CN108845070A - 一种l-瓜氨酸的高效液相检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种L‑瓜氨酸的高效液相检测方法，色谱条件为：色谱柱采用氨基键合硅胶柱；以0.05mol/L磷酸二氢钾缓冲液与乙腈的混合溶液作为流动相，且磷酸盐缓冲液与乙腈的体积比为60∶30～40；检测波长为200～210nm；柱温：25～35℃；流动相流速：0.7～1.0mL/min。本发明方法可快速、准确地测定出L‑瓜氨酸的含量，能够减小误差，确保其质量可控，并且操作简单、检测成本低、检测时间短、检测效率高。

Description

一种L-瓜氨酸的高效液相检测方法
技术领域
本发明属于色谱柱技术领域，尤其涉及一种L-瓜氨酸的高效液相检测方法。
背景技术
L-瓜氨酸，是一种α氨基酸，是从鸟氨酸及胺基甲醯磷酸盐在尿素循环中生成，或是透过一氧化氮合酶(NOS)催化生成精氨酸的副产物。首先精氨酸会被氧化为N-羟基-精氨酸，然后再氧化成瓜氨酸并释出一氧化氮。L-瓜氨酸可以使人的血管获得松弛，可用于增强男性性功能，以及治疗性功能障碍，并能够维护健康的肺功能，提高脑力清晰度，有帮助脑神经细胞贮藏与调回讯息的功能。
L-瓜氨酸在生产过程中需要对其含量进行质量检测。现有技术中公开有显色法和氨基酸分析仪检测法两种，但显色法操作步骤复杂，需要衍生，同时限制条件较高；氨基酸分析仪走针时间长，并且样品处理时间长，试剂配制条件要求较高。
发明内容
针对现有技术中检测L-瓜氨酸存在的操作步骤复杂、前处理时间长的问题，本发明提供一种L-瓜氨酸的高效液相检测方法。
为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：
一种L-瓜氨酸的高效液相检测方法，色谱条件如下：
色谱柱：氨基键合硅胶柱；
流动相：0.05mol/L磷酸二氢钾缓冲液与乙腈的混合溶液；所述磷酸盐缓冲液与乙腈的体积比为60∶30～40；
检测波长：200～210nm；
柱温：25～35℃；
流动相流速：0.7～1.0mL/min。
本方法所提供的色谱条件能使样品色谱峰与杂质峰达到很好的分离效果，能够准确测定出待测样品中L-瓜氨酸的含量，可用于在生产L-瓜氨酸过程中进行含量检测。并且本发明所采用的高效液相色谱法在同样的时间内可以检测多个样品，当样品数量较多时，能显著提高检测的工作效率，节省了人工、时间和溶剂等成本。
优选地，所述流动相中所述磷酸二氢钾缓冲液与乙腈的体积比为60∶35，在该比例下可以获得更完善的峰形。
优选地，所述检测波长为205nm。
优选地，所述柱温为30℃。柱温范围接近室温，容易控制温度使其稳定，样品在该温度范围内分离良好。
优选地，上述L-瓜氨酸的高效液相检测方法包括如下步骤：
步骤a、配制L-瓜氨酸的对照品溶液；
步骤b、用所述色谱条件对所述对照品溶液进行高效液相色谱检测，根据所得峰面积绘制L-瓜氨酸对照品的标准曲线，得出L-瓜氨酸对照品的浓度-峰面积线性回归方程；
步骤c、提供待测样品，用所述色谱条件对所述待测样品进行检测，将得到的峰面积代入所述浓度-峰面积线性回归方程，计算所述待测样品中L-瓜氨酸的含量。
相对于现有技术而言，本发明采用高效液相色谱法的操作步骤中，样品的处理方法简单、操作便捷，能够提高工作效率。
具体地，上述步骤a中所述L-瓜氨酸对照品溶液至少为5份，其浓度范围为0.6～1.4mg/mL，溶剂的组成与流动相相同。在该浓度范围内的L-瓜氨酸溶液可以得到线性良好的标准曲线。以流动相为溶剂，可避免引入其他杂质对实验结果产生干扰。
上述步骤c中所述待测样品在检测前用与流动相组成相同的溶剂稀释，避免引入其他杂质对实验结果产生干扰。
优选地，所述待测样品为含有L-瓜氨酸的生物转化液，检测前用溶剂稀释100倍。
附图说明
下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：
图1是本发明实施例1的对照品溶液高效液相色谱图；
图2是本发明实施例1的待测品溶液高效液相色谱图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例1
本发明实施例提供了一种L-瓜氨酸的高效液相检测方法，采用的高效液相色谱仪为RIGOL L-3000，色谱柱为安捷伦氨基键合硅胶柱(5μm，4.6*250mm)，进样体积为20μl(定量环)。包括如下步骤：
1、按0.6mg/mL、0.8mg/mL、1.0mg/mL、1.2mg/mL、1.4mg/mL的浓度配制L-瓜氨酸对照品溶液；
2、用高效液相色谱法对所述对照品溶液进行检测，色谱条件为：
色谱柱：氨基键合硅胶柱；
流动相：0.05mol/L磷酸二氢钾缓冲液与乙腈的混合溶液；所述磷酸盐缓冲液与甲醇的体积比为60∶35；
检测波长：205nm；
柱温：30℃；
流动相流速：1.0mL/min。
取对照品溶液20μl注入高效液相色谱仪进行检测，对照品溶液浓度与峰面积的结果见表1。各色谱图的理论塔板数大于5000，且与杂峰分离度良好，其中浓度为1.00560mg/mL的对照品溶液的色谱图如图1所示。
表1
对照品实际浓度mg/mL 峰面积
0.60336 1026.793
0.80448 1353.589
1.00560 1671.528
1.20672 1989.808
1.40784 2281.365
根据对照品浓度和相应峰面积绘制L-瓜氨酸对照品的标准曲线，以浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，得出L-瓜氨酸对照品的浓度-峰面积线性回归方程：y＝1563.9x+91.935，R2＝0.9996；
3、提供待测样品(含有L-瓜氨酸的生物转化液)0.5mL，用流动相稀释至50mL，在与对照品溶液完全相同的检测条件下，对所述待测样品进行检测，色谱图如图2所示，得到峰面积为1667.466，将该峰面积代入上述浓度-峰面积线性回归方程，计算所述待测样品中L-瓜氨酸的含量为100.74mg/mL(外标法测得含量为100.31mg/mL)。
4、精密度考察
取浓度为101.20μg/mL的对照品溶液20μl注入高效液相色谱仪，在上述检测条件下进行检测，重复6针，所得峰面积分别为1667.798、1663.528、1663.339、1661.722、1658.417、1655.740，平均值为1661.7573，RSD为0.25％。说明本实施例提供的L-瓜氨酸的高效液相检测方法精密度良好。
5、稳定性考察
取一份L-瓜氨酸转化液，于配制后0h、4h、8h、12h分别取20μl注入高效液相色谱仪，在上述检测条件下进行检测，其峰面积分别为1652.799、1663.589、1686.414、1689.522，平均值为1673.081，RSD为1.06％。说明本实施例提供的L-瓜氨酸的高效液相检测方法稳定性良好。
6、回收率考察
精密称取300mg待测样品于500mL容量瓶中，用流动相溶解稀释定容，取出9份，每份50mL；分别称取L-瓜氨酸对照品10mg、20mg、30mg各3份，分别加入到上述9份样品溶液中，分别取20μl注入高效液相色谱仪，在上述检测条件下进行检测每份溶液中L-瓜氨酸对照品含量，计算回收率。结果见表2。
表2
回收率均大于98％，说明本实施例提供的L-瓜氨酸的高效液相检测方法回收率良好。
7、定量限
精密称取L-瓜氨酸对照品50.28mg于50mL容量瓶中，用流动相溶解稀释定容，取20μl注入高效液相色谱仪，在上述检测条件下进行检测，测得峰高为99.581，基线噪音为0.05；将该对照品溶液稀释至2000倍，取20μl注入高效液相色谱仪，在与对照品溶液完全相同的检测条件下进行检测，测得峰高为0.526。故该方法定量限为50.25/50/200＝0.005025mg/mL。说明本实施例提供的L-瓜氨酸的高效液相检测方法具有较低的检测限。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种L-瓜氨酸的高效液相检测方法，其特征在于，色谱条件如下：
色谱柱：氨基键合硅胶柱；
流动相：0.05mol/L磷酸二氢钾缓冲液与乙腈的混合溶液；所述磷酸盐缓冲液与乙腈的体积比为60∶30～40；
检测波长：200～210nm；
柱温：25～35℃；
流动相流速：0.7～1.0mL/min。
2.根据权利要求1所述的L-瓜氨酸的高效液相检测方法，其特征在于，所述流动相中所述磷酸二氢钾缓冲液与乙腈的体积比为60∶35。
3.根据权利要求1所述的L-瓜氨酸的高效液相检测方法，其特征在于，所述检测波长为205nm。
4.根据权利要求1所述的L-瓜氨酸的高效液相检测方法，其特征在于，所述柱温为30℃。
5.根据权利要求1～4任一项所述的L-瓜氨酸的高效液相检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤a、配制L-瓜氨酸的对照品溶液；
步骤b、用所述色谱条件对所述对照品溶液进行高效液相色谱检测，根据所得峰面积绘制L-瓜氨酸对照品的标准曲线，得出L-瓜氨酸对照品的浓度-峰面积线性回归方程；
步骤c、提供待测样品，用所述色谱条件对所述待测样品进行检测，将得到的峰面积代入所述浓度-峰面积线性回归方程，计算所述待测样品中L-瓜氨酸的含量。
6.根据权利要求5所述的L-瓜氨酸的高效液相检测方法，其特征在于，步骤a中所述L-瓜氨酸对照品溶液至少为5份，其浓度范围为0.6～1.4mg/mL，溶剂的组成与流动相相同。
7.根据权利要求5所述的L-瓜氨酸的高效液相检测方法，其特征在于，步骤c中所述待测样品在检测前用与流动相组成相同的溶剂稀释。
8.根据权利要求7所述的L-瓜氨酸的高效液相检测方法，其特征在于，步骤c中所述待测样品为含有L-瓜氨酸的生物转化液，检测前用溶剂稀释100倍。
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