CN104119422B - 一种磷酸化肽的吸附富集方法、添加剂及其应用 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了一种磷酸化肽的吸附富集方法。本申请的吸附富集方法包括：(1)将非特异吸附抑制剂和部分待检样品添加到上样缓冲液，采用富集过滤柱进行磷酸化吸附富集；(2)收集富集产物，计算20种氨基酸在非磷酸化肽中丰度，作第一丰度，计算非磷酸肽所在蛋白质中20种氨基酸的丰度，作第二丰度，第一丰度比第二丰度，选比值较高的至少一种氨基酸为添加剂；(3)采用加入添加剂的上样缓冲液，对待检样品进行磷酸化肽吸附富集。本申请，运用氨基酸与多肽的竞争吸附作用，减小非磷酸化肽的吸附，增加磷酸化多肽富集的吸附选择性，为提高磷酸化检测的准确性和稳定性奠定基础。
Description
技术领域
本申请涉及蛋白质和多肽富集纯化领域，特别是涉及磷酸化肽的吸附富集方法，用于磷酸化富集的添加剂，该添加剂的制备方法和应用。
背景技术
在生物体细胞中，蛋白质是主要的功能行使者，出于功能的需要，许多蛋白质在翻译中或翻译后会在氨基酸链上共价结合各种非肽类基团，形成翻译后修饰。蛋白质的磷酸化修饰是最重要的蛋白质翻译后修饰之一，可逆磷酸化控制着诸如细胞增殖、细胞分裂、细胞间信息传递和基因表达等细胞活动。但是，在蛋白质样品中，磷酸化蛋白质和磷酸化肽的含量非常低，存在各种非磷酸化肽和无机盐的干扰，使得磷酸化蛋白质和磷酸化肽的检测十分困难，因此，需要对样品进行磷酸化富集。
二氧化钛富集法作为目前使用最为广泛的金属氧化物富集磷酸肽的方法，在富集过程中对一些非磷酸化肽段存在一定的非特异性吸附作用。这些没有磷酸化的肽段与磷酸化肽段一同被富集，降低了磷酸肽富集的选择性。为了提高磷酸化肽富集选择性，需要在上样缓冲液中加入非特异抑制剂，以抑制非磷酸化的肽段被富集。目前，有多种非特异抑制剂被应用，如2,5-二羟基苯甲酸(2,5-DHB)、邻苯二甲酸(PA)、谷氨酸、天冬氨酸和乙醇酸。但是，现有的非特异抑制剂在磷酸化肽富集中的效果并不好，特别是在目前比较常用的二氧化钛富集方法中，现有的非特异抑制剂的富集选择性一般在60％-70％左右；也就是说，仍然有30％-40％或更多的非磷酸化肽段被富集，这严重影响了磷酸化肽检测的准确性和稳定性。
发明内容
本申请的目的是提供一种新思路的磷酸化肽的富集方法，以及能够增强磷酸化的特异性吸附的添加剂，和该添加剂的制备方法和应用。
为了实现上述目的，本申请采用了以下技术方案：
本申请公开了一种磷酸化肽的吸附富集方法，包括：
(1)将非特异吸附抑制剂添加到上样缓冲液中，同时，将部分待检样品溶于上样缓冲液中，采用富集过滤柱对磷酸化肽进行吸附富集；(2)收集富集后的样品，对其进行分析，计算20种氨基酸在非磷酸化肽中丰度，作为第一丰度，并计算非磷酸肽所在蛋白质中20种氨基酸的丰度作为第二丰度，计算所述第一丰度比第二丰度的比值，选择比值较高的至少一种氨基酸作为添加剂；(3)将步骤(2)所述的添加剂加入到上样缓冲液中，使用加入了添加剂的上样缓冲液，再采用另外一个富集过滤柱对待检样品进行磷酸化肽富集。
其中，肽段是由蛋白质酶解得到的，所以本申请中“非磷酸肽所在蛋白质”是指经过消化能得到此肽段的蛋白。需要说明的是，本申请的关键在于，在本申请的磷酸化肽的吸附富集方法中，通过一种特殊的方式制取添加剂，并将该添加剂应用于磷酸化肽的吸附富集；因此，采用富集过滤柱对磷酸化肽进行吸附富集的具体操作包括参数设置、溶液配制、洗脱等，都可以参考常规的方式根据不同的检测对象或过滤柱进行调整，在本申请中不做具体限定。
优选的，富集过滤柱为固相金属氧化物过滤柱；本申请中，金属氧化物过滤柱选自二氧化钛过滤柱、二氧化锆过滤柱和二氧化硅过滤柱中的至少一种；优选为二氧化钛过滤柱。
优选的，非特异吸附抑制剂选自谷氨酸、天冬氨酸和乙醇酸中的至少一种。可以理解，在较次的方案中还可以采用其它具有类似功能的化合物或组合物作为非特异吸附抑制剂，在本申请中不做具体限定。
本申请的另一面公开了一种磷酸化肽的金属氧化物富集法，包括：
(1)将非特异吸附抑制剂加入到上样缓冲液中，同时，将部分待检样品溶于上样缓冲液中，采用金属氧化物过滤柱对磷酸化肽进行富集；(2)收集富集后的样品，对其进行分析，计算20种氨基酸在非磷酸化肽中丰度，作为第一丰度，并计算非磷酸肽所在蛋白质中20种氨基酸的丰度作为第二丰度，计算所述第一丰度比第二丰度的比值，选择比值较高的至少一种氨基酸作为添加剂；(3)将步骤(2)所述的添加剂加入到上样缓冲液中，使用加入添加剂的上样缓冲液，采用另外一个金属氧化物过滤柱对待检样品进行磷酸化肽富集。
需要说明的是，本申请的关键在于，在本申请的磷酸化肽的金属氧化物富集法中，通过一种特殊的方式制取添加剂，并将该添加剂应用于磷酸化肽的吸附富集；因此，采用金属氧化物过滤柱对磷酸化肽进行富集的具体操作包括参数设置、溶液配制、洗脱等，都可以参考常规的方式根据不同的检测对象或过滤柱进行调整，在本申请中不做具体限定。
优选的，金属氧化物过滤柱选自二氧化钛过滤柱、二氧化锆过滤柱和二氧化硅过滤柱中的至少一种；优选为二氧化钛过滤柱。
本申请的再一面公开了一种磷酸化肽的二氧化钛富集法，包括：
(1)将非特异吸附抑制剂加入到上样缓冲液中，同时，将部分待检样品溶于上样缓冲液中，采用二氧化钛过滤柱对磷酸化肽进行富集；(2)收集富集后的样品，对其进行分析，计算20种氨基酸在非磷酸化肽中丰度，作为第一丰度，并计算非磷酸肽所在蛋白质中20种氨基酸的丰度作为第二丰度，计算所述第一丰度比第二丰度的比值，选择比值较高的至少一种氨基酸作为添加剂；(3)将步骤(2)所述的添加剂加入到上样缓冲液中，使用加入添加剂的上样缓冲液，再采用另外一个二氧化钛过滤柱对待检样品进行磷酸化肽富集。
需要说明的是，本申请的关键在于，在本申请的磷酸化肽的二氧化钛富集法中，通过一种特殊的方式制取添加剂，并将该添加剂应用于磷酸化肽的吸附富集；因此，采用二氧化钛过滤柱对磷酸化肽进行富集的具体操作包括参数设置、溶液配制、洗脱等，都可以参考常规的方式根据不同的检测对象进行调整，在本申请中不做具体限定。
本申请的再一面公开了一种用于金属氧化物富集法的添加剂的制备方法，包括以下步骤，
(1)将非特异吸附抑制剂添加到上样缓冲液中，同时，将部分待检样品溶于上样缓冲液中，采用金属氧化物过滤柱对磷酸化肽进行富集；(2)收集富集后的样品，对其进行分析，计算20种氨基酸在非磷酸化肽中丰度，作为第一丰度，并计算非磷酸肽所在蛋白质中20种氨基酸的丰度作为第二丰度；(3)计算所述第一丰度比第二丰度的比值，选择比值较高的至少一种氨基酸作为添加剂。
优选的，本申请的添加剂的制备方法中，金属氧化物富集法为二氧化钛富集法，金属氧化物过滤柱为二氧化钛过滤柱。
在本申请添加剂的制备方法的基础上，本申请还公开了一种由本申请的制备方法制备的添加剂。
在本申请的添加剂的基础上，本申请还公开了一种添加有本申请的添加剂的上样缓冲液。
本申请中，待检样品是指从动物、植物或其它生物样本中提取的蛋白质样品，通常呈冻干的固体或高浓度的液体。通常，进行磷酸化检测时，首先将该蛋白质样品溶于上样缓冲液中，然后采用金属氧化物富集法富集磷酸化肽，最后对富集处理后的样品进行磷酸化检测。
需要说明的是，本申请中所有的非特异吸附抑制剂都可以采用常规的磷酸化吸附中所使用的非特异吸附抑制剂，本申请不做具体限定；但是，考虑到抑制效果，本申请优选的方案中，非特异吸附抑制剂都选自谷氨酸、天冬氨酸和乙醇酸中的至少一种。
由于采用以上技术方案，本申请的有益效果在于：
本申请的磷酸化肽的吸附富集方法，灵活运用氨基酸与多肽的竞争吸附作用，在对磷酸化肽进行富集时，将非特异吸附的多肽中丰度较高的氨基酸作为添加剂加入到上样缓冲液中，由于竞争吸附，相对于肽段，分子量较小的氨基酸比较容易被吸附，从而减小了非磷酸化的肽段的吸附，增加了磷酸化肽富集方法的吸附选择性，为提高磷酸化检测的准确性和稳定性奠定了基础。
附图说明
图1：是本申请实施例中针对小鼠肝脏样品进行分析的氨基酸的丰度比值结果图；
图2：是本申请实施例中针对山羊细胞样品进行分析的氨基酸的丰度比值结果图；
图3：是本申请实施例中针对酵母细胞样品进行分析的氨基酸的丰度比值结果图；
图4：是本申请实施例中针对稻瘟病菌样品进行分析的氨基酸的丰度比值结果图；
图5：是本申请实施例中针对拟南芥样品进行分析的氨基酸的丰度比值结果图；
图6：是本申请实施例中分别采用本申请的富集方法和常规的富集方法对小鼠肝脏样品进行磷酸化多肽富集的选择性结果图；
图7：是本申请实施例中分别采用本申请的富集方法与常规的富集方法对人细胞样品进行磷酸化多肽富集的选择性结果图；
图8：是本申请实施例中分别采用本申请的富集方法与常规的富集方法对人细胞样品进行磷酸化多肽富集的选择性结果图。
具体实施方式
本申请针对现有的非特异吸附抑制剂在对待检样品进行磷酸化肽富集时，非特异吸附较多，即大量的非磷酸化多肽也被吸附，没有很好的起到抑制作用，使得磷酸化富集效果差的问题。根据氨基酸与多肽竞争吸附的构思，创造性的提出了一种新的磷酸化肽的吸附富集方法，该富集方法中针对不同的待检样品制备不同的氨基酸添加剂，利用氨基酸与非磷酸化多肽的竞争吸附作用，减小非磷酸化的多肽的吸附，从而提高了磷酸化肽的富集效果。
本申请的一种实现方式中，着重采用了二氧化钛富集法进行试验，结果显示，采用本申请的改进的二氧化钛富集方法对磷酸化肽的富集选择性高达90％以上，也就是说，富集的产品中非磷酸化多肽被富集的量仅不到10％。而常规的二氧化钛富集方法对磷酸化肽的富集选择性仅60％-70％。可见，氨基酸与非磷酸化肽段的竞争抑制作用是很明显的。基于相同的思路，本申请还对其它磷酸化肽的富集方法进行了试验，包括如抗体法、固相金属离子亲和色谱(Immobi2lized metal ion affinity chromatography,IMAC)、金属氧化物/氢氧化物亲和色谱(Metal oxide/hydroxideaffinity chromatography,MOAC)、离子交换等富集方法，结果显示，富集选择性均有不同程度的提高。
需要说明的是，本申请的富集方法，实际上适用于所有将磷酸化多肽吸附，然后洗脱获得富集后浓度较高的磷酸化肽的富集方法；二氧化钛富集方法只是目前使用比较普遍的一种富集方法而已；可以理解，在对磷酸化肽进行吸附的富集方法中，总会有没有磷酸化的多肽被吸附，因此，采用被富集的非磷酸化多肽中丰度较高的氨基酸为添加剂，利用氨基酸的竞争吸附来减小非磷酸化多肽被吸附的概率，从而提高磷酸化富集的选择性，这是完全可以实现的，并且也是经过本申请的试验验证的。可以理解，本申请的利用氨基酸与蛋白质或肽段的竞争吸附的基本思路不仅仅可以用于二氧化钛富集法、金属富集法，也完全可以用于其它的磷酸化肽的吸附富集方法中；同样的，本申请的基本构思也不仅仅可以用于磷酸化肽的富集中，还可以用于其它的蛋白质的吸附富集方法。
下面通过具体实施例和附图对本申请作进一步详细说明。以下实施例仅对本申请进行进一步说明，不应理解为对本申请的限制。
实施例
本例以小鼠肝脏样品为研究对象，采用二氧化钛富集法对样品进行磷酸化肽富集。具体富集方法包括：
首先，将常规使用的非特异吸附抑制剂乙醇酸加入到上样缓冲液中，同时，将部分提取自小鼠肝脏的待检样品溶于上样缓冲液中，采用二氧化钛富集法对磷酸化肽进行富集；收集富集的产物，对其进行分析，计算20种氨基酸在非磷酸化肽中丰度，作为第一丰度，并计算非磷酸肽所在蛋白质中20种氨基酸的丰度作为第二丰度，计算第一丰度比第二丰度的比值，选择比值较高的至少一种氨基酸作为添加剂；然后将获得的添加剂加入到上样缓冲液中，使用加入添加剂的上样缓冲液，采用相同的二氧化钛富集法重新对待检样品进行磷酸化肽富集。最后对富集的磷酸化肽进行分析，检测磷酸化富集的效果。
本例中，添加乙醇酸的上样缓冲液具体为：称量76.05mg乙醇酸，加入800ul乙腈、150ul去离子纯水和50ulTFA充分溶解即可。在分析获得作为添加剂的氨基酸后，采用50mg氨基酸添加剂替换原本的乙醇酸即可，其余富集操作步骤相同。小鼠肝脏的蛋白质样品按照磷酸化修饰要求提取，酶解除盐后分装100ug/管用于磷酸化富集。
本例中二氧化钛富集法具体包括以下步骤：
(1)柱子制作：用平头针取C8膜，转入20ul的GELoader Tips；称取20mg柱料，先加200ul乙腈，再加200ul Mlilli-Q水，用移液器吸打充分悬浮；再用移液器迅速吸取悬浮液转入GELoader Tips，注射器推动排出乙腈，20ul/个，即1mg/柱；
(2)柱料平衡：乙腈过柱2次，20ul/次；
(3)上样：用20ul上样缓冲液复溶100ug肽段，然后转入平衡好的柱子，注射器推动使样品流动至柱料后，自然流过柱子，收集排出的样品再过一次柱子，即共上样两次；
(4)洗柱：先用上样缓冲液过柱2次，再用wash buffer过柱1次，每次过柱的溶液用量10ul/次；
(5)洗脱：先用10ul elution buffer1过柱1次，收集洗脱夜；再用10ul elutionbuffer2过柱1次，收集洗脱夜，合并两次洗脱夜，冷冻抽干；
将洗脱获得的富集产物，在进行一次富集，即重复步骤3-5一次，以获得更好的富集效果。其中，wash buffer的配方为：取800ul乙腈、190ul去离子纯水和10ulTFA混匀即可；elution buffer1的配方为：取750ul去离子纯水和150ul NH3·H2O(25％)混匀即可；elution buffer2的配方为：取465ul去离子纯水、360ul乙腈和75ulNH3·H2O(25％)混匀即可。
本例中，采用Thermo公司的orbi类质谱仪对富集产物用液相梯度串联质谱采集数据，然后利用Thermo的Proteome Discoverer1.4软件处理数据，获得氨基酸的丰度。同样的，采用Thermo公司的orbi类质谱仪对富集产物用液相梯度串联质谱采集数据，然后利用Thermo的Proteome Discoverer1.4软件处理数据，得到磷酸化肽的富集选择性数据。
本例中，在对添加剂进行分析时，上样缓冲液中使用的是乙醇酸，这是一种目前比较常规非特异吸附抑制剂，可以理解，其它常用的非特异吸附抑制剂同样可以用于本例，它们包括但不限于：乙醇酸、谷氨酸、天冬氨酸等。
本例中Mlilli-Q水采用MILLIPORE的Mlilli-Q Advantage制备，NH3·H2O(25％)为分析纯级别，柱料为购自岛津的5um级别的Titansphere TiO，乙腈为HPLC级，TFA为MERCK出品专为蛋白质测序用试剂，乙醇酸纯度99％，20ul的GELoader Tips购自EPPENDORF，其它试剂均为分析纯试剂。
本例的分析结果，如图1所示，天冬酰胺和谷氨酰胺比例较高。因此，本例分别采用天冬酰胺和谷氨酰胺作为添加剂，对小鼠肝脏样品进行磷酸化肽富集，结果显示，磷酸化富集选择性分别高达90.7％和92.6％，部分结果如图6所示。
与此同时，本例还对不加入添加剂的上样缓冲液的富集效果进行了测试，也就是说，按照常规的二氧化钛富集方法，仅在上样缓冲液中添加乙醇酸，其它步骤均相同，结果显示，两次重复试验的磷酸化富集的选择性分别为65.1％和63％。可见，本例的富集方法对磷酸化富集的选择性有很大提高，有效的减小了没有磷酸化肽段的富集，从而减小非磷酸化肽段对磷酸化检测的影响，为提高磷酸化检测的准确性和稳定性打下了基础。
在以上试验分析的基础上，本例采用相同的分析方法，还分别以山羊细胞样品、酵母样品、稻瘟病菌样品、拟南芥样品、人细胞样品为研究对象进行了磷酸化富集研究。结果部分结果如图2-5所示，图2为山羊细胞样品分析出的添加剂的结果图，结果显示天冬酰胺和谷氨酰胺比值较高，可作为添加剂使用。图3为酵母样品分析出的添加剂的结果图，结果显示天冬酰胺和谷氨酰胺比值较高，可作为添加剂使用。图4为稻瘟病菌样品分析出的添加剂的结果图，结果显示天冬酰胺、甘氨酸和谷氨酰胺比值较高，可作为添加剂使用。图5为拟南芥样品分析出的添加剂的结果图，结果显示天冬酰胺、甘氨酸和谷氨酰胺比值较高，可作为添加剂使用。另外，对人细胞的分析结果显示，天冬酰胺和谷氨酰胺比值较高，可作为添加剂使用。
进一步的，将分析出的添加剂加入到上样缓冲液中，重新对样品进行磷酸化富集，结果显示，磷酸化的富集选择性均在90％以上，其中对人细胞富集的效果，如图7和图8所示。图7为以谷氨酰胺为添加剂的结果图，其中图示对比试验为没有添加添加剂，仅添加乙醇酸的富集结果；重复试验两次，仅添加乙醇酸的富集选择性分别为68.2％和77.4％；而添加了添加剂的富集选择性，两次试验分别为95.4％和93.5％。图8为以天冬酰胺为添加剂的结果图，其中图示对比试验为没有添加添加剂，仅添加乙醇酸的富集结果；重复试验两次，仅添加乙醇酸的富集选择性分别为69.6％和71.5％；而添加了添加剂的富集选择性，两次试验分别为96.4％和96.8％。
以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本申请的保护范围。
Claims (10)
1.一种磷酸化肽的吸附富集方法，包括：
(1)将非特异吸附抑制剂添加到上样缓冲液中，同时，将部分待检样品溶于上样缓冲液中，采用富集过滤柱对磷酸化肽进行吸附富集；
(2)收集富集后的样品，对其进行分析，计算20种氨基酸在非磷酸化肽中丰度，作为第一丰度，并计算非磷酸肽所在蛋白质中20种氨基酸的丰度作为第二丰度，计算所述第一丰度比第二丰度的比值，选择比值较高的至少一种氨基酸作为添加剂；
(3)将步骤(2)所述的添加剂加入到上样缓冲液中，使用加入了添加剂的上样缓冲液，再采用另外一个富集过滤柱对待检样品进行磷酸化肽富集。
2.根据权利要求1所述的吸附富集方法，其特征在于：所述富集过滤柱为固相金属氧化物过滤柱；所述金属氧化物过滤柱选自二氧化钛过滤柱、二氧化锆过滤柱中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的吸附富集方法，其特征在于：所述金属氧化物过滤柱为二氧化钛过滤柱。
4.根据权利要求1所述的吸附富集方法，其特征在于：所述非特异吸附抑制剂选自谷氨酸、天冬氨酸和乙醇酸中的至少一种。
5.一种磷酸化肽的金属氧化物富集法，包括：
(1)将非特异性吸附抑制剂加入到上样缓冲液中，同时，将部分待检样品溶于上样缓冲液中，采用金属氧化物过滤柱对磷酸化肽进行富集；
(2)收集富集后的样品，对其进行分析，计算20种氨基酸在非磷酸化肽中丰度，作为第一丰度，并计算非磷酸肽所在蛋白质中20种氨基酸的丰度作为第二丰度，计算所述第一丰度比第二丰度的比值，选择比值较高的至少一种氨基酸作为添加剂；
(3)将步骤(2)所述的添加剂加入到上样缓冲液中，使用加入添加剂的上样缓冲液，采用另外一个金属氧化物过滤柱对待检样品进行磷酸化肽富集。
6.根据权利要求5所述的金属氧化物富集法，其特征在于：所述金属氧化物过滤柱选自二氧化钛过滤柱、二氧化锆过滤柱中的至少一种。
7.根据权利要求5所述的金属氧化物富集法，其特征在于：所述金属氧化物过滤柱为二氧化钛过滤柱。
8.一种磷酸化肽的二氧化钛富集法，包括：
(1)将非特异性吸附抑制剂加入到上样缓冲液中，同时，将部分待检样品溶于上样缓冲液中，采用二氧化钛过滤柱对磷酸化肽进行富集；
(2)收集富集后的样品，对其进行分析，计算20种氨基酸在非磷酸化肽中丰度，作为第一丰度，并计算非磷酸肽所在蛋白质中20种氨基酸的丰度作为第二丰度，计算所述第一丰度比第二丰度的比值，选择比值较高的至少一种氨基酸作为添加剂；
(3)将步骤(2)所述的添加剂加入到上样缓冲液中，使用加入添加剂的上样缓冲液，再采用另外一个二氧化钛过滤柱对待检样品进行磷酸化肽富集。
9.一种用于金属氧化物富集法的添加剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤，
(1)将非特异性吸附抑制剂添加到上样缓冲液中，同时，将部分待检样品溶于上样缓冲液中，采用金属氧化物过滤柱对磷酸化肽进行富集；
(2)收集富集后的样品，对其进行分析，计算20种氨基酸在非磷酸化肽中丰度，作为第一丰度，并计算非磷酸肽所在蛋白质中20种氨基酸的丰度作为第二丰度；
(3)计算所述第一丰度比第二丰度的比值，选择比值较高的至少一种氨基酸作为添加剂。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于：所述金属氧化物富集法为二氧化钛富集法，所述金属氧化物过滤柱为二氧化钛过滤柱。
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| 食物来源的磷酸化肽/ 磷酸化蛋白质的富集方法研究;刘远锦等;《中国科技投资》;20131231;第55页第2.2节 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN104119422A (zh) | 2014-10-29 |
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