CN115840008A - 一种盐酸乌拉地尔原料药中基因毒性杂质的测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测盐酸乌拉地尔原料药中基因毒性杂质6‑[[3‑(2‑甲氧基苯氨基)丙基]氨基]‑1,3‑二甲基尿嘧啶的测定方法，该方法分离度好、专属性强、灵敏度高、准确度好，能够对盐酸乌拉地尔原料药中的基因毒性杂质6‑[[3‑(2‑甲氧基苯氨基)丙基]氨基]‑1,3‑二甲基尿嘧啶进行控制，保证最终产品的质量及用药安全。
Description
技术领域
本发明属于药物化学及分析领域，具体涉及一种盐酸乌拉地尔原料药中基因毒性杂质的测定方法。
背景技术
乌拉地尔可以阻断突触后膜α1受体及突触前α2受体，有中枢性降压作用，可以降低外周阻力，降低血压，在降压同时不会引起反射性心动过速。在临床上主要用于各类型的高血压及手术前、中、后对高血压的控制性降压，另外还可用于治疗伴有前列腺肥大症的排尿障碍。盐酸乌拉地尔是临床使用的盐酸乌拉地尔注射液及乌拉地尔缓释片的原料药，其分子结构见式1。
6-[[3-(2-甲氧基苯氨基)丙基]氨基]-1,3-二甲基尿嘧啶(下文中简称6-PADP)，分子结构见式2，是在乌拉地尔合成过程中可能产生的一个潜在杂质，为盐酸乌拉地尔合成中间体P2与起始物料SM3中的杂质SM3-4发生取代反应的产物，具体产生途径见式3、式4。目前关于盐酸乌拉地尔的合成路线几乎都会包含中间体P2和起始物料SM3，所以开发一种检测盐酸乌拉地尔原料药中杂质6-[[3-(2-甲氧基苯氨基)丙基]氨基]-1,3-二甲基尿嘧啶的分析方法是十分必要的。
6-PADP属于苯胺类衍生物，可能具有潜在的遗传毒性，采用(Q)SAR方法(专家规则和统计学，Derek、Sarah)做了基因毒性预测。预测结果显示，6-PADP为Class3，即“致癌性未知的已知致突变物”，故在原料药中应将该杂质按照基因毒性杂质控制，基于TTC(1.5μg/天)计算可接受摄入量。
参照盐酸乌拉地尔注射液说明书，本品的最大日剂量按乌拉地尔计为250mg，计算其限度为1.5(μg/天)×1000/250(mg/天)/1.094＝5.48ppm。故盐酸乌拉地尔中杂质6-PADP应按照小于5ppm的控制限度开发检测方法。这种低限度的检测方法，依据中国药典乌拉地尔项下的有关物质检测方法是无法有效检测的，故此一种更加灵敏、准确的检测基因毒性杂质6-PADP的方法急需建立并用于该杂质的检测。
发明内容
本发明的目的在于建立一种用于盐酸乌拉地尔原料药中基因毒性杂质6-PADP的分析方法，该方法分离度好、专属性强、灵敏度高、准确度好，能够对盐酸乌拉地尔原料药中杂质6-PADP进行控制，保证最终产品的质量。
为了达到上述目的，本发明采用高效液相色谱法与质谱法联用的方法检测盐酸乌拉地尔原料药中基因毒性杂质6-PADP，通过如下技术方案实现：
检测条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(CORTECS C18 3.0mm×75mm，2.7μm或效能相当的色谱柱)；以0.02mol/L甲酸铵溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，按下表进行线性梯度洗脱；流速为每分钟0.5ml；柱温为30℃；检测器为质谱检测器；离子源为电喷雾离子源(ESI)；采集模式为正离子SIM模式采集；监测离子为319.2；质谱采集时间为8min～13min；进样体积为5μl。
测定方法：精密量取供试品溶液与对照品溶液，分别注入高效液相色谱-质谱联用仪，记录质谱图。按峰面积外标法计算杂质6-PADP含量，计算公式如下：
式中：
M对：对照品溶液中杂质的称样量，mg；
A对：对照品溶液中杂质的峰面积的平均值；
M供：供试品溶液的称样量，mg；
A供：供试品溶液中杂质的峰面积。
所述供试品溶液：取本品适量，精密称定，加水溶解并定量稀释制成每lmL中约含4mg的溶液。
所述对照品溶液：取杂质6-PADP对照品约2mg，精密称定，置100ml量瓶中，加乙腈2ml使溶解，用水定量稀释制成每lml中约含20ng的溶液。
本发明取得以下有益技术效果：
由于采用了上述分析方法，使得本发明分离度好、专属性强、灵敏度高、准确度好，能够对盐酸乌拉地尔原料药中杂质6-PADP进行控制，保证最终产品的质量，同时也可为盐酸乌拉地尔中其他限度极低的杂质的检测提供有益的借鉴和依据。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1为对比例1中加标混合溶液色谱图；
图2为对比例2中中加标混合溶液色谱图；
图3为对比例3中中加标混合溶液色谱图；
图4为对比例4中对照品溶液质谱图。
具体实施方式
通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，本发明并不限于下面的实施例，这些实施例不以任何方式限制本发明的范围。本领域的技术人员在权利要求的范围内所做出的某些改变和调整也应认为属于本发明的范围。
试剂与材料
水：实验室自制GB/T6682-2008规定的一级水
甲酸铵：分析纯
乙酸铵：色谱纯
乙腈：色谱纯
甲酸：色谱纯
仪器与设备
Agilent1260+G6125c型高效液相色谱-质谱联用仪
梅特勒XS105DU型分析天平
梅特勒MS304TS型分析天平
Sartorius MSA6.6S-OCE-DM型分析天平
实施例：
1、溶液配制：
对照品贮备液：精密称取杂质6-PADP对照品2.029mg，置100ml量瓶中，加乙腈2.0ml使溶解，用水稀释至刻度，摇匀，即得。
对照品母液：精密量取对照品贮备液1.0ml，置100ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得。
(1)专属性溶液：
空白溶液：水。
对照品溶液：精密量取对照品母液5.0ml，置50ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得。
供试品溶液：精密称取供试品(盐酸乌拉地尔原料药)40.81mg，置10ml量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
加标供试品溶液：精密称取供试品40.92mg，置10ml量瓶中，用对照品溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
(2)灵敏度溶液：
定量限溶液(LOQ)：精密量取专属性溶液中对照品溶液1.0ml，置10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得。
检测限溶液(LOD)：精密量取定量限溶液3.0ml，置10ml量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得。
(3)线性溶液：
线性6#溶液：精密量取对照品母液10.0ml，置50ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得。
线性1#～5#溶液：精密量取线性6#溶液各1.0ml、3.0ml、5.0ml、7.0ml、9.0ml，分别置不同的10ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，作为线性1#～5#溶液。
(4)准确度溶液：
对照品溶液：精密量取对照品母液10.0ml，置100ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得。
供试品溶液：精密称取供试品40.28mg，置10ml量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。
加标供试品溶液：取供试品约40mg，精密称定，置10ml量瓶中，用对照品溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。平行配制6份，称重分别为40.13mg、40.57mg、40.85mg、40.25mg、40.59mg、40.06mg。
(5)溶液稳定性溶液：
对照品溶液：取专属性溶液中的对照品溶液，在室温下放置，分别于0h、0.5h、3h、3.5h、6h时间点检测。
加标供试品溶液：取专属性溶液中的加标供试品溶液，在室温下放置，分别于0h、0.5h、3h、3.5h、6h时间点检测。
2、检测条件：色谱柱(CORTECS C18 3.0mm×75mm，2.7μm或效能相当的色谱柱)；以0.02mol/L甲酸铵溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，按下表进行线性梯度洗脱；流速为每分钟0.5ml；柱温为30℃；检测器为质谱检测器；离子源为电喷雾离子源(ESI)；采集模式为正离子SIM模式；监测离子为319.2；质谱采集时间为8min～13min；进样体积为5μl。
3、测定方法：精密量取各待测溶液，分别注入高效液相色谱-质谱联用仪，记录质谱图。
该实施例对本方法的专属性、准确度、精密度(重复性、进样精密度)、灵敏度(检测限、定量限)、线性与范围、耐用性(溶液稳定性)进行了验证，验证结果汇总如下：
根据上表的结果说明，该方法专属性强、准确度好、灵敏度高，从而能够实现对盐酸乌拉地尔原料药中基因毒性杂质6-[[3-(2-甲氧基苯氨基)丙基]氨基]-1,3-二甲基尿嘧啶的定量监控，同时也为盐酸乌拉地尔中其他限度低的杂质检测提供有益的借鉴和依据。
对比例1：使用以下色谱条件测定加标混合溶液，从图1可以看出供试品主峰与杂质6-PADP不能实现基线分离。
对比例2：使用以下色谱条件测定加标混合溶液，从图2可以看出供试品主峰与杂质6-PADP保留时间分别为11.3min、11.8min，分离度为2.8。此条件下6-PADP处于供试品主峰拖尾处，质谱检测时主成分会干扰杂质6-PADP检测。
对比例3：使用以下色谱条件测定加标混合溶液，从图3可以看出该条件下，供试品主峰与杂质6-PADP保留时间分别为5.0min、9.0min，分离度为7.8。此条件下6-PADP仍处于供试品主峰拖尾处，质谱检测时主成分仍会干扰杂质检测。
对比例4：使用以下色谱条件和质谱条件测定对照品溶液中目标杂质，从图4可以看出该条件下，采集模式为scan模式时，杂质6-PADP灵敏度较底，不满足检测要求。
Claims (9)
1.一种盐酸乌拉地尔原料药中基因毒性杂质的测定方法，其特征在于，所述基因毒性杂质为6-[[3-(2-甲氧基苯氨基)丙基]氨基]-1,3-二甲基尿嘧啶，所述测定方法包括以下步骤：
(1)取盐酸乌拉地尔原料药适量，精密称定，加水溶解并定量稀释制成供试品溶液；
(2)取杂质6-[[3-(2-甲氧基苯氨基)丙基]氨基]-1,3-二甲基尿嘧啶对照品，精密称定，加乙腈溶解，用水定量稀释制成对照品溶液；
(3)精密量取供试品溶液与对照品溶液，分别注入高效液相色谱-质谱联用仪，记录质谱图，按峰面积外标法计算杂质6-[[3-(2-甲氧基苯氨基)丙基]氨基]-1,3-二甲基尿嘧啶的含量。
2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，步骤(1)中所述供试品溶液的浓度为4mg/mL，步骤(2)中所述对照品溶液的浓度为20ng/mL。
3.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，步骤(3)中所述杂质含量的计算方法如下：
式中：
M对：对照品溶液中杂质的称样量，mg；
A对：对照品溶液中杂质的峰面积的平均值；
M供：供试品溶液的称样量，mg；
A供：供试品溶液中杂质的峰面积。
4.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于，步骤(3)中所述高效液相色谱-质谱联用仪的检测条件如下：以甲酸铵溶液为流动相A，以乙腈为流动相B，按下表进行线性梯度洗脱；流速为每分钟0.5ml；柱温为30℃；检测器为质谱检测器；
5.根据权利要求4所述的测定方法，其特征在于，所述高效液相色谱-质谱联用仪采用十八烷基硅烷键合硅胶为色谱柱填充剂。
6.根据权利要求5所述的测定方法，其特征在于，所述色谱柱为CORTECS C18 3.0mm×75mm，2.7μm或效能相当的色谱柱。
7.根据权利要求4所述的测定方法，其特征在于，所述甲酸铵溶液的浓度为0.02mol/L。
8.根据权利要求4所述的测定方法，其特征在于，所述质谱检测器的离子源为电喷雾离子源；
采集模式为正离子SIM模式；监测离子为319.2；质谱采集时间为8min～13min。
9.根据权利要求4所述的测定方法，其特征在于，进样体积为5μL。
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