

In een dergelijke fabriek kunnen monsters van de noten in verschillende 15 stadia worden verwijderd; het eerst voor het binnentreden in de opslagvaten bij de eerste aflading, vervolgens na de koeltrap van de roostbewerking, direkt na de blancheerbewerking en daama kunnen opnieuw eindmonsters worden verzameld nadat de noten zijn gesorteerd.

De verschillende monsters worden verzameld en volgens de procedure 20 van de uitvinding, zoals hiema beschreven, geanalyseerd. De procedures worden bij voorkeur continu uitgevoerd teneinde een regelmatige actuele infomatie van het gehalte van aflatoxinen in de in bewerking zijnde aardnoten te leveren. Dcordat tijdens de bewerking actuele infonaatie betreffende het aflatcxinegehalte aanwezig is kunnen 25 onmiddellijk correcties worden ondemcmen, voor het geval de aflatoxine-niveaus een aanvaardbare concentratie overschrijden. In de praktijk kan aflatoxine in elke bepaalde lading aardnoten aanwezig zijn in sporen hoeveelheden vaarbij het praktisch niet mogelijk is alle aflatoxinen geheei uit aardnoten of andere voedingsmiadelen te ver-30 wijderen. Door toepassing van de ccmbinatie van zovel autcaaatiscne als manuele sorteringsprocedures en andere technieken kan de hoeveelheid aanvezige aflatoxinen tot een vervaarloosbare hoeveelheid worden teruggebracht, zoals iets in de crde van minderdan 5 delen per milliard.

Hiema voIgt een gedetailleerde beschrijving van de procedure 35 voor het anaiyseren van de aardnootmonsters volgens de uitvinding.

Het is geschikt gebleken aardnoten te gebruiken die tot aardnotenmeel of pasta zijn gemalen en deze in monsters van 50 g elk te anaiyseren.

8103931 , * ... ........-- -- - 1 —— -· " Γ I — — -k-

Het 50 g monster van gemalen aardnoten of pindaboter vordt in een 25Ο ml.centrifugefles geplaatst. Eventueel in het monster aanvezige aflatoxine vorden uit het monster geextraheerd door middel van een methanol/vateroplossing. Dit vordt gedaan door 100 mis van een 80/20 5 methanol/vater (MeOH/HgO).extractie-oplossing aan de 250 ml centrifugefles toe te voegen. Gevonden is dat de toevoeging van bij benadering 5 g cupricarbonaat aan de monsteroplossing effectief is ter ver-wijdering van storende stoffen uit de monsteroplossing, Yervolgens vorden het monster, de methanol vater-oplossing en het cupricarbonaat · goed gemengd. Dit kan vorden uitgevoerd door de fles met de voor-10 afgaande camponenten te plaatsen op een tissuemizer die is ge- prepareerd door deze voor te vassen met vater. Deze heeft de eigen-schappen van een hoge snelheidsmenger en door de bovenstaande com-ponenten gedurende een periode van 1 minuut met hoge snelheid te mengen zal men een grondig mengsel verkrijgen. Het verkregen mengsel 15 is een groenachtige suspensie die vordt gefiltreerd. De filtratie vordt geschikt uitgevoerd door de suspensie te schenken in een trechter gevoerd met een filtreerpapier, zoals Whatman 1 of U filterpapier. Het filtraat vordt verzameld in een 50 ml met maat-strepen voorziene cilinder en typerend vordt door de filtermethode 20 een aliquot van ongeveer 30,0 ml verzameld. Een groenachtig residu dat in het filter achterblijft kan vorden veggevorpen.

Het uit de suspensie vervijderde vloeibare filtraat vordt daama overgebracht naar een scheidingstrechter, op velk tijdstip

O

^0-50 cmJ zoutoplossing, bij voorkeur zinkacetaat, in de trechter 25 vordt toegevoegd. De zoutoplossing vordt toegepast cm storende stoffen uit de.oplossing te vervijderen. Het vloeistof aliquot en de zoutoplossing vorden daama zachthes geverveld teneinde hen te mengen.

Tvee 5 ml-porties van CH^Cl^ vorden uit de vaterige oplos'sing geextraheerd. Het dichloormethaan vordt tveemaal uit de bodem afge-30 voerd en vers dichloormethaan m de top toegevoegd om het aflatoxine uit de vaterige oplossing af te scheiden. De aflatoxinen zijn beter oplosbaar in dichloormethaan dan in de vaterige oplossing en kunnen derhalve uit de bodem van de scheider vorden afgevoerd. De vaterige oplossing die in het bovendeel van de scheidingstrechter achterblijft 35 vordt veggevorpen vanneer eenmaal het dichloormethaan bij de bodem van de trechter als boven beschreven is afgevoerd. De tvee CE^Cl^- 8103931 % Λ -5- extraeten vorden daama in esn conische centrifugebuis gecanbineerd.

De bovengenoemde volgorde van oplossing is kritisch voor het rendement "van de extractie en voor het verminderen van eventuele emulsievorming.

5 De nu gecambineerde CH^l^-extracten vorden in een verdamper gebracht cm de vloeistoffen af be dampen en een'bijna droog residu te leveren.

Dit vordt bij voorkeur uitgevoerd onder stikstof met een vaterbad bij een temperatuur van bij benadering 6o°C. Vervolgens vordt 10 trifluorazijnzuur (TFA) toegevoegd om een derivaat van de aflatcxinen B1 en G1 te maken dat sterker zal fluoreseeren dan anders bet geval zou zijn. Dit vordt uitgevoerd door het residu. uit de verdamper te verwijderen, 500 jil UFA aan elke centrifugebuis toe te voegen en deze op een Vortexmenger of dergelijke gedurende 15-20 seconden te plaatsen.

15 Het TFA vordt daarna drooggedampt onder stikstof met een vaterbad van bij benadering 60°C. Eet is op dit tijdstip kritisch dat alle overaaat TFA vordt verdampt.

De mobiele fase is een 20/80 oplossing van TEF (1# CE^COOH), vaarbij beide caaponenten tveemaal vorden gefiltreerd alvorens zij 20 vorden gemengd. De bereidingsmethode bet reft het toevoegen van 800 ml

O

\% CH^COE (10 cm3 CH^COOH verdund met tot 1 1 met E^0) aan een volumetrische kolf van 11 en verdunning tot het eindvolume met THF.

Elke portie van de mobiele fase moet tveemaal door een geschikt filter-medium vorden gefiltreerd, bij voorkeur een 0,5 micrometer filter, 25 alvorens deze vordt geaengd met THF. De mobiele fase vordt ontgast door helium doer te borrelen alvorens deze vordt aangebracht in een hoge-druk-vloeistofchromatcgraaf, vaarbij deze continu vordt ontgast door langzaam roeren met een magnetische roerder, bij voorkeur onder toepassing van een met Teflon beklede roerstaaf.

30 Vervolgens vordt het residu dat uit de TFA verdampingstrap 3 achterblijft opgencmen m 3S0 cm mobiele fase en gemengd in een Vortex. Sen minikolcm bed vordt daama geprepareerd vaarbij men ongeveer 1 ml 1# CH^COOH daardoorheen laat uitlekken. In de praktijk sijn de in dit stadium toegepaste minikolcmmen glazen buizen 35 met een lengte van 28 cm en een buitendiameter van 6 mm, met een coniciteit van 1,3 cm. Sen glasvolplug vordt toegepast en gepakt met 3 . 5 cm Bcndapak C 18/Porasil B. 2 cm vegverpbare serologische pipetten 8103931 . -6- * ι kunnen in de plaats van gevone glasbuizen vorden toegepast. Gesilaniseerd glasvol is verkrijgbaar bij Applied Science Labs,

State College, Pennsylvania 16801 en Bondapal Cl8:Porasil B is verkrijgbaar bij Waters Associates.

3 ...

5 Vervolgens vordt een 1 cm monsteroplossing aan de mimkolcm toegevoegd. Men laat deze doorlekken en vervijdert deze daarna. Vervolgens vordt de resterende monsteroplossing toegevoegd aan de minikolcm en verzameld in een WISP flesje.^In dit stadium dient het eluaat helder te zijn, maar niet noodzakelijkervij s kleurloos, 10 Het flesje vordt daarna via een injector in een vloeistof chraaatograaf met boge capaciteit gebracbt. Teneinde een continue analyse onder toepassing van een groot aantal monsters voort te laten gaan heeft een autcmatische injecteur de voorkeur. Gevonden is dat een model 71OA WISP autcmatiscbe -monsterververker van Waters Associates zeer bevredigende 15 resultaten oplevert. De ververker amvat een roterende carroussel-achtig wiel, aan het aatrek waarvan een groot aantal flesjes is ge-monteerd die afzonderlijke monsters voor de ververking bevatten. Aangezien het wiel is gexndexeerd vordt het monster autcmatisch uit elk flesje afgevoerd en in de vloeistofchramatograaf gexnjecteerd.

20 De voor dit doel toegepaste vloeistofchrcmatograaf kan een model ALC/GPC hoge-druk-vloeistofchromatograaf zijn.uitgerust met een model 6000 A pcznp en een model U6K injecteur verkrijgbaar van ...... Waters Associates Inc. Milford Mass.. De chraaatograaf is uitgerust met een model k2Q fluorescentiedetector met een excitatiefilter van 25 365 am en een emissiefilter van ^25 nm, tevens verkrijgbaar bij Waters Associates. Verschillende opnemers kunnen vorden toegepast vaarbij zowel een Varian model 9176 dual-pen-recorder 10 mv/FS verkrijgbaar bij Varian Walnut Greek, Califomie, een bevredigende capaciteit heeft.

30 Fluorametrie is zovel een kvantitatieve als kvalitatieve meettechniek die gebruik maakt van het verschijnsel van fluores-centie vaarbij een langgolvige lichtstraal vordt uitgezonden uit een monster dat licht van een kortere golflengte heeft geabsorbeerd.

Een fluorescerende lamp levert het licht an fluorescentie in het 35 monster op te vekken. Het. licht uit deze lamp vordt door een excitatiefilter gericht dat gekozen golflengten van het licht doorlaat naar het monster in de stroomcel van de chraaatograaf. Het emissiefilter vordt .......8 1 0 3 9 3 1 '.............

J

-7- zodanig gekozen dat alleen een bepaalde fluorescentieband wordt doorgelaten. Een fotavermenigruldigerbuis wordt toegepast om het fluoreseentiesignaal dat uit het monster wordt uitgezonden te detecteren en dit cm te zetten in een elektrisch signaal evenredig aan de 5 grootte van de fluorescentie van het monster.

In de praktijk van de voornoemde werkwijze is gevonden dat met de beschreven procedure 0,25 ppd van elk van de aflatoxinen B1, B2, G1, G2 bij een detectieniveau van 1,00 ppb.totaal aflatoxine of meer wordt gedetecteerd. De minimale detecteerbare piek is bepaald 10 op een signaal-tot-ruisverhouding = 5· De gevoeligheid kan worden verhoogd door toepassing van monsterconcentratie, verhoogde ver-zwakking, groter injectievolume en/of lagere standaardconcentratie.

Het hoge-druk-vloeistofchrcmatografiesysteem in de voor-keursuitvoeringsvora van de uitvinding wordt onder de volgende 15 cmstandigheden in bedrijf gesteld:

Kolam: Zorbax OBS 25 cm x bs6 mm i.d.

Mobiele fase: 20/80 THF/(1# CH3C00H)

Stroomsnelheid: 1,0 ml/min

Druk zal bij benadering 1^0 bar zijn.

20 Temperatuur: angevingstanperatuur (circa 25°C)

Detector: Fluorescentiemcdel k20 met een excitatiefilter van 365 nm en emissiefilter van b25 nm.

Versterking: 32 Grootte: maximum 25 Stel in op nul wanneer de systeemcmstandigheden zijn gestabiliseerd.

Recorder: 10 mv/FS x 1 0,5 cm/min registratiesnelheid.

WIS?:· looptijd 10 minuten Injecties/flesjes 1 30 Injectievolume: a. 100 rg/ml standaard - 25 ul b. 50 ng/ml standaard - 25 ul c. 10 ng/ml standaard - 100 ul d. onbekend monster of monster met laag niveau - 100 ul 35 e. hocg niveau monster - wanneer nodig.

In de praktijk worden de aflatcocine standaaraen geinjecteerd na de te beprceven monsters. De aflatoxinestanaaarden dienen bij het 8105931 -8- eind van de proef en/of na elke 10 monsters opnieuv te vorden ge-injecteerd am eventuele veranderingen in de retentietijd, piekhoogte-responsie en scheidingsfactoren vaar te nemen. Bij het uitvoeren van de verkvijze is het aan te bevelen de retentietijd en de piekhoogte 5 van alle standaarden te meten en te registreren. In deze .verkvijze vorden de aflatoxinen in de volgende volgorde geelueerd: G1 (als G2a), B1 (als B2a) G2 en B2. De retentietijden van de monsterpieken vorden gemeten en opgetekend. Aflatoxineccmponenten vorden geidentificeerd door vergelijking met de retentietijden van 10 de standaarden.

Individuele aflatoxinestandaarden van fijne kvaliteit zijn ccmmercieel verkrijgbaar bij de leveranciers zoals Applied Science Laboratories. Elke component, nl. B1, B2, G1 en G2 vordt afzonderlijk als volgt bereid: Eerst vordt de droge standaard {bij benadering 15 b mg of volgens instructies van de leverancier) opgelost in voldoende benzeen/acetonitril (98/2) an. bij benadering een concentratie van 1 mg/ml te verkrijgen voor het leveren van de hoofdoplossing. Ver-volgens vordt een aluquot van de hoof doplos sing in een geschikte volumetrische kolf tot een voldoende volume met benzeen/acetonitril 20 (98/2) verdund cm bij benadering een concentratie van 2 ug/ml te verkrijgen cm de voorraadoplossing te leveren. Vervolgens vordt elke voorraadoplossing op een UV spectrofotcraeter ingest eld op 350 nm afgelezen en vorden de aflezingen in de absorbantie-eenheden gere-gistreerd. De juiste concentraties vorden daama berekend onder toe-25 passing van de uitdovingscoefficienten als volgt:

Ber ekening s formule:

(A) (MW) (1000) = concentratie in ug/ml of ng/ul E

vaarin A = absorbantie-eenheden MW = molecuulgevicht E = extinctiecoefficient in benzeen/acetonitril (98/2).

Aflatoxine MW E

B1 312 19.800 B2 31b 20.900 G1 328 17.100 35 G2 330 18.200 810 3 931.......................- .

-9-

Voorbeeld: Absorbantie aflezing roor B1 = 0,283

Voorraad B1 = (0,283) (312) (1000)/19.300 = 4,45 ug/ml Onder toepassing ran de berekende concentraties worden drie gecambineerde standaarden in benzeen op zodanige wijze bereid 5 dat de concentratie ran elke component bij benadering resp. 100, 50» 10 ng/ml is. Voorbeeld B1 4,45 ng/nl B2 1,88 ng/nl G1 2,76 ng/nl 10 G2 17 ng/nl 100 ng/ml geccmbineerde standaard (enkel 25 ml rolumetrisch·} B1 (600 ul) (4,45 ng/ul)/25 ml = 106,8 ng/ml B2 (15ΟΟ ul) (1,88 ng/ul)/25 ml = 112,8 ng/ml G1 (1000 ul) (2,76 ng/ul)/25 ml = 110,4 ng/ml 15 G2 (600 ul) (4,17 ng/ul)/25 ml = 100,1 ng/ml

Deze lereren de werkstandaarden die met de monsters moeten worden gexnjecteerd in de hoge-druk-rloeistofchrcmatograaf.

De aflatoxinestandaarden zijn karakteristiek stabiel gedurende minder dan 24 uur in een methanoloplossing, zelfs bij afkoeling.

20 Be aflatoxinestandaarden zijn echter gedurende versehillende maanden stabiel in een benzeen of een benzeen/acetonitril (93/2) oplossing. Ter wille ran een hogere stabiliteit dienen alle standaardoplossingen te worden gekoeld, maar roor gebruik dienen zij te worden opgewarmd tot kamertemperatuur. Een aliquot ran elk ran de drie werkstandaard-25 oplossingen dient tezamen met de monsters ria de deriratiseringstrap te worden gencmen. De gederiratiseerde standaarden warden terens tezamen met de monsters afgencmen ria de minikolaaprocedure.

Het optreaen ran aflatoxine, berekend in delen per milliard kan door de rolgende berekening worden afgeleia: 30

Aflatoxine, delen per milliard = (jj^) ¢0)

Waarin Vi 1 - injectierolume, standaard (ul)

Vi - injectierolume, monster (ul) FE - piekhoogte, (monster) cm 35 PH 1 - piekhoogte, standaard (cm) C - standaard concentratie (ng/ml)

Ve - relume extractie-oplossing (ml) 8103931 ^ v- ^ -ιόν., - gewicht monster (g)

Vf - eindvolume monster (ml)

Va - volume van aliquot, monster (ml)

Voorbeeld: /lOO ul\ /6,1 cm\ / ^ / , ·\ /100 ml\ /3 ml \ 5 Aflat axme B1 (ijoizj (10,T ng/ml) (5^) (so^j.) = 1,75 ng/g = 1 ,75 d.p. milliard Aflatoxine B1 3103931

Claims (7)

1. Werkwijze voor het analyseren van aardnoten en dergelijke op de aanwezigheid van aflatoxinen, met het kenmerk, dat de volgende trappen worden uitgevoerd: a. het malen van een hoeveelheid noten tot een pasta, 5 h. het mengen van de pasta met een oplossing van methanol en water onaer vorming van een suspensie, c. het filtreren van de suspensie ter extractie van een filtraat in de voim van een waterige oplossing, d. het mengen van de waterige oplossing met een hoeveelheid dichloor-10 methaan, e. het extraheren van het dichloomethaan uit de waterige oplossing ter verkrijging van een extract, f. het verdampen van het dichloomethaan uit het extract ter verkrijging van een eerste residu, 15 g. het mengen van het eerste residu met een hoeveelheid trifluor-azijnzuur ter vorming van een derivaat van genoemde aflatoxinen, h. het verdampen van het trifluorazijnzuur ter verkrijging van een tweede residu. i. het mengen van het tweede residu met een oplossing van tetra-20 hydrofursn en CH^COOH ter verkrijging van een mobiele fase, j. het filtreren van de mobiele fase door een minikolcm, k. het injecteren van de mobiele fase in een hoge-druk-vloeistofehroma-tograaf ter afscheiding van de aflataxineccmponenten in de mobiele fase en 1. het meten van de concentraties van elk van de genoemde ccmponenten.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de oplossing van methanol en water bij benadering 80 vol.% methanol en 20 vol. yi water cmvat.

3. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat een zout-30 oplossing aan de gefiltreerde suspensie wordt toegevoegd. k. Werkwijze volgens conclusie 3, met het kenmerk, dat de zout- cplossing zinkacetaat is.

5. Iverkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de mobiele fase bij benadering 20 vol.% tetrahydrofuran en 80 vol.fa (1 vol.% CH^COOH) 35 oiavat. S 1 0 3 9 3 1 ** V- : -Ϊ2-"

6. Werkvijze volgens conclusie 1, met hetkenmerk, dat de genoemde coneentraties vorden gemeten door belichting daarvan met een fluorescerende lichtbron voor bet opwekken van fluorescentie in genoemde ccmponenten en het detecteren en meten van gekozen fluores-5 centiebanden.

7· Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat in genoemde chramatograaf aflatoxinestandaarden in de mobiele fase vorden geinjecteerd teneinde daaruit referentiegegevens te verkrijgen.

8. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de mini- 10 kolam een glasbuis is met een binnendiameter van bij benadering k mm die een filtemateriaal bevat. % 8103931