CN109142515B - 一种用于检测痕量磷酸蛋白的石英晶体微天平传感器及其应用 - Google Patents

一种用于检测痕量磷酸蛋白的石英晶体微天平传感器及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种快速检测痕量磷酸蛋白的石英晶体微天平传感器的制备方法及应用，本方法基于二氧化钛和磷酸蛋白的特异性结合的原理，ɑ‑酪蛋白的线性范围为1ug·mL‑1‑200ug·mL‑1，最低检出限为5.31ng·mL‑1(S/N＝3)。本方法与传统的质谱检测技术相比较，为痕量磷酸化蛋白的检测提供了一种新的快速、便捷、灵敏的检测方法。克服了原有的检测方法中富集磷酸蛋白材料的合成过程繁琐，费时，检测时间长、仪器昂贵且操作复杂、灵敏度低等技术问题。本发明方法简单，成本低廉，具有良好的选择性、重复性和抗干扰能力，并成功应用于实际样品中磷酸蛋白的检测。

Description

一种用于检测痕量磷酸蛋白的石英晶体微天平传感器及其 应用
技术领域
本发明属于分子检测技术领域，具体涉及一种用于检测痕量磷酸蛋白的石英晶体微天平传感器。
背景技术
蛋白质的磷酸化是一种可逆性的翻译后修饰，它在细胞的生命活动中起到十分重要的作用，包括信号转导，细胞的增殖、分化、发育、凋亡，神经活动，肌肉收缩和肿瘤生长等过程。一个异常的磷酸化可能是如癌症、糖尿病、慢性炎症或神经退行性疾病标志的潜在因素之一。特别是一些低丰度的磷酸化蛋白质和磷酸化肽表现出的高灵敏度和特异性是表征生物体特殊生理状态的一个重要的因素。
石英晶体微天平传感器是一种简单的，便宜的，具有高质量感应分辨率的免标记技术，由于它对负载在其表面的质量变化(甚至纳克级别)具有极好的灵敏性，因而被分析应用技术所广泛采纳。它是以二氧化钛和磷酸蛋白的特异性反应为基础，可以用来进行特异性定量检测目标蛋白，二氧化钛作为磷酸蛋白分子的识别性原件和压电传感性元件直接接触，然后通过传感性元件把待测的物质的浓度信号转变成响应的频率电信号。其能特异性识别目标蛋白，增加了检测结果的准确性。
发明内容
本发明依托在石英金电极表面以自组装的方式构建的一种氨基化纳米二氧化钛修饰的新型石英晶体微天平传感器，用于灵敏且特异性地在线富集检测磷酸蛋白。首先巯基十一烷酸通过金硫键固定在石英晶体金片表面将其进行羧基化，然后通过巯基十一烷酸的羧基将氨基功能化的纳米二氧化钛实现有效固定，氨基功能化的纳米二氧化钛材料用于特异性吸附磷酸蛋白的同时利用纳米二氧化钛材料的大比表面积从而增加检测方法的灵敏度、稳定性及扩大检测范围。通过改变ɑ-酪蛋白的浓度，产生不同的频率信号，从而达到对目标蛋白的定量检测。
原理：在固定了氨基化纳米二氧化钛浓度及滴加量，碳酸氢铵缓冲溶液的PH、α-酪蛋白浓度以及滴加量，改变目标蛋白的浓度，二氧化钛对目标蛋白的特异性吸附量不同，从而产生的压电频率信号不同，实现对目标蛋白的定量检测。随着目标物浓度的增大，与氨基化纳米二氧化钛结合的磷酸蛋白的量会相应增大，直到电极表面二氧化钛的位点达到饱和，从而产生的压电频率信号会达到稳定。
这种石英晶体微天平传感器的制备方法和具体步骤为：
(1)将氨基化纳米二氧化钛粉末分散于去离子水中，超声分散形成1mg·mL-1的均一溶液；
(2)将巯基十一烷酸粉末分散于无水乙醇中，超声分散形成2mg·mL-1的均一溶液。
(3)自组装：在三角瓶中加入1-2.5mL的步骤(2)所制备的巯基十一烷酸溶液，将电极浸泡到该溶液中，避光，过夜自组装，将自组装完毕的石英晶体金电极分别用乙醇和超纯水清洗三次，以除去金电极表面未结合的巯基十一烷酸，储备于无水乙醇中，使用前用N2吹干；
(4)活化：向自组装好的电极表面滴加10μLEDC/NHS混合溶液，避光，反应2h，反应完毕后，用超纯水清洗电极表面三次，氮气吹干，备用；
(5)NH2-TiO2的连接：在步骤(4)得到的电极表面滴加2.5-15uL氨基化纳米二氧化钛的水溶液，在N2环境下反应干燥15-25min；然后依次用水、无水乙醇淋洗，N2吹干；
(6)封闭：在步骤(3)得到的电极表面滴加10uL配置好的1％的BSA溶液封闭未结合上氨基化纳米二氧化钛的羧基位点，用时1h，之后依次用碳酸氢铵缓冲液、超纯水清洗，清洗两次，氮气吹干，放置于4℃备用。
优选的，所述氨基化纳米二氧化钛粒径为5nm。
优选的，步骤(4)的EDC/NHS混合溶液是0.4mol·L-1的EDC和0.1mol·L-1的NHS按照体积比1:1配置而成。
所述用于检测痕量磷酸蛋白的石英晶体微天平传感器在检测痕量磷酸蛋白上的应用。
一种用于检测痕量磷酸蛋白的石英晶体微天平传感器的应用，包括如下步骤：
(1)将由巯基十一烷酸和二氧化钛修饰的纳米薄膜石英晶体微天平传感器，置于石英晶体微天平检测系统的检测室中；同时通过信号采集系统的电脑记录由检测室中的石英晶体微天平晶振传感的、由频率计采集的频率相应数据；
(2)向步骤(1)中的石英晶体微天平传感器的电极上滴加1mg/mLα-酪蛋白溶液5-15uL，将其在N2环境下干燥20-30min，然后依次用pH＝8.0碳酸氢铵缓冲溶液、无水乙醇淋洗，N2吹干；同时通过信号采集系统的电脑记录由检测室中的石英晶体微天平晶振传感的、由频率计采集的频率相应数据；
(3)比较步骤(2)和步骤(1)的石英晶体微天平晶体在滴加α-酪蛋白溶液前后的振动频率变化值表明磷酸蛋白的存在。
优选的步骤(2)中滴加α-酪蛋白溶液的PH值为6.5。
这种石英晶体微天平传感器用于检测痕量磷酸蛋白的具体方法是：
(1)压电频率测定
本发明对制备的NH2-TiO2/AuE修饰电极对分析物的响应情况进行了详细考察。待NH2-TiO2/AuE修饰电极响应频率达到稳定以后记录频率值(f0，Hz)。然后，滴加α-酪蛋白溶液，让其在N2环境下干燥，大约用时20-30min。然后依次用碳酸氢铵缓冲溶液(pH＝8.0)、无水乙醇淋洗，N2吹干。待响应频率再次达到稳定时，记录下该频率(fi，Hz)，并通过公式Δf＝f1-f0，对响应频率的改变量(Δf，Hz)进行计算，平行三次。该过程中响应频率的变化与NH2-TiO2/AuE电极表面吸附磷酸蛋白后所引起的质量变化紧密相关。每次分析结束后，使用15％NH3·H2O溶液超声洗脱电极，直到该传感器的频率恢复到最初值。
(2)ɑ-酪蛋白吸附量的测定
根据氨基化纳米二氧化钛对ɑ-酪蛋白的特异性吸附作用，通过改变目标物的浓度，得到不同的吸附量，从而产生的压电频率信号不同，实现对ɑ-酪蛋白的定量检测。随着α-酪蛋白浓度的增加，更多的二氧化钛位点被结合，修饰电极表面的负载增加而导致相应的频率响应降低。对于NH2-TiO2/AuE压电传感器，当α-酪蛋白浓度在1μg·mL-1-200μg·mL-1的范围内时，α-酪蛋白与传感器产生的频率变化值之间成线性关系，线性方程为-Δf(Hz)＝1457.5Cα+46.658(R2＝0.99912)，最低检出限为5.31×10-9g·mL-1(S/N＝3)。
本发明优点是：
(1)本发明依托在石英金电极表面以自组装的方式构建的一种氨基化纳米二氧化钛修饰的新型石英晶体微天平传感器，用于灵敏且特异性地在线富集检测磷酸蛋白。首先巯基十一烷酸通过金硫键固定在石英晶体金片表面将其进行羧基化，然后通过巯基十一烷酸的羧基将氨基功能化的纳米二氧化钛实现有效固定，氨基功能化的纳米二氧化钛材料用于特异性吸附磷酸蛋白的同时利用纳米二氧化钛材料的大比表面积从而增加检测方法的灵敏度、稳定性及扩大检测范围。
(2)本发明重点突破了磷酸蛋白检测时存在的样品前处理过程繁琐、仪器昂贵，操作复杂、测试成本高等弊端，为实际应用过程中复杂样品中的磷酸蛋白的检测提供了一种新颖、快速且具有高灵敏度和准确性的分析检测手段，首次将压电传感用于磷酸蛋白的检测。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明进一步说明，但不限定本发明的保护范围。
本发明通过在修饰有巯基十一烷酸的石英晶体金电极表面滴涂氨基化纳米二氧化钛薄膜制备了一种用于检测痕量磷酸蛋白的压电传感器。
实施例1：
一种用于检测痕量磷酸蛋白的压电传感器的制备方法，制备方法的步骤是：
(1)将氨基化纳米二氧化钛粉末分散于去离子水中，超声分散形成1mg/mL的均一溶液；
(2)将巯基十一烷酸粉末分散于无水乙醇中，超声分散形成2mg·mL-1的均一溶液。
(3)自组装：在三角瓶中加入2mL的步骤(2)所制备的巯基十一烷酸溶液，将电极浸泡到该溶液中，避光，过夜自组装，将自组装完毕的石英晶体金电极分别用乙醇和超纯水清洗三次，以除去金电极表面未结合的巯基十一烷酸，储备于无水乙醇中，使用前用N2吹干；
(4)活化
向自组装好的电极表面滴加10μLEDC/NHS混合溶液(0.4mol·L-1的EDC和0.1mol·L-1的NHS，v/v＝1/1)，避光，反应2h。反应完毕后，用超纯水清洗电极表面三次，氮气吹干，备用。该活化过程使得电极表面的羧基被酯基取代。
(5)NH2-TiO2的连接
在上述得到的电极表面滴加7.5uL氨基化纳米二氧化钛的水溶液，在N2环境下反应干燥，大约需要20min；然后依次用水、无水乙醇淋洗，N2吹干。
(6)封闭
为了减少非特异性吸附，实验中使用10mg·mL-1BSA来封闭电极上未结合NH2-TiO2的羧基位点。在上述得到的电极表面滴加10uL配置好的1％的BSA溶液封闭未结合上氨基化纳米二氧化钛的羧基位点，用时1h。之后依次用碳酸氢铵缓冲液、超纯水清洗两次，氮气吹干，放置于4℃备用。
石英晶体微天平传感器用于检测痕量磷酸蛋白的方法：
(1)将由巯基十一烷酸和二氧化钛修饰的纳米薄膜石英晶体微天平传感器，置于石英晶体微天平检测系统的检测室中；同时通过信号采集系统的电脑记录由检测室中的石英晶体微天平晶振传感的、由频率计采集的频率相应数据；
(2)向步骤(1)中的石英晶体微天平传感器的电极上滴加1mg/mLα-酪蛋白溶液5-15uL，将其在N2环境下干燥20-30min，然后依次用pH＝8.0碳酸氢铵缓冲溶液、无水乙醇淋洗，N2吹干；同时通过信号采集系统的电脑记录由检测室中的石英晶体微天平晶振传感的、由频率计采集的频率相应数据；
(3)比较步骤(2)和步骤(1)的石英晶体微天平晶体在滴加α-酪蛋白溶液前后的振动频率变化值表明磷酸蛋白的存在。
本发明对制备的NH2-TiO2/AuE修饰电极对分析物的响应情况进行了详细考察。待NH2-TiO2/AuE修饰电极响应频率达到稳定以后记录频率值(f0，Hz)。然后，滴加α-酪蛋白溶液，让其在N2环境下干燥，大约用时20min。然后依次用碳酸氢铵缓冲溶液(pH＝8.0)、无水乙醇淋洗，N2吹干。待响应频率再次达到稳定时，记录下该频率(fi，Hz)，并通过公式Δf＝f1-f0，对响应频率的改变量(Δf，Hz)进行计算，平行三次。该过程中响应频率的变化与NH2-TiO2/AuE电极表面吸附磷酸蛋白后所引起的质量变化紧密相关。每次分析结束后，使用15％NH3·H2O溶液超声洗脱电极，直到该传感器的频率恢复到最初值。
ɑ-酪蛋白吸附量的测定
根据氨基化纳米二氧化钛对ɑ-酪蛋白的特异性吸附作用，通过改变目标物的浓度，得到不同的吸附量，从而产生的压电频率信号不同，实现对ɑ-酪蛋白的定量检测。
实施例2：
上述用于检测痕量磷酸蛋白的压电传感器对实际样品中磷酸蛋白的测试：
分别用实施例1得到的传感器对实际样品(脂脂牛奶、鼠血液、鼠肝脏)中的磷酸蛋白进行了分析测定，采用MALDI-TOF质谱法进行验证实验。每种样品平行测定三次，读取频率响应值并计算平均值分别为：脱脂牛奶：1301.2Hz，鼠血液：751.7Hz，鼠肝脏：297.6Hz；然后带入公式Δf＝2.26×10-6Δmf0 2/A，计算出相应的磷酸蛋白的质量分别为：8.932×10-1μg，5.160×10-1μg，2.043×10-1μg。
实施例3：
一种用于检测痕量磷酸蛋白的压电传感器的制备方法，制备方法的步骤是：
(1)将氨基化纳米二氧化钛粉末分散于去离子水中，超声分散形成1mg/mL的均一溶液；
(2)将巯基十一烷酸粉末分散于无水乙醇中，超声分散形成2mg·mL-1的均一溶液。
(3)自组装：在三角瓶中加入1mL的步骤(2)所制备的巯基十一烷酸溶液，将电极浸泡到该溶液中，避光，过夜自组装，将自组装完毕的石英晶体金电极分别用乙醇和超纯水清洗三次，以除去金电极表面未结合的巯基十一烷酸，储备于无水乙醇中，使用前用N2吹干；(4)活化
向自组装好的电极表面滴加10μLEDC/NHS混合溶液(0.4mol·L-1的EDC和0.1mol·L-1的NHS，v/v＝1/1)，避光，反应2h。反应完毕后，用超纯水清洗电极表面三次，氮气吹干，备用。该活化过程使得电极表面的羧基被酯基取代。
(5)NH2-TiO2的连接：在步骤(4)得到的电极表面滴加2.5uL氨基化纳米二氧化钛的水溶液，在N2环境下反应干燥15min；然后依次用水、无水乙醇淋洗，N2吹干；
(6)封闭
为了减少非特异性吸附，实验中使用10mg·mL-1BSA来封闭电极上未结合NH2-TiO2的羧基位点。在上述得到的电极表面滴加10uL配置好的1％的BSA溶液封闭未结合上氨基化纳米二氧化钛的羧基位点，用时1h。之后依次用碳酸氢铵缓冲液、超纯水清洗两次，氮气吹干，放置于4℃备用。
(7)压电频率测定
本发明对制备的NH2-TiO2/AuE修饰电极对分析物的响应情况进行了详细考察。待NH2-TiO2/AuE修饰电极响应频率达到稳定以后记录频率值(f0，Hz)。然后，滴加α-酪蛋白溶液，让其在N2环境下干燥，大约用时20min。然后依次用碳酸氢铵缓冲溶液(pH＝8.0)、无水乙醇淋洗，N2吹干。待响应频率再次达到稳定时，记录下该频率(fi，Hz)，并通过公式Δf＝f1-f0，对响应频率的改变量(Δf，Hz)进行计算，平行三次。该过程中响应频率的变化与NH2-TiO2/AuE电极表面吸附磷酸蛋白后所引起的质量变化紧密相关。每次分析结束后，使用15％NH3·H2O溶液超声洗脱电极，直到该传感器的频率恢复到最初值。
(8)ɑ-酪蛋白吸附量的测定
根据氨基化纳米二氧化钛对ɑ-酪蛋白的特异性吸附作用，通过改变目标物的浓度，得到不同的吸附量，从而产生的压电频率信号不同，实现对ɑ-酪蛋白的定量检测。
实施例4：
一种用于检测痕量磷酸蛋白的压电传感器的制备方法，制备方法的步骤是：
(1)将氨基化纳米二氧化钛粉末分散于去离子水中，超声分散形成1mg/mL的均一溶液；
(2)将巯基十一烷酸粉末分散于无水乙醇中，超声分散形成2mg·mL-1的均一溶液。
(3)自组装：在三角瓶中加入2.5mL的步骤(2)所制备的巯基十一烷酸溶液，将电极浸泡到该溶液中，避光，过夜自组装，将自组装完毕的石英晶体金电极分别用乙醇和超纯水清洗三次，以除去金电极表面未结合的巯基十一烷酸，储备于无水乙醇中，使用前用N2吹干；(4)活化
向自组装好的电极表面滴加10μLEDC/NHS混合溶液(0.4mol·L-1的EDC和0.1mol·L-1的NHS，v/v＝1/1)，避光，反应2h。反应完毕后，用超纯水清洗电极表面三次，氮气吹干，备用。该活化过程使得电极表面的羧基被酯基取代。
(5)NH2-TiO2的连接：在步骤(4)得到的电极表面滴加15uL氨基化纳米二氧化钛的水溶液，在N2环境下反应干燥25min；然后依次用水、无水乙醇淋洗，N2吹干；
(6)封闭
为了减少非特异性吸附，实验中使用10mg·mL-1BSA来封闭电极上未结合NH2-TiO2的羧基位点。在上述得到的电极表面滴加10uL配置好的1％的BSA溶液封闭未结合上氨基化纳米二氧化钛的羧基位点，用时1h。之后依次用碳酸氢铵缓冲液、超纯水清洗两次，氮气吹干，放置于4℃备用。
(7)压电频率测定
本发明对制备的NH2-TiO2/AuE修饰电极对分析物的响应情况进行了详细考察。待NH2-TiO2/AuE修饰电极响应频率达到稳定以后记录频率值(f0，Hz)。然后，滴加α-酪蛋白溶液，让其在N2环境下干燥，大约用时20min。然后依次用碳酸氢铵缓冲溶液(pH＝8.0)、无水乙醇淋洗，N2吹干。待响应频率再次达到稳定时，记录下该频率(fi，Hz)，并通过公式Δf＝f1-f0，对响应频率的改变量(Δf，Hz)进行计算，平行三次。该过程中响应频率的变化与NH2-TiO2/AuE电极表面吸附磷酸蛋白后所引起的质量变化紧密相关。每次分析结束后，使用15％NH3·H2O溶液超声洗脱电极，直到该传感器的频率恢复到最初值。
(8)ɑ-酪蛋白吸附量的测定
根据氨基化纳米二氧化钛对ɑ-酪蛋白的特异性吸附作用，通过改变目标物的浓度，得到不同的吸附量，从而产生的压电频率信号不同，实现对ɑ-酪蛋白的定量检测。
以上所述仅为本发明创造的较佳实施例而已，并不用以限制本发明创造，凡在本发明创造的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明创造的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种用于检测痕量磷酸蛋白的石英晶体微天平传感器，所述传感器为石英晶体金电极，石英晶体金电极表面修饰特异性吸附磷酸蛋白的薄膜，所述薄膜由巯基十一烷酸和氨基化纳米二氧化钛组成，其特征在于，制备方法包括如下步骤：
（1）将氨基化纳米二氧化钛粉末分散于去离子水中，超声分散形成1mg·mL-1的均一溶液；氨基化纳米二氧化钛粒径为5nm；
（2）将巯基十一烷酸粉末分散于无水乙醇中，超声分散形成2mg·mL-1的均一溶液；
（3）自组装：在三角瓶中加入1-2.5mL的步骤（2）所制备的巯基十一烷酸溶液，将金电极浸泡到该溶液中，避光，过夜自组装，分别用乙醇和超纯水清洗三次，以除去金电极表面未结合的巯基十一烷酸，储备于无水乙醇中，使用前用N2吹干；
（4）活化：向自组装好的电极表面滴加10μL EDC/NHS 混合溶液，避光，反应2 h，反应完毕后，用超纯水清洗电极表面三次，氮气吹干，备用；EDC/NHS 混合溶液是0.4mol·L-1的EDC和0.1mol·L-1的NHS按照体积比1:1配制而成；
（5）NH2-TiO2的连接：在步骤（4）得到的电极表面滴加2.5-15uL氨基化纳米二氧化钛的水溶液，在N2环境下反应干燥15-25min；然后依次用水、无水乙醇淋洗，N2吹干；
（6）封闭：在步骤（5）得到的电极表面滴加10uL配制好的1%的BSA溶液封闭未结合上氨基化纳米二氧化钛的羧基位点，用时1h，之后依次用碳酸氢铵缓冲液、超纯水清洗两次，氮气吹干，放置于4℃备用。
2.一种如权利要求1所述用于检测痕量磷酸蛋白的石英晶体微天平传感器在检测痕量磷酸蛋白上的应用，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将由巯基十一烷酸和氨基化纳米二氧化钛修饰的纳米薄膜石英晶体微天平传感器，置于石英晶体微天平检测系统的检测室中；同时信号采集系统的电脑记录由检测室中的石英晶体微天平通过晶振传感的、由频率计采集的频率数据；
（2）向步骤（1）中的石英晶体微天平传感器的电极上滴加1mg/mLα-酪蛋白溶液5-15uL，滴加α-酪蛋白溶液的pH值为6.5，将其在N2环境下干燥20-30min，然后依次用pH=8.0碳酸氢铵缓冲溶液、无水乙醇淋洗，N2吹干；同时信号采集系统的电脑记录由检测室中的石英晶体微天平通过晶振传感的、由频率计采集的频率数据；
（3）比较步骤（2）和步骤（1）的石英晶体微天平传感器在滴加α-酪蛋白溶液前后的振动频率变化值表明磷酸蛋白的存在。
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