CN107345933B - 一种生物样本中硫代谢相关重要代谢物的分析新方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种生物样本中硫代谢相关重要代谢物的分析方法。采用毛细管电泳‑飞行时间质谱联用技术，首先通过多进样方式将多个样品进样到毛细管中，然后利用样品基质与背景电解质的pH不同，通过大体积进样和进样间隔的控制实现在线富集。该方法通过在线富集提高检测灵敏度的同时，采用多进样方式极大的缩短了分析时间，提高了检测通量，也可有效地降低方法开发时间。本发明分析方法具有预处理过程简单、分析快速、高通量、灵敏度高，重复性好等优点。

Description

一种生物样本中硫代谢相关重要代谢物的分析新方法
技术领域
本发明涉及分析化学领域和生物化学领域，是一种基于毛细管电泳-飞行时间质谱联用的多进样在线富集细胞中硫代谢通路重要中间体的分析方法。
背景技术
硫代谢在生物生长发育过程中发挥着重要的生物功能。硫代谢紊乱会破坏人体内氧化还原态比例，与人类衰老以及许多疾病都有着密切的关系。在植物界，硫元素是植物必需的六大营养素之一，硫元素虽然不直接参与植物细胞结构的组成，但硫代谢的正常与否直接关系到植物抗胁迫能力以及农作物产量和品质。目前已经多种检测方法用于硫代谢分析，如液相色谱质谱联用技术(LC-MS)由于其高灵敏度和高分辨率的优点，已经用于生物样品中硫代谢相关重要代谢物的检测。由于这些代谢物的强极性，通常采用柱前衍生反相液相色谱或离子交换色谱分离，但由于硫代谢物不稳定且衍生过程及生物样品的基质干扰等易造成分析结果的假阳性，严重影响了检测的准确性，同时色谱分析时间较长，分析通量有限。此外，这些代谢物常常在生物体内含量很低，也给检测方法带来了极大的挑战。基于这些问题，亟需发展一种针对硫代谢相关重要代谢物的高通量、高灵敏度的检测新方法。
毛细管电泳质谱联用技术(CE-MS)是近年来发展起来的检测技术，非常适合极性化合物的分析。Lisa等人利用CE-MS方法通过衍生化方法提高代谢物的检测灵敏度，该方法在13min内分析了10种含硫代谢物，并分析了血浆中纳摩尔浓度的氧化型和还原型硫代谢物。但是由于复杂的衍生过程，增加了样品处理时间，易造成假阳性结果。在线富集方法可以免去复杂的衍生过程，样品提取之后无需进一步处理就可以在分离的同时实现富集提高检测灵敏度。目前还没有文献报道利用CE-MS在线富集生物样本中硫代谢重要代谢物的报道。连续多进样方式是近年来发展起来的新进样技术，该方法将样品连续多次进样在毛细管中，利用背景电解质作为分隔区带，即可保证样品分离又可实现高通量。该方法已应用于酶催化反应及药物分析等，但至今尚未见到将大体积连续进样和在线富集方法联用的报道，也未见到将其用于生物样本中硫代谢重要代谢物的报道。
发明内容
本发明针对硫代谢相关重要代谢物的现有分析方法的不足，建立了一种生物样本中硫代谢相关重要代谢物的分析新方法，该方法不仅可以在线富集低丰度的硫代谢相关代谢物提高检测灵敏度，同时还能实现一次分析多个样品，极大地提高了分析通量；同时在方法开发阶段可同时考察多个不同实验条件，有效地降低方法优化时间。本发明具有预处理简单、分析快速高效、重复性好以及灵敏度高等优点。
其具体方法如下：
生物样本采用毛细管电泳-飞行时间质谱联用技术(CE-TOFMS)进行分析；
采用连续压力进样方式，高电导的待测样品溶液连续进样，每次进样后以低电导的背景电解质溶液作为间隔；
连续多次进样结束后，毛细管两端加高压，利用待测样品与背景电解质基质的不同而引起的电场强度差异实现样本的在线富集；
采用内标法对硫代谢相关的重要代谢物进行定量分析。
所述的毛细管电泳-飞行时间质谱联用的分析方法为：
(1)CE条件：分离柱使用未涂层的毛细管柱，毛细管的长度为80cm，内径为50μm；毛细管温度20℃，样品盘温度为5℃；鞘液分流比为1：100，流速为10μL/min；鞘液为50％甲醇水溶液，鞘液含有浓度为0.1μM的六(1H,1H,2H-全氟乙氧基)邻氮烯为参比用于质谱的实时校正；毛细管的分离电压27kV，分离时间20min；
(2)TOFMS条件：毛细管分离电压为27kV，分离时间20min；氮气压力为7psi，干燥气温度为300℃，干燥气流速为7L/min；离子去簇电压108V，锥孔电压50V；毛细管电压为4000V；质量扫描范围为60～1000，质谱扫描速度为1.5张谱图/s。
所述高电导的待测样品溶液为含有200mM醋酸铵和2％甲酸(v/v)的水溶液，低电导背景电解质溶液为4％甲酸(v/v)水溶液。
50～200mM醋酸铵是实现富集的关键，没有盐则无法实现富集。盐浓度过高则有离子抑制。
所述连续压力进样方式的样品进样压力为100mbar，进样时间40s，连续进样五次，每次进样后以压力100mbar，持续时间为40s的背景电解质溶液为间隔。进样次数是实现高通量的关键。进样次数大于7则易受杂质干扰，小于3次则通量低。间隔带是实现多进样方法的关键，小于10s则样品区带分离度差，大于40s则增加进样时间。
所述采用内标法定量，根据线性定量曲线进行定量分析；内标及其含量为2.5μg/ml苯丙氨酸-d5
所述的生物样品为冷冻干燥后的动物、人或植物细胞的提取物。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：通过在线富集可有效提高检测灵敏度，同时采用多进样方式极大的缩短了分析时间，提高了检测通量；本发明还可同时优化多个实验条件，有效地降低方法开发时间。总之，本发明方法具有预处理过程简单、分析快速、高通量、灵敏度高，线性范围宽等优点。
附图说明
图1本发明的原理示意图。
图2连续多进样方法的条件优化。样本溶液的盐浓度(A)，样本溶液的酸浓度(B)，进样时间(C)。
图3连续多进样间隔时间和进样次数优化(A)进样间隔为10s，(B)进样间隔为40s，(C)进样间隔为60s，(D)进样次数n＝3，(E)进样次数n＝5，(F)进样次数n＝7。
图4本发明方法与常规方法用于细胞中硫代谢相关代谢物的CE-TOFMS提取离子图，本发明方法(右)，常规方法(左)。
具体实施方式
下面结合附表和附图对本发明的实施例作详细说明：实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例一
基于CE-TOFMS的高通量在线富集硫代谢相关重要代谢物的分析方法的建立及验证
图1给出了本发明的原理示意图。首先，采用连续多进样的方式，将含有高电导(高盐浓度)待测样品大体积进样到毛细管中，并通过低电导、(低盐浓度)背景电解质溶液作为间隔带，并同时保持一定的长度，使其在毛细管两端加高电压之后可利用不同电解质电场强度的不同，实现在线富集。连续进样的样品区带可以保持清晰的界限而逐次通过毛细管柱实现分离。
方法建立采用了19种硫代谢相关代谢物标准样品，包括1-氨基环丙烷羧酸(ACC)、天冬氨酸(Asp)、天冬酰胺(Asn)、精氨酸琥珀酸(Argininosuccinic acid)、谷氨酸(Glu)、谷氨酰胺(Gln)、蛋氨酸(Met)、丝氨酸(Ser)、瓜氨酸(Cit)、色氨酸(Trp)、半胱氨酸(Cys)、胱氨酸(Cystine)、半胱酰胺甘氨酸(Cys-Gly)、胱硫醚(Cystathionine)、G-谷氨酸-半胱氨酸(Gama-Glu-Cys)、S-(5’-腺苷)-高半胱氨酸(S-Adenosylhomocysteine)、S-乳酰谷胱甘肽(S-Lactoylglutathione)、羧甲半胱氨酸(S-Carboxymetylcycteine)、缬氨酸(Val)。
CE-TOFMS条件为：
毛细管电泳条件：分离柱使用未涂层的毛细管柱，毛细管的长度为80cm，内径为50μm；毛细管温度20℃，样品盘温度为5℃；鞘液分流比为1：100，流速为10μL/min；鞘液为50％甲醇水溶液，鞘液含有浓度为0.1μM的六(1H,1H,2H-全氟乙氧基)邻氮烯为参比用于质谱的实时校正；毛细管的分离电压27kV，分离时间20min；飞行时间质谱条件：毛细管分离电压为27kV，分离时间20min；氮气压力为7psi，干燥气温度为300℃，干燥气流速为7L/min；离子去簇电压108V，锥孔电压50V；毛细管电压为4000V；质量扫描范围为60～1000，质谱扫描速度为1.5张谱图/s。
对连续多进样方法进行实验条件优化，多进样方式可以在一次分离时间内考察不同实验条件，快速优化实验参数。首先，优化样本溶液的中醋酸铵的浓度。将醋酸铵加入配置好的硫代谢相关代谢物的标准溶液中，使得溶液中醋酸铵的浓度分别为0mM、50mM、100mM、200mM和400mM。将上述加入醋酸铵的标准溶液采用连续进样方式，分别进样100mbar持续40s，以4％甲酸(v/v)溶液(背景电解质溶液)作为间隔带，以压力进样100mbar持续40s，连续进样5次。图2中以半胱氨酸为例考察了不同实验条件对CE-TOFMS质谱响应的影响。图2A给出了醋酸铵浓度对质谱响应的影响，从图中可知醋酸铵浓度为200mM时质谱响应最佳。当盐浓度为0mM，峰型差分离度低(图2A)。没有盐则无富集效果，盐浓度过高则离子抑制。如果用无盐的水溶液配置标准连续多进样，则5个样品区带无法实现分离。其次使用含有200mM醋酸铵的标准溶液，进一步优化样本溶液中甲酸的浓度。将甲酸加入配置好的含有200mM醋酸铵的硫代谢相关代谢物的标准溶液中，使得溶液中甲酸的浓度分别为4％，2％，1％和0.5％(v/v)。将上述标准样品溶液采用连续进样方式，分别进样100mbar持续40s，以背景电解质溶液进样100mbar持续40s作为间隔带，连续进样5次。从图2B中可以明显看出甲酸浓度对多进样富集方法影响较小，为了保证硫代谢重要中间体的稳定性以及富集效果，最终选择含有200mM醋酸铵和2％甲酸(v/v)为最优的生物样本复溶溶液。然后，考察进样时间对质谱响应的影响。用优化后的复溶溶液(200mM醋酸铵+2％甲酸(v/v))稀释硫代谢重要中间体的标准溶液，进样压力为100mbar，进样持续时间分别为5s，10s，20s，40s和60s，以背景电解质溶液进样100mbar持续40s作为间隔带。从图2C可知进样时间持续60s的质谱峰面积和峰高最大，但是综合考虑到多进样的分离和富集效果，最终选择进样时间40s。
对连续多进样方法的间隔时间进行优化。以半胱氨酸为例，进样间隔时间采用10s、40s和60s，得到结果如图3(A-C)所示。当间隔时间为10s，原本独立的5个峰不能基线分离。如果间隔时间为0，则5个峰堆积成一个大峰，无法分离。当间隔时间为60s，峰型和分离度与间隔时间为40s没有显著区别，反而会增加进样时间。为了减少进样时间，最终选择间隔时间为40s。对连续多进样方法的进样次数优化。以谷氨酸为例分别采用连续进样次数为3、5、7次，得到结果如从图3(D-F)。由于时间窗口的增加，会出现与其它峰重叠，造成定性、定量误差，所以最终选择进样次数为5次。
确定了优化的实验条件后，对所建立方法的线性、检测限、精密度和准确度进行验证。首先配置一系列不同浓度含有硫代谢重要中间体的标准溶液。用含有200mM醋酸铵+2％甲酸(v/v)的水溶液配置含上述19种标准样品的标准溶液母液(每种标样浓度均为15μg/ml)，将母液用含有200mM醋酸铵和2％甲酸(v/v)的水溶液逐级稀释，稀释倍数分别为2000倍、1000倍、500倍、100倍、50倍、20倍、10倍和5倍，均加入以苯丙氨酸-d5为内标，内标浓度为2.5μg/ml。将上述稀释后的标准溶液分别连续进样100mbar持续40s，以背景电解质溶液进样100mbar持续40s作为间隔带，连续进样5次考察方法的线性和检测限；以稀释10倍、20倍和50倍的标准溶液分别连续大体积压力进样100mbar，进样时间持续40s，以4％甲酸(v/v)溶液进样100mbar持续40s作为间隔带，连续进样5次，考察所建立方法的精密度(n＝5)。为了考察所建立方法的富集倍数，还同时采用常规方法进行分析。常规CE-TOFMS方法的进样压力为50mbar，进样持续3s，单次进样，其他条件与本发明方法一致。富集倍数根据所建立方法与常规方法所得代谢物的峰高比值来计算。表1给出了方法富集倍数和验证结果，从表中可知所建立的方法对19种硫代谢重要代谢物的富集倍数在14.4-32.4之间，检测限在在3-15ng/ml，在0.15-3μg/ml的线性范围内，精密度在2.9-9.9％之间。上述结果表明本方法具有灵敏度高，线性、准确性和重复性好。
实施例2.本发明方法用于细胞中硫代谢重要中间体分析
(1)细胞预处理：从培养箱中取出U251细胞，用液氮迅速猝灭以保持稳定的代谢水平。随后加入甘露醇溶液洗涤3次。加入1ml甲醇将细胞刮下转移到EP管中，斡旋30s，再加入400μL超纯水，涡旋30s，最后加入1mL氯仿，涡旋30s。静置1min后，在15000rpm/min转速下离心10min。取上清液冻干。加入50μL含有200mM醋酸铵，2％甲酸(v/v)及内标浓度为2.5μg/ml的苯丙氨酸-d5的水溶液复溶细胞样品。
(2)CE-TOFMS分离条件：分离柱使用未涂层的毛细管柱，毛细管的长度为80cm，内径为50μm；毛细管温度20℃，样品盘温度为5℃；鞘液分流比为1：100，流速为10μL/min；鞘液为50％甲醇水溶液，鞘液含有浓度为0.1μM的六(1H,1H,2H-全氟乙氧基)邻氮烯为参比用于质谱的实时校正；样品进样为100mbar，持续时间40s，连续5次，并用背景电解质溶液100mbar，40s作为间隔带。毛细管的分离电压27kV，分离时间20min；飞行时间质谱条件：毛细管分离电压为27kV，分离时间20min；氮气压力为7psi，干燥气温度为300℃，干燥气流速为7L/min；离子去簇电压108V，锥孔电压50V；毛细管电压为4000V；质量扫描范围为60～1000，质谱扫描速度为1.5张谱图/s。
(3)将处理好的细胞样品用优化好的复溶剂和水复溶之后分别以本发明方法和常规方法进样。常规CE-TOFMS方法的进样压力为50mbar，进样持续3s，单次进样，其他条件与本发明方法一致。图3给出10种硫代谢相关重要代谢物高通量富集方法(图4右)与常规方法(图4左)的提取离子图。采用内标法定量，细胞样品中硫代谢重要中间体代谢物的含量见表1，从表1和图4中可以看出常规方法只能检测到1个代谢物(谷氨酸)，而本发明方法可以检测到10个硫代谢相关的代谢物，对谷氨酸有21.6倍的富集效果，与标准样品得到的富集效果相当，且分析时间从常规方法的20分钟/样本缩短至4分钟/样本。
表1 方法评价及富集倍数
a富集倍数根据所建立方法与常规方法(进样压力为50mbar，进样持续3s，单次进样)所得代谢物的峰高比值来计算。

Claims (6)

1.一种生物样本中硫代谢相关重要代谢物的分析方法，其特征在于：
(1)基于毛细管电泳-飞行时间质谱CE-TOFMS联用技术采用连续压力进样方式对生物样本进行分析，将含有50～200mM醋酸铵和0.5～4％甲酸(v/v)的待测样品溶液压力进样5～60s连续3～7次，每次进样后以背景电解质0.5～4％甲酸(v/v)水溶液作为间隔带，压力进样10～60s；
(2)连续3～7次进样结束后，毛细管两端加23～30kV高电压，利用待测样品与背景电解质基质的不同而引起的电场强度差异实现样本的在线富集。
2.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于：生物样本采用毛细管电泳-飞行时间质谱联用的分析过程：
(1)CE条件：分离柱使用未涂层的毛细管柱，毛细管的长度为80cm，内径为50μm；毛细管温度20℃，样品盘温度为5℃；鞘液分流比为1：100，流速为10μL/min；鞘液为50％(v/v)甲醇水溶液，鞘液含有浓度为0.1μM的六(1H,1H,2H-全氟乙氧基)邻氮烯为参比用于质谱的实时校正；毛细管的分离电压27kV，分离时间20min；
(2)TOFMS条件：毛细管分离电压为27kV，分离时间20min；氮气压力为7psi，干燥气温度为300℃，干燥气流速为7L/min；离子去簇电压108V，锥孔电压50V；毛细管电压为4000V；质量扫描范围为60～1000，质谱扫描速度为1.5张谱图/s。
3.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于：待测样品溶液为高电导的含有200mM醋酸铵和2％甲酸(v/v)的水溶液，背景电解质溶液为低电导的4％甲酸(v/v)水溶液。
4.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于：连续压力进样方式的样品进样压力100mbar，进样时间40s，连续进样五次，每次进样后以压力100mbar，持续时间为40s的背景电解质溶液为间隔。
5.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于：所述的生物样品为动物、人或植物细胞的提取物。
6.根据权利要求1所述的分析方法，其特征在于：采用内标法定量，根据线性定量曲线进行定量分析；内标为于待测样品溶液中加入的终浓度2.5μg/ml苯丙氨酸-d5。
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