FR2817266A1 - Micro reseau statique de sondes biologiques ou chimiques, immobilisees sur un support par attraction magnetique - Google Patents

Micro reseau statique de sondes biologiques ou chimiques, immobilisees sur un support par attraction magnetique Download PDF

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Abstract

L'invention porte sur un réseau organisé de sondes biologiques ou chimiques, liées à un support par couplage magnétique à l'aide d'un vecteur de fixation. Le support peut comporter un aimant permanent ou présenter un magnétisme électro-induit. Les vecteurs de fixation peuvent être constitués de billes magnétiques fonctionnalisées pour être capables de se lier spécifiquement à un type de sondes biologiques.

Description

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MICRO RESEAU STATIQUE DE SONDES BIOLOGIQUES OU
CHIMIQUES, IMMOBILISEES SUR UN SUPPORT PAR ATTRACTION
MAGNETIQUE La présente invention a pour objet un réseau de ligands biologiques ou chimiques (sondes) immobilisés sur un support non fonctionnalisé chimiquement, par attraction magnétique.
Les sondes peuvent être des produits naturels ou synthétiques ayant une activité biologique ou chimique ou une affinité pour des molécules biologiques ou chimiques, par exemple, des peptides, des protéines, des oligonucléotides, des ARN, des ADN double brin ou simple brin, des polysaccharides et des phospholipides et des combinatoires de produits chimiques. Ces réseaux, d'un coût très réduit, peuvent trouver des applications dans de nombreux domaines, par exemple comme outils de diagnostic, ou comme outils de criblage de collections de molécules ou d'échantillons biologiques, ou de molécules à visée thérapeutique ou diagnostique. L'invention réside dans l'immobilisation stable de ces ligands sur une surface magnétique, pour organiser un réseau de sondes biologiques ou chimiques. Cette méthode peut être adaptée à la production de micro réseaux de densité variable ou de macro réseaux.
De nombreuses méthodes ont été proposées au cours des dernières années, pour fabriquer des réseaux miniaturisés comportant des sondes biologiques immobilisées à des positions bien définies.
Il existe deux technologies pour fabriquer de telles matrices. La première technologie consiste à faire une synthèse directe d'oligonucléotides courts ou de peptides, sur une surface préalablement fonctionnalisée et activée pour permettre le greffage.
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La seconde technologie consiste à immobiliser les ligands préalablement synthétisés et caractérisés avant leur immobilisation, sur une surface fonctionnalisée, le dépôt de ces sondes pouvant être réalisé par des méthodes mécaniques ou électrochimiques.
Plusieurs brevets et publications décrivent l'application de la photolithogravure, pour réaliser un adressage photochimique, notamment pour l'obtention d'une matrice d'oligonucléotides ou de peptides par adressage photochimique. Ce procédé consiste à utiliser des surfaces fonctionnalisées chimiquement et protégées par des groupements photo-activables. Une illumination sélective à l'aide de masques permet ensuite de déprotéger les différents sites de couplage et de réaliser une synthèse in situ de l'oligonucléotide ou du peptide.
Cette méthode d'adressage photochimique présente plusieurs inconvénients.
Tout d'abord, les réactions de déprotection n'ont pas un rendement de 100%.
Par conséquent, les synthèses in situ accumulent des erreurs pouvant conduire par exemple à des ligands tronqués et à des misappariements terminaux dans le cas d'oligonucléotides. Ceci impose une forte redondance des sondes et de nombreux contrôles, ainsi qu'une informatique lourde pour reconstituer un signal standard. D'autre part, la qualité des réactions d'interaction ou d'hybridation avec des ligands de courte taille immobilisés en phase solide est difficile à prédire. Enfin, l'utilisation de jeux de masques complique le procédé et le rend coûteux et peu flexible, ce qui constitue un inconvénient majeur. En effet, les bases de données génomiques et fonctionnelles sont en perpétuelle évolution, puisqu'elles intègrent en permanence les nouveaux résultats obtenus par de très nombreux laboratoires. Ceci conduit d'une part à un enrichissement de ces bases de données, et d'autre part, à la correction de certaines séquences erronées présentes dans ces bases. Dans les domaines de la recherche et des études
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cliniques, il est donc utile de pouvoir adapter le réseau utilisé à l'objet biologique étudié, en fonction de l'évolution des connaissances. Les procédés de fabrication de réseaux décrits ci-dessus, reposant sur l'utilisation de jeux de masques, n'ont pas la souplesse nécessaire pour modifier rapidement et à peu de frais la séquence de certaines sondes, ni pour ajouter facilement ne fût-ce qu'une sonde supplémentaire.
Le deuxième type de technologie employé pour produire des réseaux de sondes paraît a priori plus adapté à l'intégration de nouvelles données, puisqu'il consiste à synthétiser et caractériser individuellement des sondes avant de les immobiliser sur un support.
Une première méthode de greffage de sondes a été décrite dans Lehrach et al. (in Hybridization fingerprinting in genome mapping and sequencing, genome analysis, 1990, Cold Spring Harbor press, pages 39-81). Cette méthode utilise des aiguilles pour constituer des réseaux de 9216 unités d'hybridation. La limite de cette méthode réside dans la grande variabilité des dépôts et le nombre réduit de réseaux qui peuvent être produits à la fois.
D'autres technologies d'adressage par voie mécanique ou électrochimique ont été décrites. Dans ces méthodes, les ligands sont préparés, purifiés puis déposés sur une surface activée. Par exemple, des oligonucléotides de longueurs variables et des sondes double brin pré-amplifiées peuvent être déposés pour réaliser des réseaux de matrices d'ADN. La surface de dépôt peut être en verre ou en silicium poreux ou non, en matériau polymère ou toute autre surface fonctionnalisée chimiquement.
Ainsi, plusieurs documents décrivent l'utilisation de la technique de micro pipetage ou de repiquage à l'aide d'aiguilles pour déposer des sondes nucléiques sur des surfaces de verre fonctionnalisées par de la Poly-L-lysine ou par un gel de polyacrylamide activé en substituant certains groupes amides en groupes hydrazides. Ces méthodes présentent plusieurs inconvénients majeurs. En premier lieu, la fonctionnalisation chimique de la
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surface sans laquelle une fixation covalente et robuste du ligand n'est pas possible est difficile à contrôler. De plus, la densité des ligands déposés et immobilisés n'est pas contrôlable. Enfin, le greffage chimique des sondes peut, dans certains cas, altérer leur réactivité vis-à-vis de leur cible, par exemple dans le cas d'un récepteur fixé à un support fonctionnalisé par l'intermédiaire d'un groupement amine proche du site de reconnaissance.
Des techniques d'adressage électrochimique ont également été décrites (demande de brevet WO A-94/22889). Dans ce cas, on part d'un support qui comporte plusieurs électrodes et on utilise ces électrodes pour fixer des ligands biologiques par voie électrochimique en utilisant des ligands préalablement fonctionnalisés à l'aide d'un électrolyte comme le noyau pyrrole ayant la propriété de polymériser sous l'effet d'un courant. Cette méthode présente l'avantage d'un adressage contrôlé de ligands sur une zone de réaction. L'adressage nécessite cependant l'utilisation d'une surface conductrice, de réactifs fonctionnalisés et un lourd procédé pour l'industrialisation et le contrôle qualité des matrices produites en grandes séries.
Tous les procédés décrits ci-dessus ont permis de fabriquer des micro réseaux de sondes biologiques, mais sont limités dans leur possibilité de diversification et par leur mise en oeuvre, souvent complexe, à l'échelle industrielle.
De plus, la plupart des documents cités ci-dessus décrivent l'utilisation de ces méthodes pour obtenir des réseaux de sondes nucléiques limitées à des oligonucléotides ou à des ADN double brin. Il est pourtant plus avantageux, pour des raisons de sensibilité, d'utiliser des sondes d'ADN simple brin d'une taille supérieure à celle des oligonucléotides synthétiques, qui dépassent difficilement quelques dizaines de nucléotides. Par exemple, des sondes d'ADN simple brin de 100 à 500 bases permettraient d'obtenir une excellente spécificité d'hybridation. De plus, l'avènement de la génomique fonctionnelle
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crée une demande importante de réseaux de sondes polypeptidiques, protéiques et même cellulaires.
On voit donc qu'il existe un besoin important de méthodes moins coûteuses, plus adaptées à de nombreuses modifications, permettant d'utiliser tous les types de sondes (nucléiques, protéiques, cellulaires, chimiques...), et qui puissent être réalisées sur demande dans des laboratoires sans équipement particulier.
La présente invention a précisément pour objet des micro réseaux de sondes extrêmement diversifiées et qui peuvent être des sondes nucléiques (oligonucléotides, ADN double brin ou ADN simple brin, ARN,...), des protéines (récepteurs membranaires, anticorps monoclonaux, peptides, protéines recombinantes ou des domaines de celles-ci,...), ou encore des virus, des cellules, ou des molécules de synthèse organique issues de chimiothèques. Ces réseaux de sondes biologiques ou chimiques sont de réalisation aisée, par un procédé qui repose sur l'immobilisation des sondes sur un support par interaction magnétique. Les matrices ainsi créées sont utilisables dans tous les domaines d'utilisation des micro ou macro réseaux, et plus particulièrement en diagnostic, pharmacogénomique, toxicogénomique, étude de la structure et de l'expression de génomes, et de manière générale dans tout type d'application mettant en jeu des interactions moléculaires. Elles peuvent donc notamment servir d'outils de diagnostic ou de criblage à haut débit. La fabrication de ces réseaux ne nécessite aucune fonctionnalisation chimique préalable du support et peut être faite de façon simple et peu coûteuse. La qualité du substrat chimique sur lequel s'effectue l'immobilisation n'est plus un élément limitant.
Un des avantages de l'invention est également d'augmenter la sensibilité de détection de ces réseaux. La possibilité de fixer des ADN simple brin, qui évite la compétition du double brin lors de l'hybridation de cibles nucléiques est un exemple significatif. La possibilité de fixer aisément plusieurs
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fragments ou domaines de protéines recombinantes préalablement testés pour leurs activités spécifiques est un autre exemple significatif. L'absence d'un traitement chimique pour le greffage des sondes permet de réaliser un traitement optique de série sur les lames, pour les rendre inertes à la fluorescence et à la diffusion parasites.
L'exposé détaillé de l'invention fait appel à plusieurs notions qui sont définies ci-après : Dans l'ensemble du texte, le terme sondes biologiques désignera : - n'importe quelle molécule biologique telle que peptides, protéines et glycoprotéines (antigènes, anticorps, récepteurs, ligands ou fragments de ceux-ci...), acides nucléiques (ADN simple ou double brin, oligonucléotides, ARN), carbohydrates, lipoprotéines, lipides, - n'importe quel type de cellules (bactéries, protozoaires, levures, champignons, cellules eucaryotes,...), - n'importe quel type de virus, - fragments de cellules ou de virus, etc.
Les sondes chimiques désignent n'importe quel type de molécule chimique, issue par exemple de chimiothèques.
Dans cette demande, un vecteur de fixation est un élément capable, d'une part, de se lier covalemment ou par des interactions fortes, à une sonde biologique et/ou chimique et, d'autre part, capable de se fixer à un support, par attraction magnétique. Dans un cas particulier, un vecteur de fixation est une bille magnétique du type des billes connues de l'homme du métier, utilisées couramment en biologie pour faire de la séparation cellulaire ou de la purification moléculaire, et commercialisées par exemple par Miltenyi ou Dynabeads (par exemple Dynal M-280 streptavidine). Le vecteur
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de fixation n'est pas nécessairement sphérique. Dans tous les cas, le diamètre du vecteur de fixation désignera le diamètre de la sphère à laquelle la particule est circonscrite.
Un réseau organisé peut être défini comme un ensemble de points tels que le contenu de chaque point est connu en fonction de ses coordonnées. Par extension, le terme réseau désignera ici un ensemble de points fixés sur un support, et sera alors synonyme de puce .
Une magnéto-puce est une puce selon l'invention, c'est-à-dire un réseau de ligands ou sondes biologiques ou chimiques immobilisés sur un support, par attraction magnétique, via un vecteur de fixation.
Un point du réseau (spot en anglais) est, dans le cas de la présente invention, une unité d'hybridation ou de réaction portant une sonde donnée, et présentant une densité donnée.
La densité d'un point se définit ici comme le nombre de sondes par point (par exemple nombre de molécules, si la sonde est moléculaire).
La densité d'un réseau désigne le nombre de points par unité de surface.
Un matériau paramagnétique se caractérise par une susceptibilité magnétique faible et une perte rapide de son magnétisme dès lors qu'il n'est plus dans un champ magnétique.
Les matériaux ferromagnétiques ont une susceptibilité magnétique élevée et sont capables de conserver des propriétés magnétiques en l'absence de champ magnétique (magnétisme permanent).
Les matériaux dits superparamagnétiques sont caractérisés par une susceptibilité magnétique élevée (c'est à dire qu'ils deviennent fortement
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magnétiques lorsqu'ils sont placés dans un champ magnétique), mais, à l'instar des matériaux paramagnétiques, ils perdent rapidement leur magnétisme en l'absence de champ magnétique. On peut obtenir du superparamagnétisme dans des matériaux ferromagnétiques quand la taille du cristal est inférieure à une valeur critique. Des billes superparamagnétiques présentent le double avantage de pouvoir subir une attraction forte par un aimant, et de ne pas s'agréger en l'absence de champ magnétique.
Le support peut être constitué d'une simple lame aimantée, et crée alors un champ magnétique d'intensité homogène à sa surface. Alternativement, le support peut présenter un magnétisme structuré , défini par une intensité du champ magnétique qui n'est pas homogène à la surface du support et présente des maxima à des positions bien définies. Ceci est le cas par exemple d'une lame de silice dans laquelle seraient incrustés des microaimants (structuration tridimensionnelle), ou d'une lame aimantée simple recouverte par un masque opaque au champ magnétique et percé de fenêtres régulièrement espacées (structuration bidimensionnelle).
La présente invention consiste à fixer à des positions bien définies, organisées en réseau sur un support magnétique, des sondes biologiques ou chimiques reliées par une liaison covalente ou par des interactions fortes à une particule capable d'être attirée par une force magnétique. Ces particules constituent les vecteurs de fixation . Les sondes sont retenues à des coordonnées précises du support par l'interaction entre les vecteurs de fixation et le support magnétique.
Le support doit donc être capable de fournir ou de subir une attraction magnétique. Il peut être constitué d'une lame aimantée simple, mais il peut s'agir aussi d'un support structuré comportant des zones tridimensionnelles magnétiques, par exemple d'une lame de silice comportant des cavités
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remplies de particules ferromagnétiques. Le magnétisme du support peut aussi être d'origine électrique. Un exemple de support présentant un électromagnétisme structuré est un micro-circuit comportant un ensemble de boucles conductrices parcourues par un courant.
Les vecteurs de fixation, permettant le couplage des sondes au support, sont des éléments capables de subir et éventuellement de fournir une attraction magnétique. Ces vecteurs de fixation peuvent être paramagnétiques, c'est-àdire qu'ils sont attirés par un aimant mais ne présentent pas de magnétisme lorsqu'ils sont placés en dehors du champ magnétique. Cependant, le couplage des sondes au support par des vecteurs de fixation en matériau paramagnétique ne sera pas très fort, et il est donc préférable d'envisager l'utilisation de matériaux superparamagnétiques ou ferromagnétiques. Il peut s'agir par exemple de billes magnétiques d'un diamètre inférieur à 5 lit, communément utilisées en biologie et peu coûteuses, ou de nanoparticules telles que les nanoferrines.
La fixation de la ou des sondes au vecteur de fixation peut se faire, soit par des liaisons covalente, soit par des liaisons non covalente de type affine par exemple, telles que les liaisons mises en jeu entre la streptavidine et la biotine, les liaisons antigènes anticorps ou les interactions récepteurs ligands. De nombreux types de billes magnétiques recouvertes de molécules capables de se lier spécifiquement à une cible biologique sont déjà commercialisés. Il s'agit par exemple de billes recouvertes de streptavidine ou d'avidine, capables d'interagir avec la biotine, ou de billes portant des anticorps particuliers capables de se lier à des protéines, ou à des cellules par interaction avec un récepteur membranaire. Des billes recouvertes d'oligonucléotides poly-dT ou poly-U peuvent aussi être utilisées comme vecteur de fixation pour des sondes d'acides nucléiques comportant un résidu poly A (par exemple, des ADNc ayant une"queue"poly-A ou des ARN messagers). Ces exemples ne sont aucunement limitatifs, et l'homme du
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métier est en mesure de choisir d'autres vecteurs de fixation adaptés à l'application qu'il souhaite faire des réseaux décrits ici.
Chaque point du réseau, ou unité d'hybridation, représente quelques dizaines de m à 1 mm2 répertoriés du support, sur lesquels sont greffées des sondes identiques immobilisées par l'interaction de leur vecteur de fixation. Le diamètre des points du réseau dépend du type de vecteur de fixation utilisé et sera choisi en fonction de l'application envisagée. Ainsi, dans une puce à ADN destinée au diagnostic ou au criblage à haut débit, les points du réseau seront avantageusement de taille réduite, par exemple d'un diamètre de l'ordre de 50 m. En revanche, un diamètre plus important, par exemple de 200 ptm, sera préféré dans d'autres types d'applications, par exemple dans le cas où les sondes sont des cellules. De manière préférée, tous les points d'un même réseau auront la même surface. L'invention porte donc sur un réseau bidimensionnel ou tridimensionnel de points régulièrement disposés sur le support, chaque point étant constitué d'un type de sonde biologique ou chimique différent, relié par des liaisons covalente ou des interactions fortes avec son vecteur de fixation, lui-même immobilisé sur le support par interaction magnétique.
L'originalité d'un tel réseau réside dans la méthode utilisée pour immobiliser le couple sonde/vecteur de fixation à des coordonnées précises sur le support afin de former un micro réseau. L'immobilisation des sondes dans le réseau n'est pas due à une réaction chimique mais fait appel à une force physique : la force magnétique.
Le couplage des sondes au support par interaction magnétique par l'intermédiaire d'un vecteur de fixation présente de nombreux avantages. En premier lieu, ce type de couplage évite tout traitement chimique préalable du support en vue de la fixation des sondes, et ne nécessite pas de stockage dans des conditions particulières. En effet, dans le cadre d'une fonctionnalisation chimique de la surface du support, les aléas du traitement
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de surface et les dégradations survenant durant le stockage, ne permettent pas de garantir la reproductibilité et la stabilité d'un substrat chimique. A titre d'exemple, on peut citer la déshydratation ou la réhydratation de substrat Lysine ou Polyacrylamide. Dans le cas des réseaux décrits dans la présente invention, les supports magnétiques sont utilisables instantanément et n'ont pas besoin de conditionnement particulier.
De plus, l'absence de nécessité d'un traitement chimique du support pour la fixation des sondes permet de recouvrir la surface du support par une substance optiquement neutre et perméable aux champs magnétiques, en vue d'une détection optimale.
Les sondes moléculaires peuvent être constituées de molécule d'ARN ou d'ADN, double ou simple brin, de protéines ou de peptides, d'une manière plus générale de tout type de molécules biologique ou chimique que l'on veut immobiliser de façon stable à des positions précises sur un support, dans le but de constituer un micro réseau. Dans le cadre des études des acides nucléiques, la taille et la qualité des fragments d'ADN ou d'ARN simple brin utilisés n'est pas limitant, car ils sont synthétisés et purifiés en dehors de la puce, dans des conditions optimales. Dans une réalisation particulière des réseaux de l'invention, illustrée à l'exemple 4, les sondes sont des molécules d'ADN simple brin de taille importante, ce qui augmente la sensibilité de détection par rapport à des sondes oligonucléotidiques ou d'ADN double brin.
La fixation des sondes au support par l'intermédiaire d'un vecteur de fixation couplé au support par interaction magnétique permet également de réaliser très facilement des réseaux de cellules génétiquement modifiées ou non pour cribler des molécules. A titre d'exemple, des cellules génétiquement modifiées pour exprimer des gènes de stress pourront être immobilisées
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pour des criblages d'agents de stress ou de molécules anti-stress en grandes séries.
L'immobilisation durable du couple sonde moléculaire/vecteur de fixation au support fixe dans le but de réaliser un micro réseau, résulte de l'interaction magnétique du vecteur de fixation et du support. Il est important de noter que dans cette approche, les membres du couple support de fixation/vecteur de fixation, ne doivent pas nécessairement fournir tous les deux une force magnétique (ou champ magnétique) simultanément. Il suffit que l'un des deux acteurs fournisse la force (ou le champ magnétique) et que l'autre acteur soit capable de subir cette force (soit attiré par le champ magnétique).
L'invention porte donc en premier lieu sur un réseau organisé de sondes biologiques ou chimiques, liées à un support par couplage magnétique, à l'aide d'un vecteur de fixation. De manière préférée, le support est optiquement neutre.
Dans une réalisation particulière de l'invention, le support comporte un aimant permanent, par exemple un aimant samarium-cobalt ou néodyme-ferbore, tels que ceux commercialisés par la société UGIMAG, 38830 Saint Pierre d'Allevard, France.
Alternativement, le support présente un magnétisme électro-induit.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, le support présente un magnétisme structuré. Si le support comporte un aimant permanent, cette propriété peut résulter de la structure même du support. Celui-ci peut être par exemple constitué d'une lame d'un matériau inerte sur le plan magnétique (par exemple, de silice), qui comporte des trous régulièrement espacés que l'on remplit de particules ferromagnétiques. Le magnétisme structuré peut aussi être obtenu à partir d'un aimant permanent plan, et l'utilisation d'un masque. Dans le cas d'un support électromagnétique, un
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magnétisme structuré peut être obtenu par exemple avec un micro-circuit comportant un ensemble de boucles conductrices en parallèle.
Le support magnétique peut être choisi de telle façon que le champ magnétique soit perpendiculaire ou parallèle à la plus grande surface du support.
Les réseaux de la présente invention comportent des vecteurs de fixation, qui assurent le couplage des sondes biologiques ou chimiques au support magnétique. Ces vecteurs de fixation doivent par définition être capables de subir et le cas échéant de fournir une attraction magnétique. Un vecteur de fixation est donc paramagnétique, superparamagnétique ou ferromagnétique.
Un exemple de vecteur de fixation est une bille de latex ou de polysaccharides, comportant des particules d'oxyde de fer.
Les vecteurs de fixation peuvent être multipolaires ou au contraire capables de s'orienter dans un champ magnétique. Dans une réalisation particulière de l'invention, les vecteurs de fixation sont eux-mêmes aimantés. Toutefois, des vecteurs de fixation aimantés présentent l'inconvénient de s'agréger même en l'absence d'un champ magnétique. Les vecteurs de fixation seront donc préférentiellement superparamagnétiques.
Les vecteurs de fixation utilisables pour réaliser des réseaux selon la présente invention ont un diamètre compris entre 1 nm et 500 pm, préférentiellement entre 0,5 et 5 m.
Les vecteurs de fixation sont destinés à assurer le couplage des sondes au support. Outre leurs propriétés magnétiques, ils doivent donc être capables de se lier aux sondes, par liaison covalente ou par des interactions fortes, par exemple de type affine. Dans une réalisation préférée de l'invention, le vecteur de fixation porte des éléments capables de se lier spécifiquement à une cible biologique. Un exemple de liaison covalente, spécifique d'un type de cibles, est celle établie par condensation entre une base de Schiff et
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certains composés de type R-NH2. Des exemples de liaisons non covalente spécifiques d'une cible biologique sont les interactions affines établies entre un récepteur et un ligand correspondant, ou entre un antigène et un anticorps le reconnaissant. Il peut aussi s'agir de liaisons hydrogène établies entre deux séquences d'acides nucléiques complémentaires. Dans la suite de ce texte, on dira qu'un vecteur de fixation porte des éléments capables de se lier spécifiquement à une cible biologique lorsqu'il porte des éléments ayant une affinité élevée pour un type de molécules biologiques donné.
Suivant le type de sonde considéré, ces éléments peuvent être sélectionnés par exemple dans le groupe comportant les immunoglobulines, les antigènes ou les fragments de ceux-ci, les récepteurs membranaires, les ligands de récepteurs membranaires, l'avidine, la streptavidine, les oligonucléotides poly-T ou poly-U, ou toute molécule chimique ou biologique permettant une interaction spécifique.
L'invention porte également sur le produit de couplage entre une sonde biologique ou chimique et un vecteur de fixation. Suivant la nature de la sonde, le nombre d'exemplaires de la sonde couplés à chaque vecteur de fixation sera compris entre 1 (par exemple, quand la sonde est une cellule) et 108 (par exemple, pour une sonde nucléique). En particulier, l'invention porte sur le produit de couplage entre une sonde d'acide nucléique et un vecteur de fixation. La sonde d'acide nucléique est préférentiellement une sonde d'ADN simple brin d'une taille supérieure à 50 nucléotides, mais il peut aussi s'agir d'un oligonucléotide simple brin ou d'ADN double brin. Chaque produit de couplage entre un vecteur de fixation et une sonde d'acide nucléique porte un nombre compris entre 103 et 108, préférentiellement entre 105 et 107 sondes nucléotidiques.
L'utilisation d'un produit de couplage formé d'une sonde biologique ou chimique et d'un vecteur de fixation, pour la fabrication d'un réseau organisé de sondes biologiques ou chimiques, fait aussi partie intégrante de l'invention.
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Dans les réseaux de l'invention, chaque sonde couplée à son vecteur de fixation est déposée en un point dont le diamètre est compris entre 10 m et 1 mm, préférentiellement entre 50 et 200 pm. Le diamètre des points sera choisi par l'homme du métier en fonction du type d'application considérée, en particulier en fonction du type de sonde utilisée.
Chaque point des réseaux de l'invention comporte entre 105 et 1010 sondes, préférentiellement entre 108 et 1010 sondes. Le nombre de sondes par point est le produit du nombre de vecteurs de fixation par point, multiplié par le nombre de sondes liées en moyenne à un vecteur de fixation. Ces deux paramètres sont contrôlables expérimentalement. Le nombre de sondes liées en moyenne à un vecteur de fixation dépend notamment de la capacité du vecteur, c'est-à-dire du nombre moyen de sites de liaison de chaque vecteur. Cette capacité est indiquée par les fournisseurs de billes magnétiques fonctionnalisées. Le nombre de vecteurs de fixation par point sera calculé par l'homme du métier pour que la densité de vecteurs de fixation par unité de surface soit telle que les vecteurs de fixation forment une monocouche. Les réseaux de l'invention peuvent donc avantageusement avoir des points de densité homogène, c'est-à-dire que chaque point comporte théoriquement le même nombre de sondes.
La densité des réseaux de l'invention est comprise entre 1 et 100000 points par cm2, préférentiellement entre 10 et 1000 points par cm2.
L'invention porte également sur des procédés de fabrication d'un réseau organisé de sondes biologiques ou chimiques, liées à un support par couplage magnétique à l'aide d'un vecteur de fixation. Un premier procédé de l'invention, décrit à l'exemple 1, comporte les étapes suivantes :
A) liaison des sondes au vecteur de fixation,
B) dépôt sur un support magnétique, des sondes couplées au vecteur de fixation, selon un réseau organisé.
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Un autre procédé de fabrication, illustré à l'exemple 2, d'un réseau organisé de sondes biologiques ou chimiques, liées à un support par couplage magnétique à l'aide d'un vecteur de fixation, comporte les étapes suivantes :
A) couplage magnétique d'un vecteur de fixation en des coordonnées connues d'un support,
B) liaison des sondes sur les vecteurs de fixation.
Dans le procédé décrit ci-dessus, l'étape de couplage du vecteur de fixation au support peut être effectuée en utilisant un masque.
Ce masque, percé de fenêtres régulièrement espacées, est préférentiellement opaque au champ magnétique, si bien que les vecteurs de fixation se fixeront uniquement au niveau desdites fenêtres. Alternativement, le masque peut être perméable au champ magnétique. Dans ce cas, les vecteurs de fixation se fixeront dans un premier temps sur toute la surface du support, couverte ou non par le masque. Dans un deuxième temps, le masque sera soigneusement retiré, de façon à retirer les vecteurs de fixation qui n'étaient pas directement en contact avec le support.
Un procédé alternatif de fabrication d'un réseau organisé de sondes biologiques ou chimiques, liées à un support par couplage magnétique à l'aide d'un vecteur de fixation, est décrit à l'exemple 3, et comporte les étapes suivantes :
A) liaison des sondes au vecteur de fixation,
B) dépôt des sondes couplées au vecteur de fixation sur une lame non aimantée, selon un réseau organisé
C) transfert du réseau de l'étape B sur un support magnétique.
Dans tous les procédés de l'invention décrits ci-dessus, le dépôt des vecteurs de fixation, couplés ou non aux sondes, sur le support, magnétique
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ou non, est réalisé par n'importe quel moyen que l'homme du métier peut imaginer. Il peut être effectué par exemple à l'aide de pipettes, micropipettes, pipettes piezo-électriques, buses, aiguilles, ou de petits électroaimants dont le coeur en fer doux serait constitué d'une aiguille d'un diamètre inférieur à 200 J. m à l'extrémité.
Un procédé particulier de l'invention, décrit à l'exemple 4, permet la fabrication d'un réseau organisé de sondes constituées de molécules d'acide nucléique simple brin dont la taille peut être comprise entre 20 et 5000 nucléotides, mais de préférence entre 100 et 500 nucléotides. Ce procédé comporte les étapes suivantes :
A) amplification des sondes à partir d'amorces nucléotidiques dont l'une au moins est biotinylée,
B) dénaturation des sondes par chauffage suivi d'un refroidissement rapide,
C) couplage des sondes biotinylées sur des billes paramagnétiques, superparamagnétiques ou ferromagnétiques liées à de l'avidine ou de la streptavidine,
D) précipitation magnétique des sondes liées aux billes,
E) élimination des sondes non liées par lavage,
F) resuspension des sondes couplées aux billes à une concentration choisie,
G) dépôt des sondes couplées aux billes sur un support.
Dans une mise en oeuvre préférée des procédés décrits ci-dessus, l'étape de liaison de la sonde au vecteur de fixation est réalisée à une concentration de sondes saturante pour le vecteur de fixation. Ceci permet notamment de connaître le nombre de sondes liées en moyenne à chaque vecteur de fixation, de façon aisément reproductible.
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L'invention porte également sur un support capable de présenter un magnétisme structuré, permanent ou électro-induit, pour la fabrication d'un réseau de sondes biologiques ou chimiques tels que ceux décrits ci-dessus.
Un réseau organisé de vecteurs de fixation couplés à un support par une interaction magnétique entre le support et les vecteurs de fixation fait aussi partie de la présente invention.
Enfin, l'invention porte sur un kit pour la fabrication d'un réseau organisé de sondes biologiques ou chimiques, comprenant un support magnétique et des vecteurs de fixation. Un tel kit est particulièrement intéressant pour permettre à des laboratoires de recherche ou d'analyse de fabriquer eux-mêmes, à moindre frais, des réseaux de sondes particulièrement adaptés à leurs besoins. Par exemple, ce kit peut permettre à un laboratoire d'élaborer une puce à ADN à façon , éventuellement en mettant en oeuvre) le dernier procédé mentionné ci-dessus.
De manière préférée mais non limitative, le support magnétique présent dans un kit de l'invention est optiquement neutre et comporte un aimant permanent. Le cas échéant, ce support présente un magnétisme structuré.
Dans une version particulière des kits de l'invention, les vecteurs de fixation sont déjà fixés au support, suivant un réseau organisé.
Les vecteurs de fixation présents dans les kits selon l'invention sont par exemple des billes paramagnétiques, superparamagnétiques, ou ferromagnétiques.
Dans une réalisation avantageuse des kits de l'invention, le vecteur de fixation est fonctionnalisé, c'est-à-dire qu'il porte des éléments capables de se lier spécifiquement à une cible biologique.
Les kits de l'invention peuvent être destinés à plusieurs types d'utilisation, ou être destinés à être utilisés avec un type donné de sondes. Par exemple, un
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kit comportant comme vecteurs de fixation des billes portant des oligonucléotides comportant une extrémité poly-T ou poly-U sera plus spécifiquement employé pour fabriquer des puces d'ARN messager ou d'ADNc sur lesquels on greffe une queue poly A. En revanche, un kit dans lequel le vecteur de fixation est couplé à de la streptavidine ou à de l'avidine peut être utilisé pour n'importe quel type de sonde qu'il est possible de biotinyler.
Les kits de l'invention peuvent comporter en outre une ou plusieurs sonde (s) de contrôle, éventuellement liées au vecteur de fixation. Il peut s'agir par exemple d'une sonde d'ADN simple brin codant un fragment de la ss-actine, si le kit est destiné à fabriquer des puces pour analyser l'expression de gènes dans des cellules eucaryotes. Un kit peut aussi comprendre d'une part, la sonde contrôle libre, et d'autre part, la sonde contrôle déjà fixée sur le vecteur de fixation, ce qui permettra à l'utilisateur de contrôler l'étape de couplage des sondes sur les vecteurs de fixation. Les kits peuvent aussi comprendre des vecteurs de fixation couplés à des sondes marquées, destinés à calibrer le dépôt des vecteurs de fixation sur le support. Ces exemples ne sont pas limitatifs, et l'homme du métier est apte à imaginer tout type de kit comprenant des éléments supplémentaires destinés à faciliter son utilisation, à permettre une interprétation plus précise des résultats, ou à cibler un type particulier d'application.
Les exemples et figures ci-après, illustrent la mise en oeuvre et l'intérêt de la présente invention, sans toutefois en limiter la portée.
Légende des figures : Fig. 1 : Fixation de la sonde à la particule aimantée Fig. 2 : Réalisation d'une magnéto-puce Fig. 3 : Réalisation d'un réseau de billes fonctionnalisées
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A) par dépôts successifs
B) par dépôt en une étape en utilisant un cache imperméable au champ magnétique.
Fig. 4 : Réseau de billes magnétiques organisé Fig. 5 : Dépôt des sondes sur un réseau préalablement magnétiquement organisé Exemple 1 : Procédé de fabrication d'une magnéto-puce par dépôt en une étape Les sondes sont fixées à des particules aimantées, par exemple des billes magnétiques multipolaires. La fixation à la bille se fait, soit par une liaison covalente, ou toute autre liaison chimique, par exemple l'établissement d'une base SCHIFF, soit par une liaison non covalente, comme par exemple les liaisons streptavidine/biotine ou anticorps/antigène (figure 1).
L'ensemble vecteur de fixation/sondes est ensuite déposé à la densité souhaitée sur une petite surface de quelques Jlm2 du support aimanté. On obtient ainsi aux coordonnées déterminées du support, un point de sondes identiques à la densité souhaitée. L'opération est réalisée autant de fois que nécessaire pour obtenir un micro réseau de points de sondes différents. On notera que plusieurs points peuvent être réalisés simultanément (figure 2).
Exemple Il : Procédé de fabrication d'une magnéto-puce par dépôt en deux étapes Une alternative au protocole décrit à l'exemple 1 est possible en utilisant une liaison non covalente entre les vecteurs de fixation et les sondes. En effet, dans ce dernier cas, il est possible de dissocier le dépôt des billes fonctionnalisées et des sondes sur la surface magnétique. Ainsi, à titre
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d'exemple, les billes fonctionnalisées par la streptavidine sont d'abord déposées sur le support magnétique de façon à créer un réseau régulier de billes magnétiques où chaque point est constitué d'une densité de billes bien définie. Le réseau peut être créé de deux manières, soit par dépôts successifs comme précédemment (figure 3A), soit en une seule opération en utilisant un masque (figure 3B).
Le réseau de billes magnétiques sera réalisé en utilisant un masque isolant pour le champs magnétique ne laissant démasquées que les surfaces de la lame aimantée destinées à recevoir les billes, le reste de la surface de la lame aimantée étant masqué (cf. fig. 3B). Donc, seules les parties libres de l'aimant pourront immobiliser les billes magnétiques. Le masque de dépôt des billes pourra être une lame de silice structurée par traitement chimique ou un film plastique architecturé au laser.
Si le support présente un magnétisme structuré, par exemple s'il s'agit d'une lame de silice dans laquelle sont incrustés des micro-aimants, le réseau de vecteurs de fixation peut être réalisé en une seule opération sans nécessité d'utiliser un masque.
On obtient ainsi en un seul dépôt un réseau de billes magnétiques organisé (figure 4).
Dans une deuxième étape, on déposera sur chaque point de billes magnétiques les sondes spécifiques couplées à la biotine en concentration saturante pour la streptavidine (figure 5). La même stratégie peut être suivie pour toutes les liaisons vecteur de fixation/sonde faisant intervenir une liaison non covalente.
Après le dépôt, les sondes non fixées sont éliminées par ajout de streptavidine libre et lavage.
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On obtient ainsi un micro réseau de points, eux-mêmes constitués de sondes spécifiques à la densité souhaitée et fixés durablement sur le support à des coordonnées déterminées.
Exemple lit : Procédé de fabrication d'une magnéto-puce par réplique Une dernière variante consiste à réaliser le dépôt des sondes liées au vecteur de fixation sur une lame de verre puis à transférer les couples constitués par les billes magnétiques et les sondes qui leur sont fixées à une lame aimantée.
Le transfert peut se faire simplement par rapprochement de la lame aimantée au-dessus de la lame de verre, le couple bille aimantée/sonde sautant spontanément à des coordonnées équivalentes, de la lame de verre à la lame aimantée.
Exemple IV : Préparation et utilisation d'une magnéto-puce de sondes d'ADN simple brin . Préparation des lames Dans une première étape de fabrication, l'attraction magnétique est fournie par des lames aimantées de 35 x 25 mm pour une épaisseur de 1 mm.
Deux types de composition pour les lames sont expérimentés, d'une part des lames composées de néodyme fer bore, qui peuvent fournir une aimantation maximale de 1,3 T, d'autre part des lames aimantées de samarium cobalt qui peuvent fournir une aimantation maximale de 1 T.
Pour chaque type de lames, deux orientations de champs d'aimantation seront expérimentées : d'une part, un champ perpendiculaire à la plus grande surface de la lame, et d'autre part, une aimantation parallèle à la plus
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grande surface de la lame. Pour chaque champ, quatre forces différentes seront utilisées : 0.2, 0.5 et 1 ou 1.3 T.
. Le vecteur de fixation Dans une première expérience, les vecteurs de fixation utilisés sont des billes (Dynabeads) d'un diamètre de 2,8 m, constituées de polymère, incluant des oxydes de fer (Fe203 10-14%) d'une susceptibilité de 8. 10-3 cgs par unité. Les particules d'oxyde fournissent la réactivité au champ magnétique. Ces billes sont recouvertes de manière covalente de molécules de streptavidine capables de fixer la biotine. La densité des récepteurs streptavidine est de 7. 105 à 106 en moyenne par bille.
. Le dépôt des spots ou unité d'hybridation Le dépôt du couple vecteur (bille) 1 sonde (molécule d'ADNc simple brin) est effectué dans un premier temps à l'aide d'une plume de 0,2 mm à l'extrémité.
La concentration de billes choisies pour chaque dépôt sera telle qu'un dépôt représentera 6000 billes environ, ce qui correspondra à 6. 109 molécules sondes par unité d'hybridation, si tous les sites streptavidine sont saturés.
Dans ces conditions, on obtient un dépôt mono-couche de billes (chaque bille repose directement sur la lame). w Préparation des sondes A partir de couples d'amorces biotinylées en 5', soit sur l'amorce directe, soit sur l'amorce reverse, soit sur les deux amorces, on effectue l'amplification par PCR de la région spécifique du gène à étudier. On obtient ainsi pour chaque PCR une séquence double brin. Cette séquence est biotinylée respectivement en 5'du brin codant, 5'du brin reverse ou biotinylée en 5'sur les deux brins selon la construction choisie. Dans chaque cas, les doubles brins sont dénaturés par trempage, puis couplés à des billes magnétiques fonctionnalisées avec la streptavidine. Le nombre de billes magnétiques
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ajoutées est calculé de sorte que les sites streptavidine soient saturés par la biotine des ADN. Ainsi, toutes les billes auront fixé n molécules d'ADN simple brin, où n représente le nombre de sites streptavidine par bille. Le couple bille/ADN simple brin est précipité dans un champ magnétique puis lavé pour éliminer l'ADN non fixé à la biotine (dans le cas où seule l'une des amorces était biotinylée, on ne retient qu'un des deux brins de la double hélice d'ADN). Le couple bille magnétique (vecteur) /ADN simple brin (sonde) est resuspendu à la concentration souhaitée pour obtenir une concentration finale souhaitée en ADN ; dans ce cas, on obtient directement la molarité des ADN qui dépend de la concentration en billes. w Préparation du réseau L'ensemble vecteur de fixation (bille magnétique)/sondes (ADN simple brin) est déposé à l'aide d'une plume ou d'une pipette pietzo électrique à la densité souhaitée sur une petite surface de 100 à 300 ! lm de côté. On obtient ainsi aux coordonnées déterminées du support, une unité d'hybridation de sondes identiques à la densité souhaitée. L'opération est réalisée autant de fois que nécessaire pour obtenir un micro réseau de points de sondes différentes. On notera que plusieurs points peuvent être réalisés simultanément.
. L'hybridation La lame ainsi réalisée est alors directement hybridée avec un mélange d'ADNc marqués en fluorescence. Ces ADNc sont obtenus par RT-PCR (en présence de cy3 par exemple, comme marqueur fluorescent) des ARNm extraits des cellules étudiées. Il est également possible de réaliser une cohybridation à partir de deux extraits d'ARN qui fourniront des ADNc marqués respectivement en cy3 et cy5.
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Après lavage de la lame pour éliminer les molécules d'ADNc non hybridées, la quantification de la fluorescence au niveau de chaque point indiquera le taux d'hybridation, donc la proportion de chaque type de molécules.
Le marquage n'est pas limitatif ; les mêmes expériences peuvent être réalisées avec des ADNc en radioactivité.
Exemple V : Magnéto-puce de sondes d'ADN simple brin ciblant les gènes GADPH et HPRT.
Un exemple de magnéto-puce a été réalisé en utilisant comme sondes les séquences suivantes obtenues par amplification spécifique (PCR). Pour chaque séquence les trois constructions décrites précédemment sont réalisées : * séquence 5'biotinylé sur le brin codant, 'séquence 5'biotinylé sur le brin anti sens 'séquence 5'biotinylé sur les deux brins.
Les séquences soulignées correspondent aux amorces spécifiques utilisées pour amplifier les sondes.
Sondes choisies pour le gène GAPDH.
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CTGGTGTCTTCACCACCATGGAGAAGGCCGGGGCCCACTTGAAGGGTG GAGCCAAACGGGTCATCATCTCCGCCCCTTCTGCCGATGCCCCCATGT TTGTGATGGGTGTGAACCACGAGAAATATGACAACTCACTCAAGATTGT CAGCAATGCATCCTGCACCACCAACTGCTTAGCCCCCCTGGCCAAGGT CATCCATGACAACTTTGGCATTGTGGAAGGGCTCATGACCACAGTCCAT GCCATCACTGCCACCCAGAAGACTGTGGATGGCCCCTCTGGAAAGCTG TGGCGTGATGGCCGTGGGGCTGCCCAGAACATCATCCCTGCATCCACT
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GGTGCTGCCAAGGCTGTGGGCAAGGTCATCCCAGAGCTGAACGGGAA GCTCACTGGCATGGCCTTCCGTGTTCCTACCCCCAATGTGTCCGTCGTG GATCTGACGTGCCGCCTGGAGAAACCTGCCAAGTATGATGACATCAAG AAGGTGGTGA TTCACCACCATGGAGAAGGCCGGGGCCCACTTGAAGGGTGGAGCCAAA CGGGTCATCATCTCCGCCCCTTCTGCCGATGCCCCCATGTTTGTGATGG GTGTGAACCACGAGAAATATGACAACTCACTCAAGATTGTCAGCAATGC ATCCTGCACCACCAACTGCTTAGCCCCCCTGGCCAAGGTCATCCATGAC AACTTTGGCATTGTGGAAGGGCTCATGACCACAGTCCATGCC Sondes choisies pour le gène HPRT GCTGGTGAAAAGGACCTCTCGAAGTGTTGGATACAGGCCAGACTTTGTT GGATTTGAAATTCCAGACAAGTTTGTTGTTGGATATGCCCTTGACTATAA TGAGTACTTCAGGAATTTGAATCACGTTTGTGTCATTAGTGAAACTGGAA AAGCCAAATACAAAGCCTAAGATGAGCGCAAGTTGAATCTGCAAATACG AGGAGTCCTGTTGATGTTGCCAGTAAAATTAGCAGGTGTTCTAGTCCTG TG AGGAGATGGGAGGCCATCACATTGTGGCCCTCTGTGTGCTCAAGGGGG GCTATAAGTTCTTTGCTGACCTGCTGGATTACATTAAAGCACTGAATAGA AATAGTGATAGATCCATTCCTATGACTGTAGATTTTATCAGACTGAAGAG CTACTGTAATGATCAGTCAACGGGGGACATAAAAGTTATTGGTGGAGAT GATCTCTCAACTTTAACTGGAAAGAATGTCTTGATTGTTGAAGATATAAT TGACACTGGTAAAACAATGCAAACTTTGCTTTCCCTGGTTAAGCAGTACA GCCCCAAAATGGTTAAGGTTGCAAGCTTGCTGGTGAAAAGGACCTCTCG AAGTGTTGGATACAGGCCAGACTTTGTTGGATTTGAAATTCCAGACAAG
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TTTGTTGTTGGATATGCCCTTGACTATAATGAGTACTTCAGGAATTTGAA TCACGTTTGTGTCATTAGTGAAACTGGAAAAGCCAAATACAAAGCC

Claims (29)

  1. REVENDICATIONS 1. Réseau organisé de sondes biologiques ou chimiques, liées à un support par couplage magnétique à l'aide d'un vecteur de fixation.
  2. 2. Réseau selon la revendication 1, fixé sur un support optiquement neutre.
  3. 3. Réseau selon la revendication 1 ou 2, fixé sur un support comportant un aimant permanent.
  4. 4. Réseau selon la revendication 1 et 2, fixé sur un support présentant un magnétisme électro-induit.
  5. 5. Réseau selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, fixé sur un support présentant un magnétisme structuré.
  6. 6. Réseau selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel le champ magnétique est perpendiculaire ou parallèle au plan du support.
  7. 7. Réseau selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans lequel le vecteur de fixation est paramagnétique, superparamagnétique ou ferromagnétique.
  8. 8. Réseau selon la revendication 7, dans lequel le vecteur de fixation est une bille de latex ou de polysaccharides comportant des particules d'oxyde de fer.
  9. 9. Réseau selon la revendication 7 ou 8, dans lequel le vecteur de fixation est une bille multipolaire.
  10. 10. Réseau selon la revendication 7 ou 8, dans lequel le vecteur de fixation est capable de s'orienter dans un champ magnétique.
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  11. 11. Réseau selon la revendication 10, dans lequel le vecteur de fixation est lui-même aimanté.
  12. 12. Réseau selon l'une quelconque des revendications 7 à 11, dans lequel le vecteur de fixation a un diamètre compris entre 1 nm et 500 lit, préférentiellement entre 0,5 et 5 m.
  13. 13. Réseau selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, dans lequel le vecteur de fixation porte des éléments capables de se lier spécifiquement à une cible biologique.
  14. 14. Réseau selon la revendication 13, dans lequel les éléments capables de se lier spécifiquement à une cible biologique portés par le vecteur de fixation sont sélectionnés dans le groupe comportant les immunoglobulines, les antigènes, les récepteurs membranaires, les ligands de récepteurs membranaires, l'avidine, la streptavidine, les oligonucléotides poly-T ou poly-U.
  15. 15. Réseau selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, dans lequel chaque sonde est déposée en un point dont le diamètre est compris entre 10 pu et 1 mm, préférentiellement entre 50 et 200, um.
  16. 16. Réseau selon l'une quelconque des revendications 1 à 15, dans lequel chaque point comporte entre 105 et 1010 sondes, préférentiellement entre 108 et 101 sondes.
  17. 17. Réseau selon l'une quelconque des revendications 1 à 16, ayant une densité comprise entre 1 et 100000 points par cm2, préférentiellement entre 10 et 1000 points par cm2.
  18. 18. Procédé de fabrication d'un réseau organisé de sondes biologiques ou chimiques, liées à un support par couplage magnétique à l'aide d'un vecteur de fixation, comportant les étapes suivantes :
    <Desc/Clms Page number 30>
    B) dépôt sur un support magnétique, des sondes couplées au vecteur de fixation, selon un réseau organisé.
    A) liaison des sondes au vecteur de fixation,
  19. 19. Procédé de fabrication d'un réseau organisé de sondes biologiques ou chimiques, liées à un support par couplage magnétique à l'aide d'un vecteur de fixation, comportant les étapes suivantes :
    A) couplage magnétique d'un vecteur de fixation en des coordonnées connues d'un support,
    B) liaison des sondes sur les vecteurs de fixation.
  20. 20. Procédé selon la revendication 19, caractérisé en ce que l'étape de couplage du vecteur de fixation au support est effectuée en utilisant un masque.
  21. 21. Procédé de fabrication d'un réseau organisé de sondes biologiques ou chimiques, liées à un support par couplage magnétique à l'aide d'un vecteur de fixation, comportant les étapes suivantes :
    A) liaison des sondes au vecteur de fixation,
    B) dépôt des sondes couplées au vecteur de fixation sur une lame non aimantée, selon un réseau organisé
    C) transfert du réseau de l'étape B sur un support magnétique.
  22. 22. Procédé selon la revendication 18 ou 21, pour la fabrication d'un réseau organisé de sondes constituées de molécules d'acide nucléique simple brin, comportant les étapes suivantes :
    A) amplification des sondes à partir d'amorces nucléotidiques dont l'une au moins est biotinylée,
    <Desc/Clms Page number 31>
    G) dépôt des sondes sur un support.
    F) resuspension des sondes à une concentration choisie,
    E) élimination des sondes non liées par lavage,
    D) précipitation magnétique des sondes liées aux billes,
    C) couplage des sondes biotinylées sur des billes paramagnétiques, superparamagnétiques ou ferromagnétiques liées à de l'avidine ou de la streptavidine,
    B) dénaturation des sondes par chauffage suivi d'un refroidissement rapide,
  23. 23. Procédé selon l'une quelconque des revendications 18 à 22, dans lequel l'étape de liaison de la sonde au vecteur de fixation est réalisée à une concentration de sondes saturante pour le vecteur de fixation.
  24. 24. Support capable de présenter un magnétisme structuré, permanent ou électro-induit, pour la fabrication d'un réseau de sondes biologiques ou chimiques, suivant un procédé selon l'une quelconque des revendications 18 à 23.
  25. 25. Réseau organisé de vecteurs de fixation couplés à un support par une interaction magnétique entre le support et les vecteurs de fixation.
  26. 26. Produit de couplage formé d'une sonde d'acide nucléique et d'un vecteur de fixation, dans lequel un vecteur de fixation est couplé à un nombre compris entre 103 et 108, préférentiellement entre 105 et 107 molécules d'acide nucléique.
  27. 27. Utilisation d'un produit de couplage formé d'une sonde biologique ou chimique et d'un vecteur de fixation, pour la fabrication d'un réseau organisé de sondes biologiques ou chimiques selon l'une quelconque des revendications 1 à 17.
    <Desc/Clms Page number 32>
  28. 28. Kit pour la fabrication d'un réseau organisé de sondes biologiques ou chimiques, comprenant un support magnétique et des vecteurs de fixation.
  29. 29. Kit selon la revendication 28, dans lequel le vecteur de fixation porte des éléments capables de se lier spécifiquement à une cible biologique.
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