CN103214549B - 一种还原免疫球蛋白的方法及其试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种还原免疫球蛋白的方法，该方法能够经还原免疫球蛋白使其轻链和重链拆分开，且不影响该免疫球蛋白原有的糖基化和末端修饰情况，所述方法包括以下步骤：向一定量的免疫球蛋白中加入10-30μL的1-6M盐酸胍水溶液，混合均匀后加入1-4μL二硫苏糖醇(DTT)水溶液，使免疫球蛋发生变性、还原反应，其中，反应溶液中DTT终浓度为25-100mM，免疫球蛋白终浓度为0.2-3μg/μL。本发明还提供了一种能够有效拆分免疫球蛋白重链和轻链的试剂盒。

Description

一种还原免疫球蛋白的方法及其试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域。具体而言，本发明提供了一种还原免疫球蛋白的方法。

背景技术

近十年来，单克隆抗体在生物医药界、乃至整个医药行业里取得重大的成功和巨大的发展。与传统小分子药物相比，单克隆抗体具有特异性强，疗效显著，副作用小，用量少等优点。就药物分子特性而言，抗体具有更大的不均一性。抗体的这一特性是由多种因素引起的，翻译后修饰是其中最重要的内在因素。常见的抗体翻译后修饰包括糖基化，N端焦谷氨酸化，C端脱赖氨酸，脱酰胺，氧化，异构化等。在抗体药物研发的多个环节，如分子鉴定、工艺开发、质量监控等，均需要对翻译后修饰进行检测分析。

抗体IgG糖基化发生在重链Fc区的天冬酰胺，属N-糖基化，是抗体的重要结构组成。IgG糖链的核心单元由两个N-乙酰葡萄糖胺和三个甘露糖的双叉结构连接组成，根据末端半乳糖、核心岩藻糖、末端唾液酸等的差异，可以组成多种不同的糖链结构。IgG的糖基化是不均一的，表现为不同的糖型和含量。糖基化差异可以影响抗体的生物学活性和药代特征，如CDC、ADCC、体内清除半衰期等。

抗体IgG的N端氨基酸为谷氨酰胺时，容易发生环化反应而生成焦谷氨酸(pyroglutamicacid，pyroE)。此反应可以自发进行，也可以在酶催化条件下进行。在抗体IgG分子的C端，则容易发生脱赖氨酸(-K)。在大部分情况下，两者对抗体的生物活性没有影响，但亦有报道指某些抗体的N端焦谷氨酸化可能会影响其与抗原的结合力。此外，N端的谷氨酰胺焦谷氨酸化和C端脱赖氨酸均会影响抗体的电荷分布，而电荷特性是抗体质量监控的重要指标之一。

因此，建立快速检测抗体IgG糖基化和末端修饰的分析方法在抗体研发中具有重要意义。目前，本领域一般对糖基化和末端修饰单独进行检测。酶解荧光标记法是IgG1糖基化测定的经典定量方法，但样品处理过程相当复杂，耗时长，而且需要样品量大；也有使用质谱测定IgG酶解片段进行糖基化分析，如papain酶和IdeS酶等，但这些方法都存在一些不足，如酶切位点选择性不强，或成本过高，或样品处理复杂等，不适宜常规或工艺开发样品的批量检测。应用LC-MS进行肽图分析理论上可以同时检测抗体的糖基化和末端修饰，但含糖多肽的分离、测定和数据分析存在诸多技术难点，不适用于糖基化定量分析，而且样品处理过程复杂，耗时长，酶切过程也可能对抗体原有末端修饰产生影响。因此，目前仍未有适用于抗体研发的对IgG的糖基化和末端修饰同时进行快速测定的报道。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种还原免疫球蛋白(即抗体)的方法，该方法能够经还原免疫球蛋白使其轻链和重链拆分开，且不影响该免疫球蛋白原有的糖基化和末端修饰情况，该还原方法能够实现免疫球蛋白糖基化和末端修饰的准确测定。

本发明的另一个目的是提供一种试剂盒，该试剂盒用于免疫球蛋白的还原，能有效拆分免疫球蛋白的重链和轻链，且不影响该免疫球蛋白原有的糖基化和末端修饰情况，从而实现了免疫球蛋白的糖基化和末端修饰的准确测定。

本发明的另一个目的是提供一种测定免疫球蛋白的糖基化和末端修饰情况的方法，该方法能够同时、快速地对免疫球蛋白糖基化、N端焦谷氨酸化和C端脱赖氨酸进行测定。

本发明的技术方案如下：

一方面，为了实现糖基化和末端修饰的准确测定，本发明提供了一种用于测定糖基化和末端修饰的还原免疫球蛋白的方法，该方法能够经还原免疫球蛋白使其轻链和重链拆分开，且不影响该免疫球蛋白原有的糖基化和末端修饰情况，所述方法包括以下步骤；

向一定量的免疫球蛋白中加入10-30μL的1-6M盐酸胍水溶液，混合均匀后加入1-4μL二硫苏糖醇(DTT)水溶液，使免疫球蛋白发生变性、还原反应，其中，反应溶液中DTT终浓度为25-100mM，免疫球蛋白终浓度为0.2-3μg/μL。

具体地，所述免疫球蛋白发生变性、还原反应温度为50-65℃。

优选地，所述反应温度为65℃。

具体地，所述免疫球蛋白发生变性、还原反应时间为：45min-120min。

优选地，所述免疫球蛋白发生变性、还原反应时间为：45min。

具体地，所述免疫球蛋白为人免疫球蛋白。

优选地，所述免疫球蛋白为人免疫球蛋白IgG.

更优选地，所述免疫球蛋白为人免疫球蛋白IgG1和IgG2亚型。

具体地，所述方法在还原免疫球蛋白的试剂盒中的应用。

本发明还提供一种同时测定免疫球蛋白的糖基化和末端修饰情况的方法，所述方法包括以下步骤：

1)使免疫球蛋白经变性剂变性后，使用还原剂还原，从而拆分轻链和重链；

2)使用反相超高压液相色谱分离步骤1)中免疫球蛋白的轻链和重链；

3)使用质谱测定步骤2)中获得的轻链和重链的分子量；以及

4)分析步骤2)中的色谱数据和步骤3)中的质谱数据，从而测定所述免疫球蛋白的糖基化和末端修饰情况。

其中，所述免疫球蛋白优选为人免疫球蛋白，优选为人免疫球蛋白IgG，进一步优选为人免疫球蛋白IgG1和IgG2亚型。

并且，所述免疫球蛋白的糖基化和末端修饰情况优选包括免疫球蛋白的轻链N端焦谷氨酸化，以及重链的天冬酰胺糖基化和N端焦谷氨酸化、C端脱赖氨酸。

在本发明提供的测定方法中，所述步骤1)包括：

向一定量的免疫球蛋白中加入10-30μL的1-6M盐酸胍水溶液，混合均匀后加入1-4μL二硫苏糖醇(DTT)水溶液，使免疫球蛋白发生变性、还原反应，其中，反应溶液中DTT终浓度为25-100mM，免疫球蛋白终浓度为0.2-3μg/μL。

优选地，所述免疫球蛋白发生变性、还原反应温度为50-65℃。

更优选地，所述反应温度为65℃。

优选地，所述免疫球蛋白发生变性、还原反应时间为：45min-120min。

更优选地，所述免疫球蛋白发生变性、还原反应时间为：45min。

具体地，所述步骤2)具体包括：

采用反向超高压液相色谱分离步骤1)中免疫球蛋白的轻链和重链，以实现所述轻链和重链的基线分离，据本发明的具体实施方案，采用的液相系统可以为UPLC(Waters，ACQUITY)。色谱柱：Waters，ACQUITY UPLC column，BEH C4，1.7μm(粒径)，(孔径)，2.1×50mm。

流动相洗脱条件对轻链和重链的分离影响较大，优选地，色谱条件设定为：

色谱柱温度设定为55-65℃，进样量0.2-3μg；

流动相X为0.1％甲酸水，流动相Y为0.1％甲酸乙腈，流速为0.4mL/min；

梯度洗脱条件为：

具体地，所述步骤3)具体包括：

采用电喷雾电离质谱测定步骤2)中获得的轻链和重链的分子量，其中在0-5min，流路通往废液，5-16min，流路通往质谱，然后采用正离子模式采集质谱数据；

优选地，质谱条件设定为：

锥孔气流为50.0L/Hr，脱溶剂气体为500-800.0L/Hr，脱溶剂温度为350-500℃，扫描范围为400-2500Da，扫描时间为0.5-2s。采样锥孔电压对质谱信号影响较大，设定为20-40V，优选地，设定为20-30V。

具体地，所述步骤4)具体包括：

由步骤2)中获得的色谱峰面积计算得到所述免疫球蛋白的轻链的N端焦谷氨酸化比例，由步骤3)中获得的质谱数据通过去卷积化计算，得到所述免疫球蛋白的重链的糖型相对含量以及N端焦谷氨酸和C端脱赖氨酸比例。

具体地，所述方法在还原免疫球蛋白的试剂盒中的应用。

抗体的二硫键在DTT的作用下发生断裂，生成两条一样的轻链和两条一样的重链。使用C4反相-超高压液相色谱分离轻重链混合物，含或不含N端焦谷氨酸的轻链与重链(含不同糖型和末端修饰)能实现基线分离，然后采用ESI-MS在线测定其分子量。由于含不同糖型或末端修饰的重链有不同的分子量，而且各种重链的比例与其分子量峰的强度成正比，因此糖型相对含量和重链N端焦谷氨酸化、C端脱赖氨酸比例均可以由重链质谱数据计算获得。此外，轻链N端焦谷氨酸化比例由色谱峰面积计算获得。

目前本领域已有一些技术来测定蛋白质的分子量或其修饰情况，但与本发明的方法相比，都存在缺陷或不足之处。例如质谱仪(MS)，如MALDI-MS，常用于测定抗体完整蛋白水平的分子量。质谱方法虽然对样品兼容性好，操作方便，但测得分子量结果分辨率较低；作为抗体IgG糖基化的经典定量方法——酶解荧光标记法采用N糖酐酶PNGaseF酶切IgG获得糖链，经纯化后再进行荧光标记、高效液相色谱或毛细管电泳分析；该方法选择性强，准确度高，但样品处理过程复杂，耗时长(通常需要2天)，而且需要样品量较大(一般至少为100μg)；也有使用ESI-MS测定IgG酶解片段进行糖基化分析，但papain酶切位点的选择性低，会增加副产物而影响数据分析；免疫球蛋白G降解酶S(IdeS)选择性很强，但IdeS的成本高，不适宜常规或工艺开发样品的批量检测；应用LC-MS进行胰酶肽图分析理论上可以同时检测抗体的糖基化和末端修饰，但含糖多肽的分离、测定和数据分析存在诸多技术难点，而且其检测灵敏度低，不适于低含量糖基的检测，此外样品处理过程复杂，耗时长，酶切过程可能对抗体原有末端修饰产生影响。

相比之下，本方法采用ESI-MS测定抗体多电荷离子，然后进行去卷积化计算，大大提高了分辨率和检测结果的准确度(＜30ppm)。此外，本发明样品处理简单，只需还原剂进行反应(45min)，样品用量少(5μg)，而且样品的UPLC-MS检测只需在16min内完成，便可同时得到抗体糖基化、N端焦谷氨酸化和C端脱赖氨酸的数据。本发明尤其适用于样品量少的实验，如克隆筛选，以及工艺开发过程的批量快速检测；同时，本发明也适用于常规用量(100μg)的样品检测。采用本发明的方法，可以检测不同抗体如IgG1、IgG2的糖基化和末端修饰，而且该方法可用于抗体工艺开发过程中样品的检测。此外，结合羧肽酶B和阳离子交换色谱(CEX-HPLC)，应用本方法还可以对抗体电荷异构体的结构进行表征和鉴定。

免疫球蛋白可以分为IgG、IgA、IgM、IgD、IgE五类，其中IgG可分为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4等亚型，目前市场上销售的单克隆抗体药物70％-80％属于IgG1类蛋白。根据抗体IgG1中人源氨基酸序列的组成，又可划分为嵌合型抗体IgG1、人源化抗体IgG1等多种蛋白。本发明提供了一种免疫球蛋白的还原方法及试剂盒，尤其提供了一种免疫球蛋白IgG1、IgG2的还原方法及试剂盒，实验证明，采用该方法还原免疫球蛋白，可以使其轻链和重链正确拆分开，且不影响该免疫球蛋白原有的糖基化和末端修饰情况，从而实现了免疫球蛋白的糖基化和末端修饰的准确测定。

并且，本发明还提供了一种同时、快速地对免疫球蛋白的糖基化、N端焦谷氨酸化和C端脱赖氨酸进行测定的方法，尤其提供了一种免疫球蛋白IgG1、IgG2的的糖基化、N端焦谷氨酸化和C端脱赖氨酸进行测定的方法。具体而言，本发明通过对经还原的人免疫球蛋白(即抗体)进行超高压液相色谱-质谱联用分析，可以同时、快速地对少量的免疫球蛋白(特别是人免疫球蛋白)糖基化、N端焦谷氨酸环化和C端脱赖氨酸进行测定。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1A-1D显示了实施例1中不同DTT用量对抗体A轻重链分离情况的比较结果。

图2A-2C显示了实施例1中不同DTT还原反应温度和时间对抗体A轻重链分离和末端修饰情况的影响。

图3A-3D分别显示了实施例2中洗脱梯度1、2、3、4对轻重链色谱分离情况的影响比较。

图4A-4D显示了实施例2中不同锥孔电压(20V，25V，30V，40V)对重链去卷积化分子量质谱峰强度的影响。

图5A显示了实施例3中抗体A经还原后测定的色谱图；图5B1至图5B3分别显示了抗体A经还原后测定的轻链，焦谷氨酸化轻链和重链质谱图。图5C显示了实施例3中抗体B经还原后测定的色谱图；图5D1至图5D2分别显示了抗体B经还原后测定的轻链和重链质谱图。pyroE为N端焦谷氨酸，-K为C端脱赖氨酸，-H₂O为脱水。

图6显示了实施例4中抗体C(IgG2)经还原后测定的色谱图。pyroE为N端焦谷氨酸，-K为C端脱赖氨酸，-H₂O为脱水。

具体实施方式

以下参照具体的实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。

下述实施例中的抗体A为嵌合型抗体IgG1，(具体制备方法如中国专利：CN 101177453B说明书10-13页实施例1-6所示，其中说明书13页实施例6筛选出的C2-11-12嵌合抗体即为本发明的抗体A)；抗体B为人源化抗体IgG1，(由珠海丽珠单抗生物技术有限公司生产，具体制备方法如中国专利：CN102675460A说明书12-18页实施例1-7所示，其中说明书17-18页实施例7筛选出的AT-132抗体即为本发明的抗体B)；抗体C为全人源抗体IgG2，由AmgenCanada Inc.生产。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的药材原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。

实施例1免疫球蛋白还原方法的条件筛选

1.1考察还原剂DTT的用量

考察了4个不同用量的DTT对轻、重链分离的影响。取5μg抗体A蛋白4份，分别加入到10μL 6M盐酸胍溶液中，再分别加入0.1M DTT溶液2μL和5μl，以及0.5M DTT溶液2μl和4μl，最后加适量6M盐酸胍溶液使DTT终浓度分别为10mM，25mM，50mM和100mM，使其与所述IgG1蛋白在65℃下反应45min。

采用C4反向超高压液相色谱分离反应所得的轻链和重链，使用的液相系统为UPLC(Waters，ACQUITY)。色谱柱：Waters，ACQUITY UPLC column，BEH C4，1.7μm(粒径)，(孔径)，2.1×50mm。色谱条件设定为：色谱柱温度设定为60℃，进样量1μg；流动相X为0.1％甲酸水，流动相Y为0.1％甲酸乙腈，流速为0.4mL/min；梯度洗脱条件为：

采用电喷雾电离质谱测定经色谱分离获得的轻链和重链的分子量，其中在0-5min，流路通往废液，5-16min，流路通往质谱，然后采用正离子模式采集质谱数据；质谱条件设定为：锥孔气流为50.0L/Hr，脱溶剂气体为800.0L/Hr，脱溶剂温度为500℃，扫描范围为400-2500Da，扫描时间为1s，采样锥孔电压设定为25V。

结果如图1A-1D所示，DTT终浓度为10mM时，抗体A轻重链未能完全拆分；当DTT浓度为25M时，轻重链大部分情况下可以拆分完全，但有极个别样品色谱分离不理想；当DTT浓度为50-100mM时，所有抗体样品轻重链完全拆分。为保证抗体轻重链拆分和色谱分离，确定使用25-100mM DTT作为0.2-3μG/μl抗体蛋白的合适还原剂用量，50mM为优选用量。

1.2考察还原反应的温度和时间

取5μG抗体A若干份分别加入到10μL 6M盐酸胍溶液中，再加入0.5M DTT溶液2μL，最后加适量6M盐酸胍溶液使DTT终浓度为50mM，考察了37℃、50℃、65℃这三个反应温度以及20min到120min的反应时间对抗体IgG1轻、重链分离和末端修饰结果的影响。色谱和质谱条件与实施例1.1一致。

实验数据使用Waters公司的BiopharmaLynx1.3软件进行处理。选择“Intact Protein”模式进行去卷积化(Deconvolution)处理，方法参数如下：Lock Mass(Da)：556.2771；TICThreshold：300-500；Deconvolution m/z Range：轻链为850-2000，重链为950-1500；ProteinMW Range：轻链为20000-30000Da，重链为42000-60000Da。抗体IgG各糖型的比例根据重链质谱图中各糖型分子量峰的强度进行归一化计算得到。含N端焦谷氨酸的轻链与不含焦谷氨酸的轻链可实现基线分离，因此对色谱峰面积进行积分，可计算出轻链N端焦谷氨酸化的比例。重链N端焦谷氨酸化和C端脱赖氨酸是通过对G0F重链的分子量分析获得的。

具体结果如图2和表1所示。其中，由图2A-1至图2A-3可见，当还原温度为37℃时，抗体轻重链未完全分开，说明该温度下还原反应不彻底。由图2B-1至图2B-3以及图2C-1至图2C-3可见，当还原温度升高为50℃及65℃(反应时间≥45min)时，抗体轻重链分离情况比较理想，说明DTT还原在50℃以上的高温下反应比较彻底。此外，从下表1中可以看出，在相同的还原温度下，随着反应时间的延长，样品轻重链末端的修饰比例均呈上升趋势；同样，在相同的反应时间里，随着反应温度的升高，样品轻重链末端修饰比例也均逐渐增加。并且，考虑到高温条件下可能促进N端焦谷氨酸化和C端脱赖氨酸反应，须考察样品制备过程对末端修饰的影响。如表1所示，当45min≤反应时间≤120min，末端修饰数据的变化幅度均不大，因此，所用样品制备条件对抗体末端修饰的影响较小。

表1不同DTT还原温度和时间条件下抗体IgG1末端修饰情况比较

综上，确定还原反应条件为：在50-65℃下反应，反应时间为：45min≤反应时间≤120min。

1.3方法精密度和重现性

在优化后的实验条件下(取5μg抗体A若干份分别加入到10μL 6M盐酸胍溶液中，再加入0.5M DTT溶液2μL，最后加适量6M盐酸胍溶液使DTT终浓度为50mM，65℃反应45min)，评价本方法测定抗体A的糖基化、N端焦谷氨酸环化和C端脱赖氨酸的精密度和重现性。色谱和质谱条件与实施例1.1一致。数据处理方法与实施例1.2一致。

连续测定五次，结果如表2所示。IgG1各糖型比例、N端焦谷氨酸环化和C端脱赖氨酸修饰比例的测定结果RSD％均小于0.5％，糖型含量测定结果的RSD％小于7％。

测定五个平行处理的样品，结果如表3所示。N端焦谷氨酸环化和C端脱赖氨酸修饰比例的测定结果RSD％均小于1％，糖型含量测定结果的RSD％小于6％。

表2方法精密度测定

表3方法重现性测定

综上，该方法的精密度和重现性良好。

实施例2：UPLC-MS方法的色谱和质谱条件优化

2.1流动相优化

基于反相超高压液相色谱，考察了流动相洗脱梯度对轻重链色谱分离的影响。样品使用5μg抗体A加入到10μL 6M盐酸胍溶液中，再加入0.5M DTT溶液2μL，最后加适量6M盐酸胍溶液使DTT终浓度为50mM，65℃反应45min。反应产品采用不同流动相梯度进行分离，其他色谱条件和质谱条件与实施例1.1一致。流动相X为0.1％甲酸水，流动相Y为0.1％甲酸乙腈，流速为0.4mL/min，考察了四种洗脱梯度，具体如下：

梯度1：0-5min，10％Y；5-5.1min，10％-18％Y；5.1-15min，18％-28％Y；15-15.1min，28％-90％Y；15.1-19.0min，90％Y；19.0-19.1min，90％-10％Y，19.1-22.0min，10％Y。

梯度2：0-5min，10％Y；5-5.1min，10％-25％Y；5.1-8min，25％-27％Y；8-18min，27％-30％Y；18-18.1min，30％-90％Y；18.1-21.0min，90％Y；21.0-21.1min，90％-10％Y，21.1-24.0min，10％Y。

梯度3：0-5min，10％Y；5-5.1min，10％-25％Y；5.1-8min，25％-26％Y；8-18min，26％-28％Y；18-18.1min，28％-90％Y；18.1-21.0min，90％Y；21.0-21.1min，90％-10％Y，21.1-24.0min，10％Y。

梯度4：0-5min，10％Y；5-5.1min，10％-25％Y；5.1-6min，25％-26％Y；6-10min，26％-27％Y；10-15min，27％-32％Y；15-15.1min，32％-90％Y；15.1-18.0min，90％Y；18.0-18.1min，90％-10％Y，18.1-21.0min，10％Y。

轻链和重链的色谱分离结果如图3所示。综上，实现轻重链基线分离的最佳流动相洗脱梯度为梯度4：0-5min，10％Y；5-5.1min，10％-25％Y；5.1-6min，25％-26％Y；6-10min，26％-27％Y；10-15min，27％-32％Y；15-15.1min，32％-90％Y；15.1-18.0min，90％Y；18.0-18.1min，90％-10％Y，18.1-21.0min，10％Y。

2.2质谱条件优化

基于优化后的流动相洗脱梯度(0-5min，10％Y；5-5.1min，10％-25％Y；5.1-6min，25％-26％Y；6-10min，26％-27％Y；10-15min，27％-32％Y；15-15.1min，32％-90％Y；15.1-18.0min，90％Y；18.0-18.1min，90％-10％Y，18.1-21.0min，10％Y)，考察了质谱参数对基线分离后的轻链和重链质谱信号的影响。锥孔气流，脱溶剂气体和脱溶剂温度等对质谱信号影响不大，基本采用仪器供应商建议参数。本发明方法对采样锥孔电压进行了优化。样品使用5μg抗体A加入到10μL 6M盐酸胍溶液中，再加入0.5M DTT溶液2μL，最后加适量6M盐酸胍溶液使DTT终浓度为50mM，65℃反应45min。反应产品采用实施例1.1中的色谱条件进行分离，质谱采样锥孔电压分别设定为20V，25V，30V和40V，其他质谱条件与实施例1.1一致。如图4A-1至图4A-4所示，随着电压的升高，轻重链的总离子流(峰面积)都有所增加；而如图4B-1至图4B-4所示，重链的去卷积化分子量质谱信号在20-25V之间时有较明显增加，在25-30V之间没有明显差别，在40V时则有显著降低。综上，确定该方法的质谱采样锥孔电压为25-30V。

实施例3采用本发明的UPLC-MS方法测定抗体A和抗体B(IgG1)的糖基化和末端修饰情况

采用优化后的还原条件(5μg抗体A加入到10μL6M盐酸胍溶液中，再加入0.5M DTT溶液2μL，最后加适量6M盐酸胍溶液使DTT终浓度为50mM，65℃反应45min)，UPLC分离(与实施例1.1一致)，ESI-MS检测(与实施例1.1一致)和归一化数据处理(与实施例1.2一致)分析抗体A和抗体B的糖基化和末端修饰。抗体A轻链和重链的N端首个氨基酸均为谷氨酰胺(Gln)，易发生焦谷氨酸环化；抗体B轻链N端首个氨基酸为谷氨酸(Glu)，不易发生焦谷氨酸环化，而重链为易发生环化的谷氨酰胺。图5A为抗体A经过还原后采用本发明的UPLC-MS方法测得的色谱图，图5B为该抗体测得的质谱图，其中图5B-1是图5A中保留时间为8.19min色谱峰即无修饰的轻链(LC)的去卷积化质谱图，分子量为23056Da。图5B-2是图5A中保留时间为9.67min色谱峰即N端焦谷氨酸化的轻链的去卷积化质谱图，分子量为23039Da。图5B-3是图5A中保留时间为11.27min色谱峰即重链(HC)的去卷积化质谱图，图5B-3中不同质量数的质谱峰分别代表含不同糖型和末端修饰的IgG1分子量，其测定分子量和理论分子量如表4所示。该方法测得抗体A的轻重链分子量与其理论值非常一致，准确度高；而且能区分质量差为17Da的质谱峰，如50542Da(G0F，焦谷氨酸，脱赖氨酸)和50559Da(G0F，脱赖氨酸)，表明分辨率高。图5C为抗体B经过还原后采用本发明的UPLC-MS方法测得的色谱图，图5D为该抗体测得的质谱图，其中图5D-1是图5C中保留时间为11.57min色谱峰即轻链(LC)的去卷积化质谱图，无焦谷氨酸化分子量为23056Da。图5D-2是图5C中保留时间为13.26min色谱峰即重链(HC)的去卷积化质谱图，图5D-2中不同质量数的质谱峰分别代表含不同糖型和末端修饰的IgG1分子量。与抗体A一样，抗体B轻重链分子量的测定值与理论值十分一致。通过归一化计算，抗体B重链N端焦谷氨酸化和C端脱赖氨酸分别为70.6％和97.8％；G0F，G1F，G2F和G0的含量分别为65.7％，26.5％，4.6％和3.2％。

表4抗体A含不同糖型和末端修饰的重链分子量理论值和测定值

糖基化和末端修饰	理论分子量(Da)	实测分子量(Da)
			G0F，焦谷氨酸，脱赖氨酸	50542	50542
G0F，焦谷氨酸，脱赖氨酸，脱水	50524	50523
			G0F，脱赖氨酸	50559	50559
G0F，焦谷氨酸	50670	50670
			G1F，焦谷氨酸，脱赖氨酸	50704	50704
Man5，焦谷氨酸，脱赖氨酸	50314	50315
			G0F-GN，焦谷氨酸，脱赖氨酸	50338	50339
G0，焦谷氨酸，脱赖氨酸	50395	50395

实施例4采用本发明的UPLC-MS方法测定抗体C(IgG2)的糖基化和末端修饰情况

采用本发明中优化后的还原条件(5μg抗体A加入到10μL 6M盐酸胍溶液中，再加入0.5MDTT溶液2μL，最后加适量6M盐酸胍溶液使DTT终浓度为50mM，65℃反应45min)，经UPLC分离(与实施例1.1一致)，ESI-MS检测(与实施例1.1一致)和归一化数据处理(与实施例1.2一致)分析抗体C的糖基化和末端修饰。图6为抗体C经过还原后采用本发明的UPLC-MS方法测得的色谱图，轻链(LC)的保留时间为6.6min，重链(HC)的保留时间为13.7min。抗体C轻链和重链的N端首个氨基酸均为谷氨酸(Glu)，不易环化形成焦谷氨酸，因此未检测到焦谷氨酸化的轻链或重链；重链大部分发生了C端脱赖氨酸。抗体C的糖型主要包括G0F，G1F，Man5，G0和G2F，对应的含脱赖氨酸重链的分子量为50206Da，50367Da，49978Da，50059Da和50531Da，与理论值一致；其含量分别为58.0％，19.5％，13.7％，6.6％，2.2％。因此，本发明方法同样适用于免疫球蛋白IgG2糖基化和末端修饰的检测。

实施例5试剂盒还原免疫球蛋白的方法。

试剂盒由试剂A和试剂B构成，其中试剂A为6M盐酸胍溶液；试剂B为0.5M DTT溶液。

使用试剂盒还原抗体A的方法具体如下：

取20μg抗体A(蛋白浓度应大于1μg/μL，若小于1μg/μL，可用截留分子量为10kDa的超滤离心管进行浓缩)，加入一定量试剂A至溶液总体积为36μL，再加入4μL试剂B，在65℃下反应45min。反应产品采用UPLC分离(与实施例1.1一致)，ESI-MS检测(与实施例1.1一致)，连续5天进行重复实验(重新配置样品和测定)。

结果显示，抗体A的轻链和重链得到有效拆分，并在色谱上实现基线分离。

抗体A的重链和轻链经试剂盒有效拆分后，还可测定抗体的末端修饰情况(测定方法与实施例1.1、1.2一致)，具体结果如表5所示，连续测定5天，轻链N端焦谷氨酸化，重链N端焦谷氨酸化和C端脱赖氨酸测定值的相对标准偏差RSD％小于2％；糖链G0F，G1F和G0相对含量测定值的相对标准偏差RSD％小于5％，Man5和G0F-GN小于10％。

表5应用本方法测定抗体A末端修饰情况的重现性

综上，本试剂盒可实现标准化操作，且重现性良好，可用于还原免疫球蛋白以及检测其末端修饰情况。

以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。

Claims (9)

1.一种还原免疫球蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：

向一定量的免疫球蛋白中加入10-30μL的6M盐酸胍水溶液，混合均匀后加入1-4μL二硫苏糖醇(DTT)水溶液,使免疫球蛋白发生变性、还原反应，其中，反应溶液中DTT终浓度为25-100mM，免疫球蛋白终浓度为0.2-3μg/μL；

其中，所述免疫球蛋白发生变性、还原反应温度为50-65℃。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述反应溶液中DTT终浓度为50mM。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述免疫球蛋白发生变性、还原反应温度为65℃。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述免疫球蛋白发生变性、还原反应时间为：45min-120min。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述免疫球蛋白发生变性、还原反应时间为：45min。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述免疫球蛋白为人免疫球蛋白。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述免疫球蛋白为人免疫球蛋白IgG.

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述免疫球蛋白为人免疫球蛋白IgG1和IgG2亚型。

9.根据权利要求1-8任一项所述的方法，其特征在于，所述方法在还原免疫球蛋白的试剂盒中的应用。