CN103675132B - 气相色谱-质谱检测细胞内中氨基酸、糖、有机酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种气相色谱-质谱检测细胞内氨基酸、糖、有机酸的方法，属于生物化学检验测定技术领域。本发明检测方法步骤包括：（1）取发酵液，高速离心，分别收集细胞和细胞外液；（2）细胞内代谢物样品制备，将收集的菌体用生理盐水清洗，冷甲醇溶解后超声破碎，低温萃取，离心收集萃取上清液，加入内标物，低温真空烘干；（3）样品衍生，加入糖衍生剂、氨基酸衍生剂；（4）气相色谱-质谱分析和数据采集。本发明具有样品处理简单，操作简便，检测氨基酸、糖、有机酸时间短，灵敏度高，检测结果重复性高，可实现多个样品制备等优点。
Description
技术领域
本发明属于生物化学检验测定技术领域，特别是涉及一种气相色谱-质谱检测细胞内中氨基酸、糖、有机酸的方法。
背景技术
在利用气相色谱-质谱检测糖代谢物方面，目前已有相关技术报道，如专利201210046953.2，公布了一种气相色谱－质谱检测尿糖的方法，包括如下步骤：（1）对待检尿液样本完成尿酶处理；（2）加入内标品，采用冷冻乙醇进行沉淀蛋白的处理，将样本吹干；（3）对上述样本进行甲基硅烷化衍生处理；（4）采用上述1-3的步骤处理标准糖，得到标准糖样本；（5）采用气相色谱－质谱联用仪对标准糖样本和待检尿液样本进行检测；（6）以标准糖样本的检测结果作为参比曲线，用常规算法对待检尿液样本的糖进行定量。该专利发明主要应用领域为尿样检测，且该检测方法仅局限于糖代谢物的检测。
对于微生物胞内、胞外代谢物的检测研究，可以揭示微生物在发酵条件下的代谢规律，尤其是发酵条件对于微生物目标产物的影响规律。掌握微生物的代谢规律可以不仅有利的促进目标产物的产量提升，而且可确定菌体内的代谢通量分布，进而利用基因工程手段实现菌体内代谢途径的优化与重构，实现目标产物高效生物合成。
目前对于细胞内的代谢物分析检测方法局限用于特定某类物质，不可实现多类代谢物同时检测。由于细胞内各成分含量复杂多样，对于样品的处理方法很关键，目前还没有相关细胞内、细胞外代谢物的系统处理检测方法，使得开发一种更为灵敏的、广谱的、通用的发酵代谢物检测方法，鉴定各种谱峰对映的化合物结构，以及与其它虚拟模型的整合，成为微生物代谢组研究的热点。
发明内容
本发明的目的是提供一种气相色谱-质谱检测细胞内氨基酸、糖、有机酸的方法，弥补目前在微生物发酵中对代谢物系统检测方法的空白，克服现有检测技术干扰因素很多、操作繁琐、测试成本高、灵敏度低、检测范围窄等缺点。
本发明的方案是通过这样实现的：一种气相色谱-质谱检测细胞内氨基酸、糖、有机酸的方法，检测方法步骤包括：
（1）取发酵液，高速离心，分别收集菌体和上清液Ⅰ；
（2）细胞内代谢物样品制备：取步骤1）得到的菌体，用生理盐水清洗2~3次，冷甲醇溶解后超声破碎至细胞裂解，得到裂解液，低温萃取裂解液，离心收集50~200ul萃取后裂解上清液Ⅱ，加入内标物核糖醇溶液，裂解上清液Ⅱ体积与内标物核糖醇重量比例为50~200ul:20μg，室温真空烘干，得到细胞内代谢物样品Ⅰ；
（3）样品衍生：在步骤2）得到的样品Ⅰ中，分别加入50~150ul糖衍生剂，恒温放置1.5~4h，再分别加入50~150ul糖衍生剂，恒温放置过夜，衍生完毕，离心衍生后的样品Ⅰ，收集上清得到待测胞内样品Ⅰ；
（4）利用气相色谱-质谱对步骤3）得到的待测胞内样品Ⅰ，进行分析和数据采集。
作为本发明的进一步限定，所述菌体其取样量为用冷甲醇溶解后生物量干重达0.2~1.0g/ml；所述的冷甲醇为经过冷浴槽预冷至-40℃；所述低温萃取为-40℃至-50℃下萃取2~7h。
作为本发明的进一步改进，所述糖衍生剂为0.1~0.3mg甲氧胺盐酸溶于10ml吡啶溶液中配制而得；所述氨基酸衍生剂为50~200ul三甲基氯硅烷溶于10ml的三氟乙酰胺中。
作为本发明的进一步改进，所述气相色谱-质谱其仪器分析条件为：气相色谱：色谱柱为30m×0.25mm的HP-5MS或者DB-5MS毛细管柱，进样口温度300℃，检测器温度250℃，柱箱升温程序平衡时间3min→80℃维持1min→2℃/min升温至100℃→15℃/min升温至220℃→30℃/min升温至300℃→300℃维持3min，进样体积1μL；质谱：离子源EI，检测器为四级杆，电离能70eV，离子源表面温度280℃。
作为本发明的进一步改进，该方法应用于检测酵母菌、乳酸菌、梭菌、霉菌的生物发酵过程中的细胞内的氨基酸、糖、有机酸。
作为本发明的进一步改进，其特征在于，所述糖为葡萄糖、果糖、木糖；所述有机酸为琥珀酸、苹果酸、柠檬酸、丙酮酸、富马酸；所述氨基酸为谷氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、赖氨酸、丙氨酸、组氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、天门冬氨酸、天门冬酰胺、酪氨酸、脯氨酸。
本发明的实质性特点和显著进步是：（1）该方法可以检测细胞内细胞内中糖类物质的检测，不需要对发酵液进行多次复杂处理，节约时间和简化操作步骤，及时得到发酵过程中微生物代谢规律，分析胞内代谢流量。（2）该方法采用冷甲醇萃取细胞内代谢物法，其萃取效果优良，获得细胞内较多代谢物种类，有利于代谢规律的分析。（3）样品分析得到的色谱峰分析效果良好，可对葡萄糖、果糖、木糖等糖实现检测；可对琥珀酸、苹果酸、柠檬酸、丙酮酸、富马酸等有机酸实现检测，可对谷氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、赖氨酸、丙氨酸、组氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、天门冬氨酸、天门冬酰胺、酪氨酸、脯氨酸等氨基酸实现检测。
附图说明
图1.GC-MS检测图谱。图中1为丙二酸；2为甘氨酸；3为色氨酸；4为丙氨酸；5为甘油；6为丙二醇；7为丁二醇；8为木糖醇；9为核糖醇；10为脯氨酸；11为4-氨基丁酸；12为树胶糖酸；13为酮戊二酸；14为琥珀酸；15为乳酸。
具体实施方式
下面将通过实施例对本发明方法进一步的描述，这些描述并不是对本发明内容作进一步的限定。
以下实施例中离心条件为：-4℃下10000rpm离心10min。
以下实施例中气相色谱-质谱其仪器分析条件为：气相色谱：色谱柱为30m×0.25mm的HP-5MS或者DB-5MS毛细管柱，进样口温度300℃，检测器温度250℃，柱箱升温程序平衡时间3min→80℃维持1min→2℃/min升温至100℃→15℃/min升温至220℃→30℃/min升温至300℃→300℃维持3min，进样体积1μL；质谱：离子源EI，检测器为四级杆，电离能70eV，离子源表面温度280℃。
以下实施例皆可实现对葡萄糖、果糖、木糖等糖进行检测；可对琥珀酸、苹果酸、柠檬酸、丙酮酸、富马酸等有机酸实现检测，可对谷氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、赖氨酸、丙氨酸、组氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、天门冬氨酸、天门冬酰胺、酪氨酸、脯氨酸等氨基酸实现检测。
实施例1
取乳酸菌发酵液。
（1）细胞内代谢物样品制备：取5ml发酵液，离心得到菌体，用生理盐水清洗菌体3次，-40℃冷甲醇溶解后生物量干重达0.6g/ml，超声破碎至细胞裂解，得到裂解液，低温萃取裂解液，低温条件为：-40℃至-50℃下萃取3h，离心收集200ul萃取后裂解上清液Ⅰ，加入内标物核糖醇溶液，裂解上清液Ⅰ体积与内标物核糖醇重量比例为200ul:20μg，室温真空烘干，得到细胞内代谢物样品Ⅰ。
（2）细胞外液样品制备：取发酵液，离心得到上清液Ⅱ，取60ul上清液Ⅱ，在清液Ⅱ中加入乙腈除去蛋白，上清液Ⅱ与乙腈体积比为1:1.5，涡旋振荡，再离心收集得上清液Ⅲ，加入内标物核糖醇溶液，上清液Ⅲ体积与内标物核糖醇重量比例为50ul：20μg，室温真空烘干，得到细胞外液样品Ⅱ。
（3）样品衍生：在步骤1）和步骤2）得到的样品Ⅰ和样品Ⅱ中，分别加入150ul糖衍生剂（糖衍生剂为0.15mg甲氧胺盐酸溶于10ml吡啶溶液中配制而得），恒温放置2.5h，再分别加入50ul氨基酸衍生剂（氨基酸衍生剂为200ul三甲基氯硅烷溶于10ml的三氟乙酰胺中配制而得），恒温放置过夜，衍生完毕，分别离心衍生后的样品Ⅰ和样品Ⅱ，对应收集各自上清得到待测胞内样品Ⅰ和待测胞外样品Ⅱ。
（4）按照气相色谱-质谱其仪器分析条件，对待测胞内样品Ⅰ和待测胞外样品Ⅱ进行分析和数据采集。
检测结果如图1。由于衍生作用，图中8为木糖衍生后形成的木糖醇。
实施例2
取乳酸菌发酵液。
（1）细胞内代谢物样品制备：取5ml发酵液，离心得到菌体，用生理盐水清洗菌体3次，-40℃冷甲醇溶解后生物量干重达1.0g/ml，超声破碎至细胞裂解，得到裂解液，低温萃取裂解液，低温条件为：-40℃至-50℃下萃取5h，离心收集100ul萃取后裂解上清液Ⅰ，加入内标物核糖醇溶液，裂解上清液Ⅰ体积与内标物核糖醇重量比例为100ul:20μg，室温真空烘干，得到细胞内代谢物样品Ⅰ。
（2）细胞外液样品制备：取发酵液，离心得到上清液Ⅱ，取350ul上清液Ⅱ，在清液Ⅱ中加入乙腈除去蛋白，上清液Ⅱ与乙腈体积比为1:0.7，涡旋振荡，再离心收集得上清液Ⅲ，加入内标物核糖醇溶液，上清液Ⅲ体积与内标物核糖醇重量比例为200ul：20μg，室温真空烘干，得到细胞外液样品Ⅱ。
（3）样品衍生：在步骤1）和步骤2）得到的样品Ⅰ和样品Ⅱ中，分别加入50ul糖衍生剂（糖衍生剂为0.3mg甲氧胺盐酸溶于10ml吡啶溶液中配制而得），恒温放置2.0h，再分别加入150ul氨基酸衍生剂（氨基酸衍生剂为150ul三甲基氯硅烷溶于10ml的三氟乙酰胺中配制而得），恒温放置过夜，衍生完毕，分别离心衍生后的样品Ⅰ和样品Ⅱ，对应收集各自上清得到待测胞内样品Ⅰ和待测胞外样品Ⅱ。
（4）按照气相色谱-质谱其仪器分析条件，对待测胞内样品Ⅰ和待测胞外样品Ⅱ进行分析和数据采集。
实施例3
取酵母菌发酵液。
（1）细胞内代谢物样品制备：取5ml发酵液，离心得到菌体，用生理盐水清洗菌体2次，-40℃冷甲醇溶解后生物量干重达0.2g/ml，超声破碎至细胞裂解，得到裂解液，低温萃取裂解液，低温条件为：-40℃至-50℃下萃取4h，离心收集150ul萃取后裂解上清液Ⅰ，加入内标物核糖醇溶液，裂解上清液Ⅰ体积与内标物核糖醇重量比例为150ul:20μg，室温真空烘干，得到细胞内代谢物样品Ⅰ。
（2）细胞外液样品制备：取发酵液，离心得到上清液Ⅱ，取300ul上清液Ⅱ，在清液Ⅱ中加入乙腈除去蛋白，上清液Ⅱ与乙腈体积比为1:1.2，涡旋振荡，再离心收集得上清液Ⅲ，加入内标物核糖醇溶液，上清液Ⅲ体积与内标物核糖醇重量比例为100ul：20μg，室温真空烘干，得到细胞外液样品Ⅱ。
（3）样品衍生：在步骤1）和步骤2）得到的样品Ⅰ和样品Ⅱ中，分别加入100ul糖衍生剂（糖衍生剂为0.1mg甲氧胺盐酸溶于10ml吡啶溶液中配制而得），恒温放置1.5h，再分别加入100ul氨基酸衍生剂（氨基酸衍生剂为100ul三甲基氯硅烷溶于10ml的三氟乙酰胺中配制而得），恒温放置过夜，衍生完毕，分别离心衍生后的样品Ⅰ和样品Ⅱ，对应收集各自上清得到待测胞内样品Ⅰ和待测胞外样品Ⅱ。
（4）按照气相色谱-质谱其仪器分析条件，对待测胞内样品Ⅰ和待测胞外样品Ⅱ进行分析和数据采集。
实施例4
取梭菌发酵液。
（1）细胞内代谢物样品制备：取5ml发酵液，离心得到菌体，用生理盐水清洗菌体2次，-40℃冷甲醇溶解后生物量干重达0.8g/ml，超声破碎至细胞裂解，得到裂解液，低温萃取裂解液，低温条件为：-40℃至-50℃下萃取2h，离心收集50ul萃取后裂解上清液Ⅰ，加入内标物核糖醇溶液，裂解上清液Ⅰ体积与内标物核糖醇重量比例为50ul:20μg，室温真空烘干，得到细胞内代谢物样品Ⅰ。
（2）细胞外液样品制备：取发酵液，离心得到上清液Ⅱ，取200ul上清液Ⅱ，在清液Ⅱ中加入乙腈除去蛋白，上清液Ⅱ与乙腈体积比为1:1.0，涡旋振荡，再离心收集得上清液Ⅲ，加入内标物核糖醇溶液，上清液Ⅲ体积与内标物核糖醇重量比例为150ul：20μg，室温真空烘干，得到细胞外液样品Ⅱ。
（3）样品衍生：在步骤1）和步骤2）得到的样品Ⅰ和样品Ⅱ中，分别加入120ul糖衍生剂（糖衍生剂为0.2mg甲氧胺盐酸溶于10ml吡啶溶液中配制而得），恒温放置3.0h，再分别加入80ul氨基酸衍生剂（氨基酸衍生剂为50ul三甲基氯硅烷溶于10ml的三氟乙酰胺中配制而得），恒温放置过夜，衍生完毕，分别离心衍生后的样品Ⅰ和样品Ⅱ，对应收集各自上清得到待测胞内样品Ⅰ和待测胞外样品Ⅱ。
（4）按照气相色谱-质谱其仪器分析条件，对待测胞内样品Ⅰ和待测胞外样品Ⅱ进行分析和数据采集。
实施例5
取霉菌发酵液。
（1）细胞内代谢物样品制备：取5ml发酵液，离心得到菌体，用生理盐水清洗菌体3次，-40℃冷甲醇溶解后生物量干重达0.5g/ml，超声破碎至细胞裂解，得到裂解液，低温萃取裂解液，低温条件为：-40℃至-50℃下萃取3h，离心收集200ul萃取后裂解上清液Ⅰ，加入内标物核糖醇溶液，裂解上清液Ⅰ体积与内标物核糖醇重量比例为150ul:20μg，室温真空烘干，得到细胞内代谢物样品Ⅰ。
（2）细胞外液样品制备：取发酵液，离心得到上清液Ⅱ，取300ul上清液Ⅱ，在清液Ⅱ中加入乙腈除去蛋白，上清液Ⅱ与乙腈体积比为1:0.5，涡旋振荡，再离心收集得上清液Ⅲ，加入内标物核糖醇溶液，上清液Ⅲ体积与内标物核糖醇重量比例为300ul：20μg，室温真空烘干，得到细胞外液样品Ⅱ。
（3）样品衍生：在步骤1）和步骤2）得到的样品Ⅰ和样品Ⅱ中，分别加入100ul糖衍生剂（糖衍生剂为0.2mg甲氧胺盐酸溶于10ml吡啶溶液中配制而得），恒温放置4.0h，再分别加入120ul氨基酸衍生剂（氨基酸衍生剂为120ul三甲基氯硅烷溶于10ml的三氟乙酰胺中配制而得），恒温放置过夜，衍生完毕，分别离心衍生后的样品Ⅰ和样品Ⅱ，对应收集各自上清得到待测胞内样品Ⅰ和待测胞外样品Ⅱ。
（4）按照气相色谱-质谱其仪器分析条件，对待测胞内样品Ⅰ和待测胞外样品Ⅱ进行分析和数据采集。
Claims (2)
1.一种气相色谱-质谱检测细胞内氨基酸、糖、有机酸的方法，其特征在于，检测方法步骤包括：
(1)取发酵液，高速离心，分别收集菌体和上清液Ⅰ；
(2)细胞内代谢物样品制备：取步骤1)得到的菌体，用生理盐水清洗2～3次，冷甲醇溶解后超声破碎至细胞裂解，得到裂解液，低温萃取裂解液，离心收集50～200ul萃取后裂解上清液Ⅱ，加入内标物核糖醇溶液，裂解上清液Ⅱ体积与内标物核糖醇重量比例为50～200ul:20μg，室温真空烘干，得到细胞内代谢物样品Ⅰ；
(3)样品衍生：在步骤2)得到的样品Ⅰ中，分别加入50～150ul糖衍生剂，恒温放置1.5～4h，再分别加入50～150ul氨基酸衍生剂，恒温放置过夜，衍生完毕，离心衍生后的样品Ⅰ，收集上清得到待测胞内样品Ⅰ；
(4)利用气相色谱-质谱对步骤3)得到的待测胞内样品Ⅰ，进行分析和数据采集；
所述菌体其取样量为用冷甲醇溶解后生物量干重达0.2～1.0g/ml；所述的冷甲醇为经过冷浴槽预冷至-40℃；所述低温萃取为-40℃至-50℃下萃取2～7h；
所述糖衍生剂为0.1～0.3mg甲氧胺盐酸溶于10ml吡啶溶液中配制而得；所述氨基酸衍生剂为50～200ul三甲基氯硅烷溶于10ml的三氟乙酰胺中；
所述气相色谱-质谱其仪器分析条件为：气相色谱：色谱柱为30m×0.25mm的HP-5MS或者DB-5MS毛细管柱，进样口温度300℃，检测器温度250℃，柱箱升温程序平衡时间3min→80℃维持1min→2℃/min升温至100℃→15℃/min升温至220℃→30℃/min升温至300℃→300℃维持3min，进样体积1μL；质谱：离子源EI，检测器为四级杆，电离能70eV，离子源表面温度280℃；
所述糖为葡萄糖、果糖、木糖；所述有机酸为琥珀酸、苹果酸、柠檬酸、丙酮酸、富马酸；所述氨基酸为谷氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、赖氨酸、丙氨酸、组氨酸、甲硫氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、天门冬氨酸、天门冬酰胺、酪氨酸、脯氨酸。
2.根据权利要求1所述一种气相色谱-质谱检测细胞内氨基酸、糖、有机酸的方法，其特征在于，该方法应用于检测酵母菌、乳酸菌、梭菌、霉菌的生物发酵过程中的细胞内的氨基酸、糖、有机酸。
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Inventor after: Zhang Xuwei Inventor before: Chen Dong |
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| COR | Change of bibliographic data | ||
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20160408 Address after: 266001 Shandong city of Qingdao province Chongqing District Road No. 27 Building No. 1 room 402, unit 2 Applicant after: Zhang Xuwei Address before: No. 1 the Guangxi Zhuang Autonomous Region Fenglin Valley Lanfeng Pavilion 530004 Nanning high tech Zone Binhe Road Applicant before: Chen Dong |
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| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| C41 | Transfer of patent application or patent right or utility model | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Mo Weike Inventor before: Zhang Xuwei |
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| COR | Change of bibliographic data | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20160720 Address after: 100000, room 2, building 538, No. 101, Yongfeng Tun, Haidian District, Beijing Patentee after: Nine Fai (Beijing) Biotechnology Co.,Ltd. Address before: 266001 Shandong city of Qingdao province Chongqing District Road No. 27 Building No. 1 room 402, unit 2 Patentee before: Zhang Xuwei |
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| C56 | Change in the name or address of the patentee | ||
| CP01 | Change in the name or title of a patent holder |
Address after: 100000, room 2, building 538, No. 101, Yongfeng Tun, Haidian District, Beijing Patentee after: BEIJING UNITEGEN TECHNOLOGY CO.,LTD. Address before: 100000, room 2, building 538, No. 101, Yongfeng Tun, Haidian District, Beijing Patentee before: Nine Fai (Beijing) Biotechnology Co.,Ltd. |
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| CP03 | Change of name, title or address | ||
| CP03 | Change of name, title or address |
Address after: 100089 Building 3, 340-2, Baijiatuan Shangpin Garden, Haidian District, Beijing Patentee after: Shenzhou Yihao Gene Technology (Beijing) Co.,Ltd. Address before: Room 101, Building No. 538, Yongfeng Tun, Haidian District, Beijing 100000 Patentee before: BEIJING UNITEGEN TECHNOLOGY CO.,LTD. |
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| TR01 | Transfer of patent right | ||
| TR01 | Transfer of patent right |
Effective date of registration: 20181218 Address after: 100089 Floor 18, 1809, No. 16, Suzhou Street, Haidian District, Beijing Co-patentee after: Shenzhou Yihao Gene Technology (Beijing) Co.,Ltd. Patentee after: DIGITAL CHINA HEALTH TECHNOLOGIES Co.,Ltd. Address before: 100089 Building 3, 340-2, Baijiatuan Shangpin Garden, Haidian District, Beijing Patentee before: Shenzhou Yihao Gene Technology (Beijing) Co.,Ltd. |