JP7057956B2 - 分析方法、吸着防止剤および分析用キット - Google Patents
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Description
本発明の第2の態様によると、第1の態様の分析方法において、前記リン酸基を有する化合物は、核酸、ヌクレオチドおよびこれらの誘導体の少なくとも一つであることが好ましい。
本発明の第3の態様によると、第1または第2の態様の分析方法において、前記試料は、細胞からの抽出物を含むことが好ましい。
本発明の第4の態様によると、第1から第3までのいずれかの態様の分析方法において、前記シュウ酸またはその塩の濃度は、0.1mM以上50mM以下であることが好ましい。
本発明の第5の態様によると、第1から第4までのいずれかの態様の分析方法において、前記質量分析では、エレクトロスプレー法により前記試料がイオン化されることが好ましい。
本発明の第6の態様によると、吸着防止剤は、シュウ酸またはその塩を含み、液体クロマトグラフィ/質量分析の移動相に添加され、リン酸基を有する化合物を含む試料の金属への吸着を防ぐためのものである。
本発明の第7の態様によると、分析用キットは、第6の態様の吸着防止剤を含む。
従来、細胞内の代謝物の分析等、複数の化合物を含む試料をLC/MS(以下、「LC/MS」は2段階以上の質量分析を行う場合も含む)に供する際、イオン化を補助する目的でギ酸を含む移動相を用いていた。しかし、移動相にギ酸を用いる従来の方法では、上述のようにヌクレオチド等のリン酸基を有する化合物が配管等で金属吸着を起こす問題があった。本実施形態の分析方法では、シュウ酸を含む移動相を用いてLC/MSを行うことにより、リン酸基を有する化合物を感度よく分析するものである。
試料は、リン酸基を有する化合物を含む試料であれば特に限定されない。当該化合物がリン酸基をより多く有する程、金属への吸着性が高まるため本実施形態の分析方法を好適に適用することができる。分析対象としての重要性から、試料に含まれるリン酸基を有する化合物としては、核酸、ヌクレオチドおよびこれらの誘導体の少なくとも一つが好ましい。当該誘導体は、リン酸基が存在すればその誘導体化の方法は特に限定されない。
試料の前処理の方法は、分析対象の成分を含むように分析用試料が調製され、LC/MSが所望の精度で行われれば特に限定されない。前処理では、採取された試料から、分析対象の成分を含むように抽出や、濃縮等の精製が適宜行われる。試料が生物に由来する細胞や組織であって代謝物を分析する場合、例えば、破砕等により細胞質成分を分離した後、メタノール・クロロホルム抽出法等により親水性代謝物の抽出を行い、抽出された親水性代謝物の濃縮を行う。得られた溶液は適宜希釈されて液体クロマトグラフに導入される。
本実施形態の分析方法における液体クロマトグラフィおよび質量分析は、液体クロマトグラフ-質量分析計を分析装置として行われることが好ましいが、別々に制御された液体クロマトグラフおよび質量分析計を用いた場合でも分析を行うことは可能である。
なお、移動相は、シュウ酸の塩を含んでもよい。
なお、質量分析計20の各部の構成は、試料イオンSiを所望の精度で検出可能であれば特に限定されない。
なお、情報処理部40は、液体クロマトグラフ10および質量分析計20と一体になった一つの装置として構成してもよい。また、本実施形態の分析方法に用いるデータの一部は遠隔のサーバ等に保存してもよく、当該分析方法で行う演算処理の一部は遠隔のサーバ等で行ってもよい。測定部100の各部の動作の制御は、情報処理部40が行ってもよいし、各部を構成する装置がそれぞれ行ってもよい。
なお、解析部52による解析の方法は特に限定されない。
図2は、本実施形態の分析方法に用いられる分析用キットを模式的に示す図である。分析用キット9は、リン酸基を有する化合物を含む試料Sの金属への吸着を防ぐための吸着防止剤90を備え、吸着防止剤90は、シュウ酸またはその塩を含む。吸着防止剤90は、バイアル91に格納されているが、吸着防止剤90を格納する容器の種類、大きさおよび形状は特に限定されない。
なお、分析用キット9は、吸着防止剤90の他に液体クロマトグラフィや質量分析に用いられる任意の消耗品等を含むことができる。
(1)本実施形態の分析方法は、リン酸基を有する化合物を含む試料Sの金属への吸着を防ぐための吸着防止剤を含む移動相を用いて液体クロマトグラフィを行うことと、液体クロマトグラフィの溶出液を質量分析することとを備え、吸着防止剤は、シュウ酸またはその塩を含む。これにより、液体クロマトグラフィにおいてヌクレオチド等のリン酸基を有する化合物の金属吸着を抑制し、質量分析において感度よく、または精度よくこれらの化合物を検出することができる。
(変形例1)
上述の実施形態の分析装置1はトリプル四重極質量分析計としたが、質量分析部20の構成は特に限定されない。質量分析部20は、1つの質量分析器からなる質量分離部を備えてもよいし、上述の実施形態とは異なる組合せの2以上の質量分析器からなる質量分離部を備えてもよい。例えば、分析装置1は、イオントラップや飛行時間型の質量分離部を含んで構成することができる。
なお、本発明は、以下の実施例に示された数値、条件に限定されない。
比較例1では、0.1体積%のギ酸が添加された移動相を用いて、0.1μM CTP溶液を分析した。
分析用試料を、以下の条件で液体クロマトグラフィで分離した。
システム:NexeraX2(Shimadzu)
分析カラム: Discovery HS F5-3(Sigma-Aldrich)(内径2.1mm、長さ150mm、粒径3μm)
注入量: 3μL
カラム温度: 40℃
移動相:
(A)0.1%ギ酸(水に溶解)
(B)0.1%ギ酸(アセトニトリルに溶解)
流速: 0.25mL/min
グラジエントプログラム:
時間(分) 移動相Bの濃度(%)
0 0
2 0
5 25
11 35
15 95
20 95
20.1 0
35 0
上記液体クロマトグラフィにおいて溶出された溶出試料を、溶出口に直接接続したタンデム質量分析により検出した。
システム:LCMS-8050(Shimadzu)
イオン化の方法: エレクトロスプレー法、正イオンモード
測定モード: 多重反応モニタリング(MRM)
温度:
脱溶媒管(Desolvation Line;DL)温度: 250℃
ヒートブロック温度: 400℃
インターフェイス温度: 300℃
ガス流量:
ネブライザーガス流量: 3.0L/min
ドライングガス流量: 10.0L/min
ヒーティングガス流量: 10.0L/min
実施例1では、10mMのシュウ酸が添加された移動相を用いて、0.1μM CTP溶液を分析した。
分析用試料を、以下の条件で液体クロマトグラフィで分離した。
システム:NexeraX2(Shimadzu)
分析カラム: Discovery HS F5-3(Sigma-Aldrich)(内径2.1mm、長さ150mm、粒径3μm)
注入量: 3μL
カラム温度: 40℃
移動相:
(A)10mMシュウ酸(水に溶解)
(B)10mMシュウ酸(アセトニトリルに溶解)
流速: 0.3mL/min
グラジエントプログラム:
時間(分) 移動相Bの濃度(%)
0 0
3 0
9 100
13 100
13.01 0
17 0
上記液体クロマトグラフィにおいて溶出された溶出試料を、溶出口に直接接続したタンデム質量分析により検出した。
システム:LCMS-8050(Shimadzu)
イオン化の方法: エレクトロスプレー法、正イオンモード
測定モード: MRM
温度:
脱溶媒管(DL)温度: 250℃
ヒートブロック温度: 400℃
インターフェイス温度: 300℃
ガス流量:
ネブライザーガス流量: 3.0L/min
ドライングガス流量: 10.0L/min
ヒーティングガス流量: 10.0L/min
比較例2では、0.1体積%のギ酸が添加された移動相を用い、比較例1の場合と略同様の条件で、0.1μM シチジン二リン酸(CDP)溶液および0.1μM グアノシン二リン酸(GDP)溶液をそれぞれ分析した。質量分析ではCDPおよびGDPをそれぞれ検出するようにトランジションを設定した。
実施例2では、10mMのシュウ酸が添加された移動相を用い、実施例1の場合と略同様の条件で、0.1μM CDP溶液および0.1μM GDP溶液をそれぞれ分析した。質量分析ではCDPおよびGDPをそれぞれ検出するようにトランジションを設定した。
日本国特許出願2018年第207620号(2018年11月2日出願)
Claims (7)
- リン酸基を有する化合物を含む試料の金属への吸着を防ぐための吸着防止剤を含む移動相を用いて液体クロマトグラフィを行うことと、
前記液体クロマトグラフィの溶出液を質量分析することと
を備え、
前記吸着防止剤は、シュウ酸またはその塩を含む分析方法。 - 請求項1に記載の分析方法において、
前記リン酸基を有する化合物は、核酸、ヌクレオチドおよびこれらの誘導体の少なくとも一つである分析方法。 - 請求項1または2に記載の分析方法において、
前記試料は、細胞からの抽出物を含む分析方法。 - 請求項1または2に記載の分析方法において、
前記シュウ酸またはその塩の濃度は、0.1mM以上50mM以下である分析方法。 - 請求項1または2に記載の分析方法において、
前記質量分析では、エレクトロスプレー法により前記試料がイオン化される分析方法。 - シュウ酸またはその塩を含み、
液体クロマトグラフィ/質量分析の移動相に添加され、
リン酸基を有する化合物を含む試料の金属への吸着を防ぐための吸着防止剤。 - 請求項6に記載の吸着防止剤を含む分析用キット。
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