CN112946107B - 一种阿加曲班原料药或制剂中n-亚硝基二甲胺、n-亚硝基二乙胺的分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种阿加曲班原料药或制剂中N‑亚硝基二甲胺、N‑亚硝基二乙胺的分析方法，采用超高效液相色谱(UPLC)与质谱联用的方法，包括：步骤(1)配制供试品溶液和对照品溶液：以甲醇为溶剂，溶解待测样品，配制得到供试品溶液；以甲醇为溶剂，溶解N‑亚硝基二甲胺、N‑亚硝基二乙胺的标准品，配制得到对照品溶液；步骤(2)取供试品溶液和对照品溶液分别进样，用超高效液相色谱‑质谱仪进行检测，记录色谱图；按照外标法计算N‑亚硝基二甲胺、N‑亚硝基二乙胺的含量。本发明提供的液质联用法，样品处理过程操作简单，灵敏度高，检测结果准确，稳定性好，并且可用于阿加曲班原料药或制剂的质量控制。
Description
技术领域
本发明属于药物分析技术领域，具体涉及一种阿加曲班原料药或制剂中杂质N-亚硝基二甲胺、N-亚硝基二乙胺的分析方法。
背景技术
阿加曲班化学名为(2R,4R)-4-甲基-1-[N-[(3-甲基-1,2,3,4-四氢-8-喹啉基)磺酰]-L-精氨酰]-2-哌啶甲酸，其化学结构如式I所示，是由田边三菱公司开发的直接凝血酶抑制剂，最早于1990年获日本PMDA批准上市，后又于2000年获美国FDA批准上市。主要用于：(1)急性脑血栓患者发病后48小时内的运动障碍和日常生活质量改善；(2)慢性动脉闭塞症，改善四肢溃疡，静息痛和清凉感；(3)防止透析患者体外循环血液凝固；(4)肝素引起的血小板减少症(HIT)Ⅱ型患者血栓症的治疗；(5)血小板减少症(HIT)患者行PCI手术的抗凝。
阿加曲班是L-精氨酸衍生物，通过可逆地抑凝血酶催化或诱导的反应，包括血纤维蛋白酶C的活化，及血小板聚集发挥其抗凝血作用。
在阿加曲班原料药的合成过程中，第一步反应中使用了三乙胺，第三步反应会氢化脱掉硝基的同时可能会产生亚硝基，且第三步反应是酸性环境。所以三乙胺残留至第三步反应中，可能会产生NDMA(N-亚硝基二甲胺)、NDEA(N-亚硝基二乙胺)等，反应过程如式II所示，产生副产物NDMA(N-亚硝基二甲胺)、NDEA(N-亚硝基二乙胺)，其化学结构如式III、式IV所示，该副产物可进一步转移存在于阿加曲班原料药及终产品阿加曲班制剂中。
近年来的“缬沙坦事件”引起了人们亚硝胺类化合物的重视。亚硝胺类杂质属于ICH M7(R1)(《评估和控制药物中DNA反应性(致突变)杂质以限制潜在致癌风险》)指南中提及的“关注队列”物质。根据世界卫生组织公布的致癌物清单，NDMA和NDEA均属于2A类致癌物质，针对这两种潜在毒性杂质开发灵敏、高效、专属性强的分析方法，严格控制其含量是药物质量控制的关键一环。
然而，关于阿加曲班原料药或制剂中杂质N-亚硝基二甲胺、N-亚硝基二乙胺的含量测定的方法目前在国内外还没有报道。因此，应制定分析方法，严格控制阿加曲班原料药或制剂中的N-亚硝基二甲胺、N-亚硝基二乙胺的含量，以保障临床用药安全。
发明内容
本发明的目的是提供一种阿加曲班原料药或制剂中N-亚硝基二甲胺、N-亚硝基二乙胺的分析方法，采用超高效液相色谱(UPLC)与质谱联用的方法，对其在系统适用性、专属性、精密度、检测限、定量限、准确度和耐用性等方面进行验证，使其完全符合中国药典方法验证的指导原则，并且可用于阿加曲班原料药或制剂的质量控制。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种阿加曲班原料药或制剂中杂质N-亚硝基二甲胺、N-亚硝基二乙胺的分析方法，采用超高效液相色谱(UPLC)与质谱联用，包括以下步骤：
步骤(1)配制供试品溶液和对照品溶液：以甲醇为溶剂，溶解待测样品，配制得到供试品溶液；以甲醇为溶剂，溶解N-亚硝基二甲胺、N-亚硝基二乙胺的标准品，配制得到对照品溶液；
步骤(2)取供试品溶液和对照品溶液分别进样，用超高效液相色谱-质谱仪进行检测，记录色谱图；
其中，所述的超高效液相色谱条件为：色谱柱：苯基色谱柱，4.6mm×100mm(直径×长度)；流速：0.8±0.05ml/min；柱温：30±5℃；流动相A：浓度为0.05％-0.5％的甲酸水溶液；流动相B：甲醇；梯度洗脱条件如下：
| 时间(min) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0 | 85-95 | 5-15 |
| 6 | 5-15 | 85-95 |
| 12 | 5-15 | 85-95 |
| 12.1 | 85-95 | 5-15 |
| 15 | 85-95 | 5-15 |
梯度洗脱条件优选：
| 时间(min) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0 | 90 | 10 |
| 6 | 10 | 90 |
| 12 | 10 | 90 |
| 12.1 | 90 | 10 |
| 15 | 90 | 10 |
所述的质谱条件为：质谱仪：三重四级杆质谱仪；质谱方法模式：多反应检测扫描(MRM)；大气压化学电离源(APCI)；正离子谱(ES+)；
按照外标法计算N-亚硝基二甲胺、N-亚硝基二乙胺的含量。
进一步的，
所述的步骤(1)中，流动相A为浓度为0.05％-0.2％的甲酸水溶液，优选0.08％-0.12％的甲酸水溶液，更优选浓度为0.1％的甲酸水溶液。
所述的步骤(1)中，所述的待测样品为阿加曲班原料药或阿加曲班制剂，阿加曲班制剂优选阿加曲班注射液。
所述的步骤(1)中，可分别配制N-亚硝基二甲胺或N-亚硝基二乙胺的对照品溶液，也可以将这两种杂质的标准品混合配制在同一对照品溶液中。具体配制步骤包括：取N-亚硝基二甲胺、N-亚硝基二乙胺标准品加甲醇溶解成各自浓度为0.1-1mg/ml的溶液，再用甲醇溶液稀释成分别含N-亚硝基二甲胺、N-亚硝基二乙胺0.1-100ng/ml的对照品溶液，优选N-亚硝基二甲胺、N-亚硝基二乙胺在对照品溶液中各自的浓度优选1-50ng/ml，更优选2-20ng/ml。
在一些实施例中，所述的对照品溶液含N-亚硝基二甲胺16ng/ml、N-亚硝基二乙胺4.5ng/ml。
在另一些实施例中，所述的对照品溶液含N-亚硝基二甲胺8ng/ml、N-亚硝基二乙胺2.25ng/ml。
所述的步骤(1)中，供试品溶液含有阿加曲班0.25-100mg/ml，优选0.5-50mg/ml，更优选1-10mg/ml。本发明所述的阿加曲班包含阿加曲班及其药学上可接受的盐，其在供试品溶液中的浓度均以阿加曲班计。
所述的步骤(1)中，待测样品为阿加曲班注射液时，可以用作供试品溶液直接进样，也可以用甲醇进一步稀释制成供试品溶液，优选直接进样。
所述的步骤(2)中，进样体积为5-10μL。
所述的步骤(2)中，高效液相苯基色谱柱优选ACE 5phenyl(填料为苯基化学键合到多孔硅胶颗粒上)；所述的质谱仪优选Waters XEVO TQ-S。
所述的步骤(2)中，质谱条件进一步包括：电晕针电流：2.0μA；Probe Temperature(气化温度)：450℃；Source Temperature(源温度)：150℃，质谱采集时间为0-4.6min。
N-亚硝基二甲胺、N-亚硝基二乙胺出峰时间分别为2.4min、3.8min左右，供试品溶液4.6min之后改为waster模式(不进质谱)。
NDMA在小鼠与大鼠的TD50值分别为0.189mg/kg/天和0.0959mg/kg/天。按照更为保守的大鼠TD50值0.0959mg/kg/天和人体重50kg来计算人对NDMA的每日最大摄入量为：0.0959mg/kg/天×50kg/50000＝0.0000959mg/天≈96ng/天，此时对应肿瘤发生风险为十万分之一。阿加曲班每日最大用药60mg计算，则其NDMA限度设定为：96ng/60mg＝1.6ppm。
NDEA在大鼠体内的TD50为0.0265mg/kg/d，按照上述方法计算，每天的最大摄入量为0.0265mg/kg/天×50kg/50000＝0.0000265mg/天＝26.5ng/天，限度设定为26.5ng/60mg＝0.45ppm。
采用外标法计算，所述N-亚硝基二甲胺的含量不得超过1.6ppm；N-亚硝基二乙胺的含量不得超过0.45ppm。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明提供的阿加曲班原料药或制剂中基因毒性杂质N-亚硝基二甲胺、N-亚硝基二乙胺的分析方法，属于本领域首次开发的方法。
(2)亚硝胺类杂质致癌风险高，根据ICH M7(R1)，应使用来自研究设计完善的致癌性试验中的最低TD50值，或与人类风险评估最相关的种属、性别和肿瘤发生器官部位的最低TD50值来计算可接受摄入量，设定对应肿瘤发生风险为十万分之一，人体体重统一按50kg计算，则该亚硝胺类杂质的每日可接受摄入量(Acceptable Intake，AI)为：TD50(mg/kg/天)×50kg/50000；阿加曲班日服用最大剂量为60mg，计算得出N-亚硝基二甲胺、N-亚硝基二乙胺的限度值分别为1.6ppm、0.45ppm。本发明提供的液质联用法，样品处理过程操作简单，灵敏度高(N-亚硝基二甲胺、N-亚硝基二乙胺的检测限分别为0.081ppm、0.022ppm)，检测结果准确(回收率达到85％以上)，稳定性好，可检测到阿加曲班原料药或制剂中含有的微量N-亚硝基二甲胺、N-亚硝基二乙胺，因此本发明提供的方法完全满足了中国药典有关分析方法验证的指导原则的要求，可用于阿加曲班原料药或制剂中N-亚硝基二甲胺处、N-亚硝基二乙胺杂质的质量控制。
附图说明：
图1：实施例2中N-亚硝基二甲胺专属性色谱图
图2：实施例2中N-亚硝基二乙胺专属性色谱图
图3：实施例2中空白溶液在N-亚硝基二甲胺处、N-亚硝基二乙胺处的专属性色谱图
图4：实施例2中空白辅料在N-亚硝基二甲胺处、N-亚硝基二乙胺处的专属性色谱图
图5：实施例10中N-亚硝基二甲胺、N-亚硝基二乙胺检测限色谱图
图6：实施例10中N-亚硝基二甲胺、N-亚硝基二乙胺定量限色谱图
图7：对比例2使用ESI电离源色谱图
图8：对比例2使用大气压化学电离源色谱图
图9：对比例3色谱柱为①的色谱图
图10：对比例3色谱柱为②的色谱图
图11：对比例4流动相B为乙腈时色谱图
具体实施方式
本发明公开了一种阿加曲班原料药或制剂中N-亚硝基二甲胺、N-亚硝基二乙胺的分析方法，本领域技术人员可以借鉴本发明的内容，结合药物分析的相关原理，适当改进工艺参数来实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明范围内。
为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本申请中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
N-亚硝基二甲胺、N-亚硝基二乙胺对照品溶液的配制:
精密称取N-亚硝基二甲胺约18mg置100ml量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，作为N-亚硝基二甲胺对照品贮备液；精密称取N-亚硝基二乙胺约15mg置100ml量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，作为N-亚硝基二乙胺对照品贮备液。
分别精密量取N-亚硝基二甲胺对照品贮备液3ml和N-亚硝基二乙胺对照品贮备液1ml置同一100ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀；再精密量取3ml置100ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，作为N-亚硝基二甲胺、N-亚硝基二乙胺混合对照品贮备液(简称：混合对照品贮备液)，其中NDMA浓度为160ng/ml，NDEA浓度为45ng/ml。
N-亚硝基二甲胺、N-亚硝基二乙胺混合对照品溶液1的配置：精密量取混合对照品贮备液5ml置50ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，作为混合对照品溶液1，其中NDMA浓度为16ng/ml，NDEA浓度为4.5ng/ml。
N-亚硝基二甲胺、N-亚硝基二乙胺混合对照品溶液2的配置：精密量取混合对照品贮备液5ml置100ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，作为混合对照品溶液2，其中NDMA浓度为8ng/ml，NDEA浓度为2.25ng/ml。
阿加曲班对照品溶液的配制：精密称阿加曲班标准品约100mg置10ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得到浓度为10mg/ml的溶液，为阿加曲班对照品标准溶液。
供试品(阿加曲班原料药)溶液1的制备：精密称阿加曲班原料药1约100mg置10ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得到浓度为10mg/ml的供试品溶液1。
供试品(阿加曲班注射液)溶液2的制备：取阿加曲班注射液(10mg/2ml),直接进样。
阿加曲班注射液的处方为：2ml注射液中含有阿加曲班原料药1 10mg、乙醇300mg、甘油900mg、其余为注射用水。
实施例1：系统适用性
(1)色谱条件：
检测仪器：Waters XEVO TQ-S超高效液相质谱仪
超高效液相色谱条件：
色谱柱：苯基色谱柱：ACE 5phenyl 4.6×100mm，5μm(粒径)；
流速：0.8ml/min；柱温：30℃；进样体积：10μl；
流动相A：精密量取甲酸0.5g溶于500ml超纯水中，超声脱气；
流动相B：甲醇，超声脱气；
梯度洗脱表：
| 时间(min) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0 | 90 | 10 |
| 6 | 10 | 90 |
| 12 | 10 | 90 |
| 12.1 | 90 | 10 |
| 15 | 90 | 10 |
质谱条件如下：
质谱仪：三重四级杆质谱仪；质谱方法模式：多反应检测扫描(MRM)；大气压化学电离源(APCI)；正离子谱(ES+)；
离子源参考参数：电晕针电流：2.0μA
Probe Temperature：450℃
Source Temperature：150℃
(2)试验方法：
取N-亚硝基二甲胺、N-亚硝基二乙胺混合对照品溶液1、N-亚硝基二甲胺、N-亚硝基二乙胺混合对照品溶液2连续进样6针，记录N-亚硝基二甲胺、N-亚硝基二乙胺的峰面积。
(3)试验结果：
结果如表1、表2所示。
N-亚硝基二甲胺、N-亚硝基二乙胺混合对照品溶液1连续进样6针RSD分别为5.3％、2.3％(标准规定：6针峰面积的RSD≤10.0％)；N-亚硝基二甲胺、N-亚硝基二乙胺混合对照品溶液2连续进样6针RSD分别为3.2％、1.3％(标准规定：6针峰面积的RSD≤10.0％)；表明本色谱系统进样精密度良好，系统适用性符合要求。
表1：实施例1对照品溶液1系统适用性试验结果
| N-亚硝基二甲胺峰面积 | N-亚硝基二乙胺峰面积 | |
| 第1针 | 2115.2 | 6096.9 |
| 第2针 | 2190.4 | 5993.0 |
| 第3针 | 2033.2 | 6110.4 |
| 第4针 | 1893.6 | 5796.8 |
| 第5针 | 2028.9 | 5847.6 |
| 第6针 | 2162.4 | 6078.2 |
| 平均值 | 2070.6 | 5987.2 |
| RSD(％) | 5.3 | 2.3 |
表2：实施例1对照品溶液2系统适用性试验结果
| N-亚硝基二甲胺峰面积 | N-亚硝基二乙胺峰面积 | |
| 第1针 | 1011.7 | 2974.2 |
| 第2针 | 1060.6 | 2966.2 |
| 第3针 | 1087.0 | 2914.1 |
| 第4针 | 1033.2 | 3007.1 |
| 第5针 | 1026.1 | 2967.0 |
| 第6针 | 1091.7 | 2916.1 |
| 平均值 | 1051.7 | 2957.5 |
| RSD(％) | 3.2 | 1.3 |
实施例2：专属性
(1)试验方法：
色谱条件同实施例1，分别取为N-亚硝基二甲胺对照品贮备液、N-亚硝基二乙胺对照品贮备液适量，分别用甲醇稀释，得到N-亚硝基二甲胺专属性溶液、N-亚硝基二乙胺专属性溶液。
分别进样空白溶液(甲醇)、空白辅料(乙醇、甘油的混合溶液)、N-亚硝基二甲胺专属性溶液、N-亚硝基二乙胺专属性溶液、阿加曲班对照品溶液。
其中阿加曲班对照品溶液的检测方法为高效液相色谱法，色谱柱、流速、柱温、进样体积、流动相A、流动相B、梯度洗脱方法同前；检测波长226nm。
(2)试验结果：
如表3所示，空白溶液、阿加曲班、空白辅料对N-亚硝基二甲胺、N-亚硝基二乙胺的测定无干扰。见附图1-4。
表3：实施例2专属性试验结果
实施例3：方法精密度1
(1)试验方法：
色谱条件同实施例1，同一批阿加曲班原料药1，平行制备6份供试品溶液1，平行制备6份含N-亚硝基二甲胺、N-亚硝基二乙胺为规定限度的100％+供试品溶液1(6份“样+标”溶液)，测定杂质N-亚硝基二甲胺、N-亚硝基二乙胺的含量。
(2)试验结果：
如表4所示，6份“样+标”溶液中N-亚硝基二甲胺、N-亚硝基二乙胺的含量为1.59ppm、0.46ppm，RSD分别为2.4％、2.4％(标准规定：RSD≤10.0％)，说明本方法测定阿加曲班原料药中的N-亚硝基二甲胺、N-亚硝基二乙胺含量方法精密度符合要求。
表4：实施例3方法精密度1试验结果
实施例4：中间精密度1
(1)试验方法：
色谱条件同实施例1，两位化验员，在不同日期用两根相同型号的色谱柱分别测定同批次阿加曲班原料药1样品，平行制备6份含N-亚硝基二甲胺、N-亚硝基二乙胺为规定限度的100％对照品+供试品溶液1，考察两人测得N-亚硝基二甲胺、N-亚硝基二乙胺含量及相对平均偏差。
(2)试验结果：
如表5所示，两位化验员测得的N-亚硝基二甲胺、N-亚硝基二乙胺平均回收率的RD分别为0.3％、3.4％(标准规定：RD≤10.0％)，中间精密度1符合要求。
表5：实施例4中间精密度1试验结果对比
实施例5：方法精密度2
(1)试验方法：
色谱条件同实施例1，同一批阿加曲班注射液，作为供试品溶液2，平行制备6份含N-亚硝基二甲胺、N-亚硝基二乙胺为规定限度的100％+供试品溶液2(6份“样+标”溶液)，测定杂质N-亚硝基二甲胺、N-亚硝基二乙胺的含量。
(2)试验结果：
如表6所示，6份“样+标”溶液中N-亚硝基二甲胺、N-亚硝基二乙胺的含量为1.60ppm、0.44ppm，RSD分别为2.2％、3.7％(标准规定：RSD≤10.0％)，说明本方法测定阿加曲班注射液中的N-亚硝基二甲胺、N-亚硝基二乙胺含量方法精密度符合要求。
表6：实施例5方法精密度2试验结果
实施例6：中间精密度2
(1)试验方法：
色谱条件同实施例1，两位化验员，在不同日期用两根相同型号的色谱柱分别测定同批次阿加曲班注射液样品，平行制备6份含N-亚硝基二甲胺、N-亚硝基二乙胺为规定限度的100％对照品+供试品溶液2，考察两人测得N-亚硝基二甲胺、N-亚硝基二乙胺含量及相对平均偏差。
(2)试验结果：
如表7所示，两位化验员测得的N-亚硝基二甲胺、N-亚硝基二乙胺平均回收率的RD分别为0.0％、1.1％(标准规定：RD≤10.0％)，中间精密度2符合要求。
表7：实施例4中间精密度1试验结果对比
实施例7：线性
(1)试验方法：
色谱条件同实施例1，取N-亚硝基二甲胺、N-亚硝基二乙胺混合对照品溶液1，分别配制至少5个不同水平浓度的系列溶液；取上述溶液分别注入液相色谱仪，记录色谱图。绘制不同水平浓度各杂质峰面积与其浓度的函数曲线，并计算截距及相关系数r。
(2)试验结果：
如表8、表9所示。
N-亚硝基二甲胺浓度为1.62ng/ml～32.39ng/ml时呈线性关系，其线性方程为y＝138.14x-56.98，相关系数r为0.9985(标准规定：相关系数r≥0.99)；|截距|为56.98，(标准规定：|截距|小于100％浓度响应值的20％(412.0))，线性符合要求。
N-亚硝基二乙胺浓度为0.45ng/ml～8.91ng/ml时呈线性关系，其线性方程为y＝1380.10x-33.19，相关系数r为0.9994(标准规定：相关系数r≥0.99)；|截距|为33.19(标准规定：|截距|小于100％浓度响应值的20％(1169.3))，线性符合要求。
表8：实施例7中N-亚硝基二甲胺线性试验结果表
表9：实施例7中N-亚硝基二乙胺线性试验结果表
实施例8：准确度1
(1)试验方法
色谱条件同实施例1，取N-亚硝基二甲胺、N-亚硝基二乙胺混合对照品贮备液(NDMA浓度为160ng/ml，NDEA浓度为45ng/ml)及阿加曲班原料药1，按照限度浓度分别配制50％、100％、150％三个浓度水平的对照品+供试品溶液。每个浓度平行制备3份。取上述溶液注入液相色谱仪，记录色谱图，计算杂质取N-亚硝基二甲胺、N-亚硝基二乙胺的回收率。
(2)试验结果：
如表10、表11所示。
N-亚硝基二甲胺平均回收率为100.2％(标准规定：平均回收率在80.0％-120.0％之间)，RSD值为3.8％(标准规定：RD≤10.0％)；N-亚硝基二乙胺平均回收率为99.5％(标准规定：平均回收率在80.0％-120.0％之间)，RSD值为2.7％(标准规定：RD≤10.0％)，回收率达到要求，均符合规定。
表10：实施例8中N-亚硝基二甲胺准确度实验结果
表11：实施例8中N-亚硝基二乙胺准确度实验结果
实施例9：准确度2
(1)试验方法
色谱条件同实施例1，取N-亚硝基二甲胺、N-亚硝基二乙胺混合对照品贮备液(NDMA浓度为160ng/ml，NDEA浓度为45ng/ml)及阿加曲班注射液，按照限度浓度分别配制50％、100％、150％三个浓度水平的对照品+供试品溶液。每个浓度平行制备3份。取上述溶液注入液相色谱仪，记录色谱图，计算杂质取N-亚硝基二甲胺、N-亚硝基二乙胺的回收率。
(2)试验结果：
如表12、表13所示。
N-亚硝基二甲胺平均回收率为98.1％(标准规定：平均回收率在80.0％-120.0％之间)，RSD值为4.8％(标准规定：RD≤10.0％)；N-亚硝基二乙胺平均回收率为100.5％(标准规定：平均回收率在80.0％-120.0％之间)，RSD值为2.0％(标准规定：RD≤10.0％)，回收率达到要求，均符合规定。
表12：实施例9中N-亚硝基二甲胺准确度实验结果
表13：实施例9中N-亚硝基二乙胺准确度实验结果
实施例10：检测限与定量限
(1)检测限试验方法：
色谱条件同实施例1，将N-亚硝基二甲胺、N-亚硝基二乙胺混合对照品溶液1稀释，进行测定，记录色谱图，测定N-亚硝基二甲胺、N-亚硝基二乙胺的S/N(信噪比)来确定；当S/N为3-10时的浓度为待测物质的最小检测浓度，此浓度/供试品溶液浓度得到检测限(LOD，ppm)；
(2)定量限试验方法：
色谱条件同实施例1，将N-亚硝基二甲胺、N-亚硝基二乙胺混合对照品溶液1稀释，进行测定，记录色谱图，测定N-亚硝基二甲胺、N-亚硝基二乙胺的S/N来确定；当S/N≥10时的浓度为待测物质的最小定量浓度，此浓度/供试品溶液浓度得到定量限(LOQ，ppm)；
定量限精密度：LOQ溶液连续进样6针，记录峰面积，计算峰面积的相对标准偏差。
(3)检测限试验结果：
检测限试验结果表14所示。检测限见附图5。
对于阿加曲班原料药来说，N-亚硝基二甲胺、N-亚硝基二乙胺的检测限分别为0.081ppm、0.022ppm。
对于阿加曲班注射液来说，N-亚硝基二甲胺、N-亚硝基二乙胺的检测限分别为0.162ppm、0.044ppm。
表14：实施例7检测限结果
(4)定量限试验结果：
定量限试验结果如下表15、表16所示。定量限见附图6。
对于阿加曲班原料药来说，N-亚硝基二甲胺、N-亚硝基二乙胺的定量限分别为0.16ppm、0.045ppm。
对于阿加曲班注射液来说，N-亚硝基二甲胺、N-亚硝基二乙胺的检测限分别为0.32ppm、0.090ppm。
N-亚硝基二甲胺、N-亚硝基二乙胺定量限精密度的RSD为7.7％、7.0％(标准规定：RSD≤10.0％)，定量限精密度符合要求。
表15：实施例7定量限结果
表16：实施例7定量限精密度结果
| N-亚硝基二甲胺峰面积 | N-亚硝基二乙胺峰面积 | |
| 第1针 | 244.4 | 682.0 |
| 第2针 | 204.5 | 637.2 |
| 第3针 | 216.5 | 721.0 |
| 第4针 | 216.9 | 646.9 |
| 第5针 | 235.4 | 610.8 |
| 第6针 | 202.1 | 601.9 |
| 平均值 | 220.0 | 650.0 |
| RSD(％) | 7.7 | 7.0 |
实施例11：溶液稳定性
(1)试验方法：
色谱条件同实施例1，N-亚硝基二甲胺、N-亚硝基二乙胺混合对照品溶液1、供试品溶液1、供试品溶液2在室温(10-30℃)密闭放置至少12小时后，按外标法计算N-亚硝基二甲胺、N-亚硝基二乙胺对照品回收率和供试品溶液中N-亚硝基二甲胺、N-亚硝基二乙胺的含量。
(2)试验结果：
溶液稳定性结果如表17、表18、表19所示。
N-亚硝基二甲胺、N-亚硝基二乙胺混合对照品溶液1在室温(10-30℃)密闭放置37.5小时回收率分别为105.5％，100.9％(标准规定：回收率为80.0％-120.0％，则溶液稳定)，说明对照品溶液稳定，符合验证要求。
供试品溶液1室温(10-30℃)密闭放置36小时，N-亚硝基二甲胺、N-亚硝基二乙胺放置前与放置后均为未检出，说明供试品溶液1稳定，符合验证要求(标准规定：放置后含量与放置前含量的比值在80.0％-120.0％之间，则溶液稳定)。
供试品溶液2室温(10-30℃)密闭放置21.5小时，N-亚硝基二甲胺、N-亚硝基二乙胺放置前与放置后均为未检出，说明供试品溶液2稳定，符合验证要求(标准规定：放置后含量与放置前含量的比值在80.0％-120.0％之间，则溶液稳定)。
表17：实施例11溶液稳定性试验-对照品溶液稳定性试验结果
表18：实施例11溶液稳定性试验-供试品溶液1稳定性试验结果
表19：实施例11溶液稳定性试验-供试品溶液2稳定性试验结果
实施例12：耐用性
(1)耐用性试验方法：
其他色谱条件同实施例1，改变柱温±5℃，N-亚硝基二甲胺、N-亚硝基二乙胺混合对照品溶液1连续进样6次，计算N-亚硝基二甲胺、N-亚硝基二乙胺峰面积的RSD。
(2)耐用性试验结果：
耐用性结果如表20、表21所示，柱温变化±5℃，N-亚硝基二甲胺峰面积的RSD分别为1.7％、2.0％(标准规定：RSD≤10.0％)；N-亚硝基二乙胺峰面积的RSD分别为1.0％、2.4％(标准规定：RSD≤10.0％)；系统适用性符合要求。
表20：实施例12耐用性-柱温25℃-系统适用性结果
| N-亚硝基二甲胺峰面积 | N-亚硝基二乙胺峰面积 | |
| 第1针 | 2161.2 | 6123.4 |
| 第2针 | 2107.1 | 6112.0 |
| 第3针 | 2101.5 | 6021.3 |
| 第4针 | 2199.3 | 6013.2 |
| 第5针 | 2133.5 | 5989.8 |
| 第6针 | 2140.0 | 6064.5 |
| 平均值 | 2140.4 | 6054.0 |
| RSD(％) | 1.7 | 1.0 |
表21：实施例12耐用性-柱温35℃-系统适用性结果
| N-亚硝基二甲胺峰面积 | N-亚硝基二乙胺峰面积 | |
| 第1针 | 2213.4 | 5905.6 |
| 第2针 | 2134.4 | 5820.8 |
| 第3针 | 2133.3 | 6162.2 |
| 第4针 | 2225.4 | 6126.3 |
| 第5针 | 2130.6 | 6096.0 |
| 第6针 | 2152.8 | 6140.2 |
| 平均值 | 2165.0 | 6041.9 |
| RSD(％) | 2.0 | 2.4 |
对比例1：使用液相色谱法检测
1、色谱条件：
使用超高效液相色谱法：色谱柱：苯基色谱柱ACE 5phenyl，4.6mm×100mm(直径×长度)；流速：0.8ml/min；柱温：30℃；流动相A：浓度为0.1％的甲酸水溶液；流动相B：甲醇；梯度洗脱条件如下：
| 时间(min) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0 | 90 | 10 |
| 6 | 10 | 90 |
| 12 | 10 | 90 |
| 12.1 | 90 | 10 |
| 15 | 90 | 10 |
2、试验方法：
取N-亚硝基二甲胺、N-亚硝基二乙胺混合对照品溶液1(NDMA浓度为16ng/ml，NDEA浓度为4.5ng/ml)注入液相色谱仪中，在色谱图中，未出现N-亚硝基二甲胺、N-亚硝基二乙胺的色谱峰(即未检出)。
4、结论：
单独使用高效液相色谱法检测限度范围内N-亚硝基二甲胺、N-亚硝基二乙胺，方法灵敏度低，不能用于N-亚硝基二甲胺、N-亚硝基二乙胺的检测。
对比例2：电离源的选择对检测结果的影响试验
1、色谱条件：
使用ESI电离源代替大气压化学电离源(APCI)，其他色谱条件同实施例1。
2、试验方法：
将N-亚硝基二甲胺、N-亚硝基二乙胺混合对照品溶液1注入色谱仪中，记录色谱图，并与实施例1中的色谱图进行对比，结果见表22、附图7-8。
表22：电离源的选择对检测结果的影响
3、结论：
电离源的选择对检测结果有影响，在其他条件下同的情况下，检测N-亚硝基二甲胺时，大气压化学(APCI)电离源的峰面积是ESI电离源峰面积的2.5倍；检测N-亚硝基二乙胺时，大气压化学(APCI)电离源的峰面积是ESI电离源峰面积的1.8倍，使用大气压化学(APCI)电离源的灵敏度更高。
对比例3：色谱柱的选择对检测结果的影响试验
1、色谱条件：
色谱柱如下所示，其他色谱条件如实施例1。
①色谱柱为Waters ACQUITY UPLC HSS T3(填料为十八烷基硅烷键合硅胶)
2.1×150mm(直径×长度)，1.8μm(粒径)。
②色谱柱为ACE Excel 3C18-AR(填料为十八烷基键合苯基)2.1×50mm(直径×长度)，3μm(粒径)。
2、试验方法：
取N-亚硝基二甲胺、N-亚硝基二乙胺混合对照品溶液1分别进样，记录色谱图。
3、结论：
色谱图分别为附图9、附图10。
由图9可知，当色谱柱为①时，N-亚硝基二乙胺的峰形较差。
由图10可知，当色谱柱为②时，N-亚硝基二甲胺、N-亚硝基二乙胺的出峰时间分别为0.33min、0.88min，峰形较差且有交叉，分离度不符合要求。
对比例4：流动相B对检测结果的影响试验2
1、色谱条件：
流动相B为乙腈，其他色谱条件同实施例1。
2、定量限试验：
取实施例10定量限浓度溶液进样，记录色谱图。
3、结论：
见附图11。
当流动相为乙腈时，基线波动大，信号干扰大，不能检测出N-亚硝基二甲胺。
对比例5：流速对检测结果的影响
1、色谱条件：
流速为0.3ml/min，其他色谱条件同实施例1。
2、试验方法：
按照实施例8的方法进行准确度1的试验。
3、试验结果:
N-亚硝基二甲胺、N-亚硝基二乙胺的准确度试验实验结果见表23、表24。
表23：对比例5中N-亚硝基二甲胺准确度实验结果
表24：对比例5中N-亚硝基二乙胺准确度实验结果
3、结论：
N-亚硝基二甲胺平均回收率为70.50％(标准规定：平均回收率在80.0％-120.0％之间)；N-亚硝基二乙胺平均回收率为66.44％，回收率达不到要求，不能用于N-亚硝基二甲胺、N-亚硝基二乙胺的检测。
实施例13：阿加曲班原料药2的检测结果
1、供试品溶液的制备：
供试品溶液2的制备：精密称阿加曲班原料药2约100mg置10ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得到浓度为10mg/ml的供试品溶液2。
2、试验方法：
色谱条件同实施例1，将供试品溶液2和混合对照品溶液1分别进样，按外标法计算供试品溶液2中N-亚硝基二甲胺、N-亚硝基二乙胺的含量。
3、检测结果：
检测结果如表25所示。
表25：阿加曲班原料药2的检测结果
Claims (8)
1.一种阿加曲班原料药或制剂中杂质N-亚硝基二甲胺、N-亚硝基二乙胺的分析方法，采用高效液相色谱与质谱联用，包括以下步骤：
步骤(1)配制供试品溶液和对照品溶液：以甲醇为溶剂，溶解待测样品，配制得到供试品溶液；以甲醇为溶剂，溶解N-亚硝基二甲胺、N-亚硝基二乙胺的标准品，配制得到对照品溶液；
步骤(2)取供试品溶液和对照品溶液分别进样，用高效液相色谱-质谱仪进行检测，记录色谱图；
其中，所述的-高效液相色谱条件为：色谱柱：苯基色谱柱ACE5phenyl，5μm，
4.6mm×100mm；流速：0.8±0.05ml/min；柱温：30±5℃；流动相A：浓度为0.1％的甲酸水溶液；流动相B：甲醇；梯度洗脱条件如下：
所述的质谱条件为：质谱仪：三重四级杆质谱仪Waters XEVO TQ-S；质谱方法模式：多反应检测扫描；大气压化学电离源；正离子谱；电晕针电流：2.0μA；气化温度：450℃；源温度：150℃；
。
2.如权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述的步骤(1)中，供试品溶液含有阿加曲班0.25-100mg/ml。
3.如权利要求2所述的分析方法，其特征在于，所述的步骤(1)中，供试品溶液含有阿加曲班0.5-50mg/ml。
4.如权利要求2所述的分析方法，其特征在于，所述的步骤(1)中，供试品溶液含有阿加曲班1-10mg/ml。
5.如权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述的步骤(1)中，对照品溶液分别含N-亚硝基二甲胺、N-亚硝基二乙胺1-50ng/ml。
6.如权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述的步骤(1)中，对照品溶液分别含N-亚硝基二甲胺、N-亚硝基二乙胺2-20ng/ml。
7.如权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述的步骤(1)中，所述的对照品溶液含N-亚硝基二甲胺8ng/ml、N-亚硝基二乙胺2.25ng/ml。
8.如权利要求1所述的分析方法，其特征在于，所述的步骤(1)中，所述的待测样品为阿加曲班注射液。
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