CN117250272A - 一种同时测定盐酸普萘洛尔中两种遗传毒杂质的检测方法 - Google Patents
一种同时测定盐酸普萘洛尔中两种遗传毒杂质的检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及药物检测技术领域，更具体而言，涉及一种同时测定盐酸普萘洛尔中两种遗传毒杂质的检测方法。所述两种遗传毒杂质为环氧化物和萘醌；检测方法使用高效液相色谱仪进行，流动相为由乙腈‑水‑硫酸组成的混合液，采用等度洗脱，双波长检测。本发明根据产品结构特点及化合物性质，提供了一种采用高效液相色谱仪即可同时测定盐酸普萘洛尔中两种遗传毒杂质的检测方法。上述两种遗传毒杂质与主成分及相邻杂质峰均得到有效分离，通过对条件的优化，使得对各组分检测的灵敏度和准确度进一步得到提升，并满足各杂质的限度要求，检测成本和操作难度大大降低；另外，研究发现，流动相pH对萘醌与普萘洛尔分离度有较大影响，降低pH有利于两者分离。
Description
技术领域
本发明涉及药物检测技术领域，更具体而言，涉及一种同时测定盐酸普萘洛尔中两种遗传毒杂质的检测方法。
背景技术
盐酸普萘洛尔于1964年英国ICI（现AstraZeneca）在全球首次上市，之后在全球各国广泛上市，剂型涵盖速释片、缓释片、口服溶液、注射液，为第一代β受体阻滞剂，至今已有50多年的临床应用历史。盐酸普萘洛尔可以有效地治疗原发性高血压（轻度至中度）、心绞痛、嗜铬细胞瘤术中收缩（室上，心室）、预防阵发性心动过速、窦性心动过速、预防阵发性心房颤动、抑制偏头痛发作、抑制由于右心室流出道狭窄引起的缺氧发作。
环氧化物为合成盐酸普萘洛尔的中间体，萘醌为起始物料（1-萘酚）的氧化产物，结构中含警示基团，应按ICHM7要求按潜在致突变杂质进行控制。盐酸普萘洛尔的日最大服用剂量为240mg，按每日允许最大摄入量1.5μg/day计算，该杂质在盐酸普萘洛尔中控制限度应为6.25ppm，但现有各国药典中均未对环氧化物和萘醌进行控制。
采用高效液相色谱法对盐酸普萘洛尔中环氧化物和萘醌进行检测时，检测波长的选择对杂质的响应有较大影响，采用盐酸普萘洛尔有关物质方法中的检测波长进行检测时，杂质的响应值偏低，无法满足检测灵敏度要求。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一，为此，本发明的一个方面的目的在于，提供一种同时测定盐酸普萘洛尔中两种遗传毒杂质的检测方法，所述两种遗传毒杂质为环氧化物和萘醌；所述检测方法使用高效液相色谱仪进行，流动相为由乙腈-水-硫酸组成的混合液，采用等度洗脱，双波长检测。
所述杂质化学结构式如下所示：
。
优选的，所述检测方法具体操作步骤如下：
S1.制备供试品溶液：取盐酸普萘洛尔精密称定，用溶剂溶解并定量稀释制成供试品溶液；
S2.制备对照品溶液：分别取环氧化物对照品和萘醌对照品精密称定，用溶剂溶解并定量稀释制成各杂质对照品溶液；
S3.制备混合溶液Ⅰ：取盐酸普萘洛尔对照品加溶剂溶解，再精密加入环氧化物对照品，用溶剂定量稀释制成各杂质混合溶液Ⅰ；
S3.制备混合溶液Ⅱ：取盐酸普萘洛尔对照品加溶剂溶解，再精密加入萘醌对照品，用溶剂定量稀释制成各杂质混合溶液Ⅱ；
S5.制备杂质定位溶液：取环氧化物对照品精密称定，用溶剂溶解制成环氧化物定位溶液；取萘醌对照品精密称定，用溶剂溶解制成萘醌定位溶液；
S6.调节仪器：色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相，调节柱温，调节流动相比例，调节流速，调节检测波长；
S7.测定：精密量取S1～S5制成的各溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。
优选的，所述溶剂为乙腈-水-硫酸组成的混合液，乙腈-水-硫酸质量比为55：45：0.1。
优选的，所述S1供试品溶液中盐酸普萘洛尔的浓度为4.5～5.5mg/ml。
优选的，所述S2各杂质对照品溶液中环氧化物对照品和萘醌对照品的浓度均为0.02～0.04μg/ml。
优选的，所述S3中混合溶液盐酸普萘洛尔对照品的浓度为4.5～5.5mg/ml，环氧化物对照品浓度为0.02～0.04μg/ml。
优选的，所述S4中混合溶液盐酸普萘洛尔对照品的浓度为4.5～5.5mg/ml，萘醌对照品浓度为0.02～0.04μg/ml。
优选的，所述S5中各杂质定位溶液环氧化物定位溶液浓度为0.02～0.04μg/ml；萘醌定位溶液浓度为0.02～0.04μg/ml。
优选的，所述S6中色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶作为填充剂，规格为InertsilODS-3，250mm×4.6mm，5μm。
优选的，所述的流动相中乙腈比例为50～55，硫酸比例为0.05～0.2，流动相pH应为3.1～3.4；调节柱温为20～30℃，调节流动相流速为0.9～1.1ml/min，调节检测波长分别为220～230nm（环氧化物），240～250nm（萘醌）。
本发明所具有的有益效果如下：
本发明根据产品结构特点及化合物性质，提供了一种采用高效液相色谱仪即可同时测定盐酸普萘洛尔中两种遗传毒杂质的检测方法。上述两种遗传毒杂质与主成分及相邻杂质峰均得到有效分离，通过对条件的优化，使得对各组分检测的灵敏度和准确度进一步得到提升，并满足各杂质的限度要求，检测成本和操作难度大大降低；另外，研究发现，流动相pH对萘醌与普萘洛尔分离度有较大影响，降低pH有利于两者分离。
本发明方法采用设备简单、分析速度快、专属性好、检测成本低、准确度高，能够快速、简便、准确地控制杂质的量，降低药物安全风险。本发明方法专属性强、灵敏度高，便于对盐酸普萘洛尔的质量检测与杂质监控，有利于盐酸普萘洛尔杂质检测方法普及，有利于盐酸普萘洛尔的安全推广与应用。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1是本发明实施例一225nm波长下混合溶液的色谱图；
图2是本发明实施例一245nm波长下混合溶液的色谱图。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点，下面结合附图和具体实施例对本发明进行进一步的详细描述。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是，本发明还可以采用其他不同于此描述的方式来实施，因此，本发明的保护范围并不受下面公开的具体实施例的限制。
本实施例提供一种采用高效液相色谱仪同时测定盐酸普萘洛尔中两种遗传毒杂质的检测方法，采用以下条件进行测定：
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱的规格为Inertsil ODS-3，250mm×4.6mm，5μm；流动相为乙腈-水-硫酸（55：45：0.1）的混合液（取十二烷基硫酸钠1.6g和四丁基磷酸二氢铵0.31g溶于1000ml混合液中，用2mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至3.3±0.1）；调节柱温为20～30℃，调节流动相流速为0.9～1.1ml/min；检测波长：225nm，245nm；采用等度洗脱。
空白溶液：取溶剂（流动相）适量，置于进样小瓶中。
供试品溶液：取盐酸普萘洛尔适量，精密称定，用溶剂溶解并定量稀释制成4.5～5.5mg/ml的供试品溶液。
对照品溶液：取各杂质对照品适量，精密称定，用溶剂溶解并定量稀释制成0.02～0.04μg/ml的各杂质对照品溶液。
混合溶液Ⅰ：取盐酸普萘洛尔对照品适量，加少量溶剂使溶解，再精密加入环氧化物对照品，用溶剂定量稀释制成混合溶液；其中，盐酸普萘洛尔对照品的浓度为4.5～5.5mg/ml，环氧化物对照品的浓度为0.02～0.04μg/ml。
混合溶液Ⅱ：取盐酸普萘洛尔对照品适量，加少量溶剂使溶解，再精密加入萘醌对照品，用溶剂定量稀释制成混合溶液；其中，盐酸普萘洛尔对照品的浓度为4.5～5.5mg/ml，萘醌对照品的浓度为0.02～0.04μg/ml。
环氧化物定位溶液：取环氧化物对照品，精密称定，用溶剂溶解制成环氧化物定位溶液浓度为0.02～0.04μg/ml；
萘醌定位溶液：取萘醌对照品，精密称定，用溶剂溶解制成萘醌定位溶液浓度为0.02～0.04μg/ml。
实施例一
专属性试验
供试品溶液的配制：取盐酸普萘洛尔约50mg，精密称定，置10ml量瓶中，加溶剂使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。
对照品溶液的制备：取环氧化物对照品、萘醌对照品各适量，精密称定，用溶剂溶解并定量稀释制成0.03μg/ml的溶液，作为各杂质对照品溶液。
混合溶液Ⅰ的制备：取盐酸普萘洛尔对照品约50mg，加少量溶剂使溶解，精密加入环氧化物对照品，用溶剂稀释制成每1ml中含盐酸普萘洛尔对照品5mg，环氧化物对照品0.03μg的溶液，作为混合溶液Ⅰ。
混合溶液Ⅱ的制备：取盐酸普萘洛尔对照品约50mg，加少量溶剂使溶解，精密加入萘醌对照品各，用溶剂稀释制成每1ml中含盐酸普萘洛尔对照品5mg，萘醌对照品0.03μg的溶液，作为混合溶液Ⅱ。
环氧化物定位溶液的制备：取环氧化物对照品适量，精密称定，用溶剂溶解并稀释得到0.03μg/ml的溶液，作为环氧化物定位溶液。
萘醌定位溶液的制备：取萘醌对照品适量，精密称定，用溶剂溶解并稀释得到0.03μg/ml的溶液，作为萘醌定位溶液。
测定：色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶作为填充剂，流动相为乙腈-水-硫酸（55：45：0.1）的混合液（取十二烷基硫酸钠1.6g和四丁基磷酸二氢铵0.31g溶于1000ml混合液中，用2mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至3.3±0.1），柱温为25℃，流速为每分钟1ml，检测波长为225nm、245nm。
精密量取上述制备对照品溶液、混合溶液及杂质定位溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。结果如下表1和表2所示，混合溶液色谱图如图1和图2所示。
表1.专属性试验结果1
表2.专属性试验结果2
结论：空白溶剂不干扰供试品溶液中各已知杂质测定，两个杂质与主峰之间分离度均符合要求，本法专属性良好。
实施例二
线性与范围试验
线性溶液的制备：取环氧化物对照品、萘醌对照品各适量，精密称定，用溶剂溶解并定量稀释制成每1ml分别含0.3μg的溶液，作为各杂质贮备溶液，精密量取适量，用溶剂稀释制成系列线性溶液（包含定量限）。
精密量取上述各溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图；结果如下表3所示。
表3.线性与范围试验结果
结论：（1）环氧化物：在0.006～0.06μg/ml（相当于检测浓度的1.2ppm～12ppm）浓度范围内线性关系良好，线性回归方程为y=214918.1585x+5.8211，r=0.9994，Y轴截距相当于100%浓度响应值的百分比为0.09%。
（2）萘醌：在0.009～0.06μg/ml（相当于检测浓度的1.8ppm～12ppm）浓度范围内线性关系良好，线性回归方程为y=77725.6026x+84.4256，r=0.9997，Y轴截距相当于100%浓度响应值的百分比为3.59%。
实施例三
定量限与检测限试验
定量限和检测限是根据信噪比来确定。制备一定浓度的溶液，将测出的信号与空白处的信号（基线噪音）进行比较，计算有效检出浓度。信噪比约为10的浓度作为定量限，信噪比约为3的浓度作为检测限。结果如下表4和表5所示。
表4.定量限试验结果
表5.检测限试验结果
实施例四
回收率试验
对照品溶液的制备：
取环氧化物、萘醌对照品各适量，精密称定，用溶剂溶解并定量稀释制成每1ml中含环氧化物和萘醌各0.3μg/ml的溶液，作为各杂质对照品储备液。精密量取杂质对照品储备液1ml，置10ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，即得；平行配制2份。
准确度溶液的制备：
1）50%准确度溶液：取供试品约50mg，精密称定，置10ml量瓶中，加少量溶剂使溶解，加入杂质对照品储备液0.5ml，加溶剂稀释至刻度，摇匀；平行配制3份。
2）100%准确度溶液：取供试品约50mg，精密称定，置10ml量瓶中，加少量溶剂使溶解，再加入杂质对照品储备液1ml，加溶剂稀释至刻度，摇匀；平行配制3份。
3）150%准确度溶液：取供试品约50mg，精密称定，置10ml量瓶中，加少量溶剂使溶解，加入杂质对照品储备液1.5ml，加溶剂稀释至刻度，摇匀；平行配制3份。
本底溶液的制备：
取供试品约50mg，精密称定，置10ml量瓶中，加溶剂使溶解并稀释至刻度，摇匀。
精密量取上述溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，结果如下表6和表7所示。
表6.环氧化物回收率结果
表7.萘醌回收率结果
结论：杂质回收率试验结果显示，环氧化物、萘醌的9份准确度样品的回收率均在80%～120%之间，本方法准确度良好。
实施例五
耐用性试验
取实验例一中的环氧化物对照品溶液，分别于柱温20℃、30℃；流速0.9ml/min、1.1ml/min条件下进行试验，与标准条件对比结果如下表8所示。
表8.耐用性试验结果（理论板数）
取实验例一中的混合溶液2，分别于柱温23℃、27℃；流速0.9ml/min、1.1ml/min条件下进行试验，结果如下表9所示。
表9.耐用性试验结果（分离度）
结论：微调色谱条件下，环氧化物理论板数均符合要求，供试品中相邻杂质对检测无干扰；混合溶液2中萘醌与主峰间分离度均符合要求；表明本方法耐用性良好。
以上所述仅为本发明优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明还可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种同时测定盐酸普萘洛尔中两种遗传毒杂质的检测方法，其特征在于：所述两种遗传毒杂质为环氧化物和萘醌；所述检测方法使用高效液相色谱仪进行，流动相为由乙腈-水-硫酸组成的混合液，采用等度洗脱，双波长检测。
2.根据权利要求1所述的一种同时测定盐酸普萘洛尔中两种遗传毒杂质的检测方法，其特征在于：所述检测方法具体操作步骤如下：
S1.制备供试品溶液：取盐酸普萘洛尔精密称定，用溶剂溶解并定量稀释制成供试品溶液；
S2.制备对照品溶液：分别取环氧化物对照品和萘醌对照品精密称定，用溶剂溶解并定量稀释制成各杂质对照品溶液；
S3.制备混合溶液Ⅰ：取盐酸普萘洛尔对照品加溶剂溶解，再精密加入环氧化物对照品，用溶剂定量稀释制成各杂质混合溶液Ⅰ；
S3.制备混合溶液Ⅱ：取盐酸普萘洛尔对照品加溶剂溶解，再精密加入萘醌对照品，用溶剂定量稀释制成各杂质混合溶液Ⅱ；
S5.制备杂质定位溶液：取环氧化物对照品精密称定，用溶剂溶解制成环氧化物定位溶液；取萘醌对照品精密称定，用溶剂溶解制成萘醌定位溶液；
S6.调节仪器：色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相，调节柱温，调节流动相比例，调节流速，调节检测波长；
S7.测定：精密量取S1～S5制成的各溶液，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。
3.根据权利要求2所述的一种同时测定盐酸普萘洛尔中两种遗传毒杂质的检测方法，其特征在于：所述溶剂为乙腈-水-硫酸组成的混合液，乙腈-水-硫酸质量比为55：45：0.1。
4.根据权利要求2所述的一种同时测定盐酸普萘洛尔中两种遗传毒杂质的检测方法，其特征在于：所述S1供试品溶液中盐酸普萘洛尔的浓度为4.5～5.5mg/ml。
5.根据权利要求2所述的一种同时测定盐酸普萘洛尔中两种遗传毒杂质的检测方法，其特征在于：所述S2各杂质对照品溶液中环氧化物对照品和萘醌对照品的浓度均为0.02～0.04μg/ml。
6.根据权利要求2所述的一种同时测定盐酸普萘洛尔中两种遗传毒杂质的检测方法，其特征在于：所述S3中混合溶液盐酸普萘洛尔对照品的浓度为4.5～5.5mg/ml，环氧化物对照品浓度为0.02～0.04μg/ml。
7.根据权利要求2所述的一种同时测定盐酸普萘洛尔中两种遗传毒杂质的检测方法，其特征在于：所述S4中混合溶液盐酸普萘洛尔对照品的浓度为4.5～5.5mg/ml，萘醌对照品浓度为0.02～0.04μg/ml。
8.根据权利要求2所述的一种同时测定盐酸普萘洛尔中两种遗传毒杂质的检测方法，其特征在于：所述S5中各杂质定位溶液环氧化物定位溶液浓度为0.02～0.04μg/ml；萘醌定位溶液浓度为0.02～0.04μg/ml。
9.根据权利要求2所述的一种同时测定盐酸普萘洛尔中两种遗传毒杂质的检测方法，其特征在于：所述S6中色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶作为填充剂，规格为Inertsil ODS-3，250mm×4.6mm，5μm。
10.根据权利要求2所述的一种同时测定盐酸普萘洛尔中两种遗传毒杂质的检测方法，其特征在于：所述的流动相中乙腈比例为50～55，硫酸比例为0.05～0.2，流动相pH应为3.1～3.4；调节柱温为20～30℃，调节流动相流速为0.9～1.1ml/min，调节检测波长分别为220～230nm，240～250nm。
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