CN109142569A - 一种对羟基苯丙氨酸含量测定方法 - Google Patents

一种对羟基苯丙氨酸含量测定方法 Download PDF

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李鹏战
郑兆显
王风滩
程相标
王亚
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Abstract

本发明公开了一种对羟基苯丙氨酸含量测定方法，通过液相质谱法检测尿液样本，带入标准曲线得到尿液样本中的对羟基苯丙氨酸的含量。对比现有检测方法，本发明的方法具有高灵敏度，高选择性，可定量，步骤简单，快速准确的特点。

Description

一种对羟基苯丙氨酸含量测定方法
技术领域
本发明涉及一种体内代谢产物的测定方法，具体涉及一种对羟基苯丙氨酸含量测定方法。
背景技术
研究表明，对羟基苯丙氨酸的代谢紊乱不仅导致多种氨基酸代谢疾病的发生，而且与恶性肿瘤有一定的相关性。因此，研究人体体液 中酪氨酸及其代谢产物的含量变化，对于多种疾病的辅助诊断、 疗效监测病因学等方面的研究意义重大。
现有文献记载中，癌症患者尿液中的对羟基苯丙氨酸浓度较正常人群会有明显升高，对羟基苯丙氨酸作为一个新的肿瘤标志物逐渐开始被广泛关注。目前，已报道的对羟基苯丙氨酸检测方法多是检测试剂与对羟基苯丙氨酸结合形成特定颜色，并与标准色卡对比，得出阳性或阴性的结论。这种方法只可进行简单的定性而不可进行定量，且该方法干扰因素较多，易形成假阳性或假阴性。
发明内容
为弥补现有技术的不足，本发明提供一种选择性高、可准确定量的对羟基苯丙氨酸含量测定方法。
本发明是通过如下技术方案实现的：
一种对羟基苯丙氨酸含量测定方法，其特殊之处在于：
包括以下步骤：
（1）标准曲线溶液的制备：
将对羟基苯丙氨酸溶解后逐级稀释，向稀释后的各级对羟基苯丙氨酸溶液中加入同位素内标液，混合均匀得对羟基苯丙氨酸标准曲线溶液；
（2）待测尿液样本的制备：
将待测尿液样本离心处理后，取上清液，用稀释液稀释后加入对羟基苯丙氨酸同位素内标液，混合均匀，得待测尿液样本；
（3）标准曲线的绘制：
将步骤（1）制备的标准曲线溶液进行液相质谱检测，线性回归分析，得到对羟基苯丙氨酸的标准曲线；
（4）待测尿液样本检测：
将步骤（2）制备的待测尿液样本进行液相质谱检测，检测结果带入步骤（3）得到的标准曲线中，计算对羟基苯丙氨酸浓度，计算结果乘以稀释倍数，得到待测尿液样本中对羟基苯丙氨酸的含量。
其中，步骤（1）与步骤（2）制备的所述标准曲线溶液与待测尿液样本中的内标液浓度应保持一致。
作为优选方案，步骤（1）与步骤（2）中所述同位素内标液为对羟基苯丙氨酸各构型对应的氘代物、13C代物及15N代物。
进一步的，所述同位素内标液优选为L-对羟基苯丙氨酸-D2。
作为优选方案，步骤（1）中对羟基苯丙氨酸采用超纯水进行逐级稀释，稀释范围为1ng/ml-2000ng/ml。
作为优选方案，步骤（2）中待测尿液样本处理过程为：取人体待测尿液样本在离心力1500×g下离心，沉淀蛋白，取上清液稀释，过微孔过滤。
进一步的，步骤（2）中待测尿液样本离心后上清液稀释倍数为20-100倍，微孔滤膜为孔径0.22μm的水性滤膜。
作为优选方案，步骤（3）中以标准曲线中校正浓度理论值为横坐标，以对羟基苯丙氨酸与同位素内标的面积比值为纵坐标进行线性回归分析，线性系数不小于0.99。
进一步的，所述标准曲线的接受标准为：校正标样回算浓度应在标示值的±15%内，至少75%校正标样，含最少6个有效浓度，不符合的校正标样应剔除，重新回归分析。
作为优选方案，液相质谱所用离子源为ESI(+)，所用的离子对母离子为：182±0.5，进一步优选为182.2；子离子为：136±0.5，进一步优选为136.1。
本发明的有益效果是：
（1）本发明的检测方法可以对样本中待测物含量进行准确定量。
（2）本发明的检测方法灵敏度高，检测限低，定量下限可达到1ng/ml
（3）本发明的检测方法可高选择性的检测待测物产生的特定离子对，检测不受尿液中其它物质的干扰。
（4）本发明的检测方法步骤简单，快速准确，从样本接收到得到数据仅需20分钟。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细的说明，以帮助本领域的技术人员对本发明的发明构思、技术方案有更完整、准确和深入的理解，本发明的保护范围包括但不限于以下实施例，在不偏离本申请的精神和范围的前提下任何对本发明的技术方案的细节和形式所做出的修改均落入本发明的保护范围内。
1.仪器与药品
高效液相色谱仪：岛津Nexera XR，泵：LC-20AD XR，自动进样器：SIL -20AC XR，柱温箱：CTO-20A。质谱仪：AB SCIEX API 4000，离心机：Thermo SORVALL ST 8R。
对羟基苯丙氨酸购自中检所，同位素内标液L-对羟基苯丙氨酸-D2购自于TLC公司。
2. 色谱检测条件
色谱柱：Thermo C18 3um （2.1×100mm）色谱柱，流动相A相为0.1%（v/v）的甲酸，B相为乙腈，流速为0.2-0.3ml/min，柱温40℃，进样体积5ul。
3.储备液的制备
对羟基苯丙氨酸储备液的制备：称量对羟基苯丙氨酸10mg，用电动移液器加入超纯水使有效浓度为1mg/ml，标记为stock 1。
L-对羟基苯丙氨酸-D2储备液的制备：称量L-对羟基苯丙氨酸-D2 10mg，用电动移液器加入超纯水使有效浓度为1mg/ml，标记为stock 2。
4.标准曲线溶液的制备
将储备液stock 1用超纯水逐级稀释到2000ng/ml，1000ng/ml，500ng/ml，100ng/ml，50ng/ml，10ng/ml，5ng/ml，1ng/ml，分别取上述各浓度溶液190ul，加入储备液Stock 210ul，混合均匀，得到对羟基苯丙氨酸的标准曲线溶液。
5.待测尿液样本的制备
取人体尿液样本1ml，1500×g/min 离心10-15min，取上清液，稀释50倍，过0.22um微孔滤膜，取190ul滤液加入10ul储备液Stock 2 ，混合均匀。
6.线性分析
取步骤4获得的对羟基苯丙氨酸的标准曲线溶液进行液相质谱检测，采用液相色谱-质谱仪连用进行检测，对羟基苯丙氨酸的色谱检测条件为步骤2所述条件。以标准曲线中校正浓度理论值为横坐标，以对羟基苯丙氨酸与同位素内标的面积比值为纵坐标进行线性回归分析。回归曲线方程为y=4.31e +003x+1.53e +004（r=0.9991），权重系数为1/x2。
7.待测尿液样本检测
选取步骤5制备的尿液样本200份进行液相质谱检测，采用液相色谱-质谱仪连用进行检测，检测结果带入步骤6的标准曲线方程，得到尿液样本中对羟基苯丙氨酸含量。其中最大值为39407ng/ml ；最小值为1260ng/ml；均值为11088ng/ml，阳性率为6%。

Claims (10)

1.一种对羟基苯丙氨酸含量测定方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）标准曲线溶液的制备：
将对羟基苯丙氨酸溶解后逐级稀释，向稀释后的各级对羟基苯丙氨酸溶液中加入同位素内标液，混合均匀得对羟基苯丙氨酸标准曲线溶液；
（2）待测尿液样本的制备：
将待测尿液样本离心处理后，取上清液，用稀释液稀释后加入对羟基苯丙氨酸同位素内标液，混合均匀，得待测尿液样本；
（3）标准曲线的绘制：
将步骤（1）制备的标准曲线溶液进行液相质谱检测，线性回归分析，得到对羟基苯丙氨酸的标准曲线；
（4）待测尿液样本检测：
将步骤（2）制备的待测尿液样本进行液相质谱检测，检测结果带入步骤（3）得到的标准曲线中，计算对羟基苯丙氨酸浓度，计算结果乘以稀释倍数，得到待测尿液样本中对羟基苯丙氨酸的含量。
2.根据权利要求1所述的一种对羟基苯丙氨酸含量测定方法，其特征在于：所述标准曲线溶液与待测尿液样本中的内标液浓度一样。
3.根据权利要求2所述的一种对羟基苯丙氨酸含量测定方法，其特征在于：步骤（1）与步骤（2）中所述同位素内标液为对羟基苯丙氨酸各构型对应的氘代物、13C代物及15N代物。
4.根据权利要求3所述的一种对羟基苯丙氨酸含量测定方法，其特征在于：所述同位素内标液为L-对羟基苯丙氨酸-D2。
5.根据权利要求1所述的一种对羟基苯丙氨酸含量测定方法，其特征在于：步骤（1）中对羟基苯丙氨酸采用超纯水进行逐级稀释，稀释范围为1ng/ml-2000ng/ml。
6.根据权利要求1所述的一种对羟基苯丙氨酸含量测定方法，其特征在于：步骤（2）中待测尿液样本处理过程为：取人体待测尿液样本在15000rpm下离心，沉淀蛋白，取上清液稀释，过微孔过滤。
7.根据权利要求6所述的一种对羟基苯丙氨酸含量测定方法，其特征在于：待测尿液样本离心后上清液稀释倍数为20-100倍，微孔滤膜为孔径0.22μm的水性滤膜。
8.根据权利要求1所述的一种对羟基苯丙氨酸含量测定方法，其特征在于：步骤（3）中以标准曲线中校正浓度理论值为横坐标，以对羟基苯丙氨酸与同位素内标的面积比值为纵坐标进行线性回归分析，线性系数不小于0.99。
9.根据权利要求8所述的一种对羟基苯丙氨酸含量测定方法，其特征在于：所述标准曲线的接受标准为：校正标样回算浓度应在标示值的±15%内，至少75%校正标样，含最少6个有效浓度，不符合的校正标样应剔除，重新回归分析。
10.根据权利要求1所述的一种对羟基苯丙氨酸含量测定方法，其特征在于：液相质谱所用离子源为ESI(+)，所用的离子对母离子为：182±0.5，子离子为：136±0.5。
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