CN113655150B - 盐酸倍他司汀中氮氧自由基哌啶醇的检测方法 - Google Patents

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Abstract

提供一种盐酸倍他司汀中氮氧自由基哌啶醇的检测方法，色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以甲醇‑水＝60：40为流动相A，甲醇‑水＝90：10为流动相B，通过梯度洗脱，以高效液相色谱法测定盐酸倍他司汀中氮氧自由基哌啶醇杂质，操作简便、灵敏度高、准确度高、重现性好，弥补了现有技术的不足。

Description

盐酸倍他司汀中氮氧自由基哌啶醇的检测方法
技术领域
本发明属于分析化学领域，具体涉及一种盐酸倍他司汀中氮氧自由基哌啶醇的高效液相色谱检测方法。
背景技术
盐酸倍他司汀(Betahistine Hydrochloride)为用于血管扩张药物，CAS No.5579-84-0，结构式如下：
Figure BDA0003245597030000011
盐酸倍他司汀为H1受体激动剂。对脑血管，特别是对锥底动脉系统有较明显的扩张作用，显著增加心、脑及周围循环血流量，改善血循环，并降低全身血压，此外能增加耳蜗和前庭血流量从而消除内耳性眩晕，耳鸣和耳闭感，还能增加毛细血管通透性，促进细胞外液的吸收，消除淋巴内水肿，能对抗儿茶酚胺的缩血管作用并降低动脉压，并有抑制血液凝固及ADP诱导的血小板凝集作用，能延长大鼠体外血形成时间，还有轻微的利尿作用。
在临床中，盐酸倍他司汀主要用于美尼尔氏综合症、血管性头痛及脑动脉硬化，并可用于治疗急性缺血性脑血管疾病，如脑血栓、脑栓塞、一过性脑供血不足等；高血压所致直立性眩晕、耳鸣等。
盐酸倍他司汀已知杂质有氮氧自由基哌啶醇、乙烯吡啶、2-羟乙基吡啶、N- 甲基-2-吡啶乙胺等。其中氮氧自由基哌啶醇，CAS No.2226-96-2，结构如下：
Figure BDA0003245597030000012
氮氧自由基哌啶醇在AMES试验中对鼠伤寒沙门氏菌株TA100呈阳性，在哺乳动物细胞基因突变试验中呈阳性，符合第二类基因毒性杂质定义，故该杂质应不高于可接受限度。
为科学地对盐酸倍他司汀的质量进行评价，保证临床用药更加安全有效，有必要提供一种盐酸倍他司汀中氮氧自由基哌啶醇的检测方法。
现有技术中对盐酸倍他司汀中有关物质的检测方法有相关报道。
例如，《高效液相色谱法测定盐酸倍他司汀片的有关物质》(吴随风等，化学分析计量2005年，第14卷，第3期)报道了采用Kramasil C18分析柱，水-乙腈(体积比为68∶32)混合液为流动相，流速为1.0mL/min，检测波长为261nm，用高效液相色谱法测定盐酸倍他司汀片的有关物质。
《高效液相色谱法测定盐酸倍他司汀片的有关物质》(王冬等，中国药业， 2013年6月20日第22卷第12期)报道了采用C18色谱柱(250mm×4.6mm， 5μm)，以混合溶液(取磷酸二氢钠2.76g和十二烷基硫酸钠1.60g，用水600 mL溶解)-乙腈-己胺(600∶400∶1.6，用磷酸调pH至3.5)为流动相，检测波长 254nm，流速为1.0mL/min，柱温50℃，进样量100μL测定盐酸倍他司汀片的有关物质。
《HPLC法测定盐酸倍他司汀氯化钠注射液中主药及其有关物质的含量》(代广会等，中国药房2008年第19卷第4期)报道了色谱柱为Eclipse XDB-C18流动相为水(庚烷磺酸钠1g加三乙胺10mL水810mL磷酸调pH3·0)-甲醇(82∶ 18)检测波长为261nm流速为0.8mL·min-1柱温为25℃,进样量为50μL测定盐酸倍他司汀的有关物质。
《HPLC法测定盐酸倍他司汀氯化钠注射液的有关物质》(许文东等，齐鲁药事，2006Vol.25，No.5)报道了用CapcellPAKC18色谱柱(250mm×4.6mm,5μm),6.0 ×10-4mol·L-1的醋酸钠乙腈溶液-0.25％的十二烷基硫酸钠水溶液(40∶60)加1％的二乙胺，用冰醋酸调pH4.5作为流动相，流速为1.0ml·min-1，检测波长为 261nm测定盐酸倍他司汀的有关物质。
《盐酸倍他司汀片有关物质检测方法研究》(朱蓉等，药物分析杂志2015， 35(1))报道了采用高效液相色谱法，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以缓冲液(称取醋酸铵0.69g，用1000mL水溶解，以冰醋酸调节pH至4.7后，再加4.43g十二烷基硫酸钠溶解，脱气)，乙腈-缓冲液(60∶40)为流动相，流速1.0mL·min-1，检测波长259nm，柱温40℃测定盐酸倍他司汀的有关物质。
以上现有技术文献提供了以液相色谱法测定盐酸倍他司汀的有关物质的方法。但是以上方法不涉及检测盐酸倍他司汀中氮氧自由基哌啶醇杂质，也不涉及梯度洗脱的测定方法，色谱条件选择与本申请也不同。
因此，现有技术中没有报道盐酸倍他司汀中氮氧自由基哌啶醇杂质的检测方法。迫切需要建立一种操作简便、灵敏度高、准确度高、重现性好的盐酸倍他司汀中氮氧自由基哌啶醇的检测方法。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于建立一种盐酸倍他司汀中氮氧自由基哌啶醇的检测方法，以有效控制盐酸倍他司汀的产品质量。
本发明采用高效液相色谱法测定盐酸倍他司汀中氮氧自由基哌啶醇，操作简便、灵敏度高、准确度高、重现性好，弥补了现有技术的不足。
本发明所述的具体技术方案如下：
提供一种盐酸倍他司汀中氮氧自由基哌啶醇的高效液相色谱检测方法：
色谱条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水＝60：40 为流动相A，甲醇-水＝90：10为流动相B；检测波长为242nm；柱温30℃；流速： 0.8-1.5ml/min；按下表进行梯度洗脱；
样品溶液配制：取盐酸倍他司汀，精密称定，用甲醇-水＝60:40溶解并稀释制成每1ml中含1mg的溶液作为供试品溶液；另取氮氧自由基哌啶醇对照品适量，精密称定，用甲醇-水＝60:40溶解并稀释制成每1ml中含30ng的溶液，作为对照品溶液；
检测方法：精密量取供试品溶液与对照品溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图；供试品溶液的色谱图中如有与氮氧自由基哌啶醇保留时间一致的色谱峰，按外标法以峰面积计算含量。
Figure BDA0003245597030000031
本发明中，十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱优选为ZORBAX SB-C18，250mm×4.6mm，5μm。
本发明中，流速优选为1.0ml/min。
本发明中，氮氧自由基哌啶醇的含量不超过盐酸倍他司汀含量的0.003％。
附图说明：
图1为对照品色谱图；
图2为样品色谱图；
图3为对照+样品色谱图。
具体实施方式：
实施例1色谱条件
1.1确定检测波长
称取氮氧自由基哌啶醇对照品，用甲醇-水(60:40)稀释制成每1ml中含 62.5μg的溶液，取适量置石英比色皿中，在200nm～400nm波长范围内扫描，在242.6nm的波长处有最大吸收。故确定氮氧自由基的检测波长为在242nm。
1.2其他色谱条件
色谱柱：ZORBAX SB-C18，250mm×4.6mm，5μm
流动相：A甲醇-水(60:40)，B甲醇-水(90:10)
按下表梯度洗脱：
Figure BDA0003245597030000041
柱温：30℃
流速：1.0ml/min
检测波长：242nm
进样量：20μl
实施例2方法学验证
2.1专属性试验
精取溶剂(甲醇-水60:40)20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。
结论：空白溶剂在氮氧自由基哌啶醇对照品保留时间(3.5分钟)处无吸收峰干扰测定。
2.2线性与范围
称取氮氧自由基哌啶醇对照品0.01523g，置50ml量瓶中，用甲醇-水(60:40) 溶解并稀释至刻度，摇匀，精取1ml置100ml量瓶中，用上述溶剂稀释至刻度，摇匀，作为贮备液(约3μg/ml)。精取上述贮备液1ml，置100ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为线性溶液A(约30ng/ml)。精取上述贮备液1ml，置 50ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，作为线性溶液B(约60ng/ml)。
分别精取溶液A和溶液B，按下表稀释，即得各线性溶液。
线性溶液 精取溶液A(ml) 量瓶(ml) 各约含(ng/ml)
① 6 10 18
② 7 10 21
③ 9 10 27
④ / / 30
线性溶液 精取溶液B(ml) 量瓶(ml) 各约含(ng/ml)
⑤ 5.5 10 33
⑥ 6 10 36
⑦ / / 60
精取线性溶液①～⑦各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。以溶液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，结果见表1。
表1氮氧自由基哌啶醇线性与范围试验结果
Figure DEST_PATH_IMAGE001
结果表明：氮氧自由基哌啶醇在浓度为18.28ng/ml～60.92ng/ml时与峰面积呈良好的线性关系，相关系数大于0.999。
2.3检测限
精取线性溶液A1.5ml置10ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，即得。精取30μl注入液相色谱仪，记录色谱图。氮氧自由基哌啶醇色谱峰的s/n＝2.77，其在该色谱条件下的检测限为0.14ng。
2.4.定量限
精取线性溶液①20μl注入液相色谱仪，记录色谱图。氮氧自由基哌啶醇色谱峰的s/n＝9.88，其在该色谱条件下的检测限为0.37ng。
2.5精密度试验
精取“线性与范围”中贮备液1ml，置100ml量瓶中，用甲醇-水(60:40) 稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。精取上述溶液20μl，注入液相色谱仪，重复进样6次，记录色谱图。结果见下表。
表2进样精密度试验结果
次数 1 2 3 4 5 6 RSD％
峰面积 393 350 359 360 392 360 5.04
结论：对照品溶液连续进样6次，峰面积RSD小于6％，进样精密度良好。
2.6重复性试验
称取盐酸倍他司汀样品①0.01150g，②0.01077g，③0.01039g，④ 0.01122g，⑤0.01030g，⑥0.01042g，分别置10ml量瓶中，加甲醇-水(60:40) 溶解并稀释至刻度，摇匀，作为重复性样品溶液。
精取上述溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。6份样品中均未检出氮氧自由基哌啶醇。
2.7中间精密度试验
不同分析人员在不同时间、不同机器上的6次测定结果，验证方法的重现性。
称取盐酸倍他司汀样品①10.84mg，②10.07mg，③11.00mg，④ 10.86mg，⑤10.30mg，⑥10.15mg，分别置10ml量瓶中，加甲醇-水(60:40) 溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。精密称取氮氧自由基哌啶醇对照品 15.09mg，用甲醇-水(60:40)溶解并定量稀释制成30.18ng/ml的对照品溶液。
精取上述溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。6份样品中均未检出氮氧自由基哌啶醇。
结论：6份样品的测定结果与重复性试验结果一致，方法中间精密度良好。
2.8准确度试验-回收率试验
以氮氧自由基哌啶醇限度(30ppm)的80％、100％和120％配制回收率各浓度供试品溶液。
精密称取氮氧自由基哌啶醇对照品15.63mg置100ml量瓶中，用甲醇-水 (60:40)溶解并定量稀释制成62.52ng/ml的对照品贮备液。精取对照品贮备液 5ml置10ml量瓶中，用溶剂稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液。
取盐酸倍他司汀样品约10mg，精密称定，共9份，分别置10ml量瓶中，加 2ml甲醇-水(60:40)使溶解，分别精密加入对照品贮备液4ml、5ml和6ml，各 3份，用甲醇-水(60:40)稀释至刻度，摇匀，即得供试品溶液。
精取上述溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，计算氮氧自由基哌啶醇的回收率。结果见下表。
表3回收率试验结果
Figure BDA0003245597030000071
结论：本法测得的盐酸倍他司汀中氮氧自由基哌啶醇的平均回收率在80％～115％之间，9份样品的RSD％小于11％，表明本方法准确度较好。
2.9稳定性
2.9.1对照品溶液的稳定性
精密吸取线性贮备液A 20μl，分别于0时、2时、4时、6时和16时注入液相色谱仪，记录色谱图。结果见下表。
表4对照品溶液稳定性试验结果
时间(小时) 0 2 4 6 16 平均 RSD(％)
峰面积 393 383 378 369 365 377.6 2.96
结果表明，对照品溶液在16小时内稳定。
2.9.2样品溶液的稳定性
精密吸取重复性样品溶液①20μl，分别于0时、2时、4时、6时、8时和 18时注入液相色谱仪，记录色谱图。结果供试品溶液在对照品溶液色谱峰保留时间处均未检出氮氧自由基哌啶醇色谱峰。
2.9.3样品与对照品混合溶液的稳定性
精密吸取回收率样品溶液④20μl，分别于0时、2.5时、6时、9.5时、19 时和22时注入液相色谱仪，记录色谱图。
表5样品与对照品混合溶液稳定性试验结果
时间(小时) 0 2.5 6 9.5 19 22 平均 RSD(％)
峰面积 311 315 310 271 226 215 274.7 16.40
结果表明，对照品与盐酸倍他司汀样品混合后，氮氧自由基哌啶醇在溶液中稳定性降低，混合溶液仅在6小时内稳定。
2.10耐用性
样品溶液：中间精密度试验样品①。对照品溶液：中间精密度试验对照品溶液。精取上述溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。更换不同品牌的色谱柱，盐酸倍他司汀与氮氧自由基哌啶醇的出峰顺序发生变化，影响氮氧自由基哌啶醇的检出。使用同一品牌相同填料的另一根色谱柱试验，二者的色谱行为与前述试验一致。结果见下表。
表6两根ZORBAX SB-C18(5μm,4.6*250mm)测定结果
Figure BDA0003245597030000081

Claims (3)

1.盐酸倍他司汀中氮氧自由基哌啶醇的检测方法，其特征在于：
以高效液相色谱法检测，色谱条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水＝60：40为流动相A，甲醇-水＝90：10为流动相B；检测波长为242nm；柱温30℃；流速：0.8-1.5ml/min；按下表进行梯度洗脱；
Figure FDA0003763969700000011
样品溶液配制：取盐酸倍他司汀，精密称定，用甲醇-水＝60:40溶解并稀释制成每1ml中含1mg的溶液作为供试品溶液；另取氮氧自由基哌啶醇对照品适量，精密称定，用甲醇-水＝60:40溶解并稀释制成每1ml中含30ng的溶液，作为对照品溶液；
检测方法：精密量取供试品溶液与对照品溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图；供试品溶液的色谱图中如有与氮氧自由基哌啶醇保留时间一致的色谱峰，按外标法以峰面积计算含量；所述十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱为ZORBAX SB-C18，250mm×4.6mm，5μm。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于流速为1.0ml/min。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于氮氧自由基哌啶醇的含量不超过盐酸倍他司汀含量的0.003％。
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