JPWO2003019199A1 - リガンド固定基体 - Google Patents

Abstract

その表面のあらかじめ定められた領域に複数のリガンドが固定化された基体であって、当該基体上の領域の形状が、当該領域におけるリガンドと受容体の結合に起因する信号をその受信器に集中せしめる形状であることを特徴とするリガンド固定基体。

Description

技術分野
本発明は遺伝子工学の分野で有用な、リガンドと受容体の結合を高感度で検出するためのリガンド固定基体及びリガンド固定用の基体に関する。
背景技術
構造と分子の活性との関係は生物学的系の研究における基本的な事項であり、ある種の分子が、他の分子と相互作用して結合することが知られている。このような特異性を有する分子間結合は受容体とリガンドの関係として知られている。
リガンドと受容体の結合親和性を測定するために多くの測定方法（例えば特表平４−５０５７６３号公報参照）が知られている。
近年、リガンドと受容体の結合親和性を測定するために、その表面のあらかじめ定められた領域にリガンドが固定されたリガンド固定基体が使用され、そのリガンド固定基体は高密度化、微細化している。
上記リガンド固定基体の高密度化、微細化の結果、リガンドと受容体の結合親和性を再現性よく、かつ高感度に測定するためのリガンド固定基体の提供が求められている。
発明の目的
本発明の目的は、種々のリガンドとその受容体の結合に関する情報解析を超高感度に再現性よく測定するためのリガンド固定基体、及びリガンド固定用基体を提供することにある。
発明の概要
本発明を概説すれば、本発明の第１の発明は、その表面のあらかじめ定められた領域に複数のリガンドが固定化された基体であって、当該基体上の領域の形状が、当該領域におけるリガンドと受容体の結合に起因する信号をその受信器に集中せしめる形状であることを特徴とするリガンド固定基体に関する。
本発明の第２の発明は、その表面のあらかじめ定められた領域に複数のリガンドを固定化するための基体であって、当該基体上の領域の形状が、当該領域におけるリガンドと受容体の結合に起因する信号をその受信器に集中せしめる形状であることを特徴とするリガンド固定用基体に関する。
発明の詳細な説明
本発明において、領域の形状としては、当該信号を受信器に収束せしめる凹面状の形状が例示され、信号としては蛍光物質、発光物質由来の蛍光、発光等が例示される。当該領域は信号反射性物質でコートされていることが好ましく、信号反射性物質として特に限定はないが、例えば鏡状物質が例示され、鏡状物質としては金属が例示される。当該領域は物理的、化学的に作製することができ、例えばプレスにより形成してもよい。また領域の周辺を盛り上げ信号を受信器に集中せしめることも、当然本発明に包含される。
本発明により、リガンドと受容体の結合に起因する信号、例えば蛍光、発光の集信効率が向上し、リガンドと受容体の結合の検出感度が顕著に向上する。
本発明により、本発明のリガンド固定基体を使用する受容体の検出方法が提供され、本発明の検出方法は、微量受容体の検出において特に有用である。
本発明により提供されるリガンド固定用基体にリガンドを固定化する方法に特に限定はなく、静電的な結合による固定化方法、修飾部位を介した共有結合による固定化方法、また基体上でのリガンド合成による固定化方法等が例示される。
本発明の態様において、リガンドとしては核酸、糖質、ペプチド又は蛋白質が例示される。核酸としてはＤＮＡ、ＲＮＡが例示され、ＤＮＡとしては二本鎖ＤＮＡ又は一本鎖ＤＮＡが例示され、ＲＮＡとしてはｍＲＮＡ、そのフラグメント、合成ＲＮＡが例示され、ＤＮＡとしてはｃＤＮＡ、そのフラグメント、合成ＤＮＡが例示される。また核酸としてはポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドが例示される。
すなわち、本発明においてリガンドとは、特定の受容体により認識、結合される分子であれば特に限定はなく、例えば核酸、糖質、蛋白質、ペプチド等である。
当該リガンドの例には、細胞膜受容体に対するアゴニスト及びアンタゴニスト、毒素（ｔｏｘｉｎ及びｖｅｎｏｍ）、ウイルスエピトープ、ホルモン（例えば、鎮静剤、あへん剤、ステロイド等）、ホルモン受容体、ペプチド、酵素、酵素基質、補因子、薬物、レクチン、糖、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、核酸、オリゴサッカライド、蛋白質、抗体及びモノクローナル抗体が含まれる。
本発明において受容体とは、当該リガンドに結合性を示すものであれば特に限定はなく、天然分子でも人工分子でも良い。例えば核酸、糖質、蛋白質、ペプチド、例えば酵素、細胞表面蛋白質（レセプター）、糖蛋白質、抗体等である。また、受容体としてはそれぞれ核酸、糖質、ペプチド又は蛋白質に結合性を有する核酸、糖質、ペプチド又は蛋白質が例示される。当該受容体としては蛍光物質や発光物質で標識された受容体を使用することができる。
すなわち、本発明においてリガンドと当該リガンドに結合性を有する受容体の接触表面特性は相互に相補的である。
当該基体は、リガンドと当該リガンドに結合性を有する受容体の結合を高感度で検出しうるものが好適である。また本発明の基体としては当該基体上のリガンドが固定された領域間の距離が少なくとも１ｍｍ以上である基体、１ｍｍ未満である基体、当該基体の領域の密度が１００個／ｃｍ^２未満である基体、１００個／ｃｍ^２以上である基体、当該基体の領域の密度が１０個／ｃｍ^２未満である基体、１０個／ｃｍ^２以上である基体、該基体上の領域数が１００個以上である基体、当該基体上の領域数が１０００個以上である基体が例示される。
本発明より、その表面のあらかじめ定められた領域に複数のリガンドが固定化された基体であって、当該気体状の領域の形状が、当該領域におけるリガンドと受容体の結合に起因する信号をその受信器に集中せしめる形状である方形状基体、テープ状基体、円盤状基体等が提供される。
本発明において方形状基体とは、四角形の形状を示す基体であり、正方形、長方形、台形等任意の形状とすることができる。方形状基体の材質としてはリガンドをその表面上のあらかじめ定められた領域に固定化できるものであれば良い。
本発明においてテープ状基体とは、幅がせまく長い、帯状の基体であって、基体の材質としてはリガンドをその表面上のあらかじめ定められた領域に固定化できるものであれば良い。また、本発明において円盤状基体とは、円盤状の基体であって、該基体の材質としてはリガンドをその表面上のあらかじめ定められた領域に固定化できるものであれば良い。
本発明において基体の材質は目的に応じ、任意に選択すればよく、多孔質、非多孔質等の材質から選択することができる。
特に限定はされないが例えば、方形状基体の材質としては、非多孔性又は多孔性の材質で、その表面にリガンドを固定化した複数の領域が物理的に分離されて配置されているのが望ましい。さらに、例えば非多孔性で、表面が滑らかな構造を有する材質が使用でき、特に限定はないが、例えばスライドガラス等のガラスが好適に使用できる。基体の表面は、リガンドを共有結合または非共有結合により固定化できるものが使用できる。また基体の表面でリガンドを合成できるものでもよい。
次にテープ状基体は、軟質又は半軟質性を有する材料であれば良く、当該基体の少なくとも１つの表面は実質的に平らであり、その表面にリガンドを固定化した複数の領域が物理的に分離されて配置されているのが望ましい。また、円盤状基体は、硬質、軟質又は半軟質性を有するいずれの材料でも好適に使用でき、当該基体の少なくとも１つの表面は実質的に平らであり、その表面にリガンドを固定化した複数の領域が物理的に分離されて配置されているのが望ましい。
方形状、テープ状又は円盤状基体の表面のリガンド固定部位の列は、特に限定は無く、目的に応じて変動させることができる。
例えば方形状基体の１ｃｍ^２あたり１０〜１００００個のリガンドを、例えばテープ状基体の短辺１ｃｍあたり１〜１００個のリガンド、長辺１ｃｍあたり１〜１００個のリガンドをスポットすればよい。また、円盤状基体の場合は、１ｃｍ^２当たり１〜１００００個のリガンドをスポットすればよい。
基体上へのリガンドのスポットは、市販のスポッターを使用するのが簡便である。またリガンドの種類によっては基体上で合成することもできる。
本発明においてリガンドに結合した受容体を検出するために使用される発信物質としては、蛍光物質、発光物質等の発信物質であればよく、特に限定はないが例えば、ＡＭＰＰＤのような化学発光物質、フルオレセイン、カスケードブルー、オレゴングリーン、ＢＯＤＩＰＹ、ローダミングリーン、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ、テキサスレッド、Ｃｙ３あるいはＣｙ５のような蛍光物質が好適に使用することができる。
本発明において使用する基体の材質は、例えばＤＮＡチップやバイオセンサーの基体として使用できるもののうち、固定化するＤＮＡを担体の表面に保持できるものであればよく、例えば、基体の表面に親水性または疎水性の官能基、例えば、水酸基、アミノ基、チオール基、アルデヒド基、カルボキシル基、アシル基等を有しているものが好適に利用できる。また、上記基体には、該官能基が基体の素材の特性として、すでにその表面上に存在しているものも包含される。さらに、上記基体は、担体の表面に親水性または疎水性の官能基がなくても、表面処理を行うことにより基体の表面に親水性または疎水性の官能基を付与することができるものであれば特に限定されない。
このような表面処理物としては、例えば、基体表面をアミノアルキルシラン等の市販のシランカップリング剤で処理したものや、ポリリジンやポリエチレンイミン等のポリ陽イオンで処理したもの、さらにアミノアルキルシランおよびグルタールアルデヒドで処理したもの等が挙げられる。
また、本発明に使用する基体の材質は、リガンドが効率よく固定できれば、電気的に陰性、中性、陽性のいずれもが好適に使用できる。また、該基体としてはリガンド固定部と、当該固定部を支持する部の２重構造になっていても良く、リガンドの固定化効率と基体の強度の点から選択すれば良い。
また予め作製したリガンド固定部を、当該固定部を支持する部に張り合わせて使用しても良い。
さらに、本発明において使用する基体において、検出器において検出する際、シグナルに対するバックグラウンドが十分抑えられる素材であれば特に限定はなく、いずれもが好適に使用できる。
いずれにしても基体上のリガンド固定領域が、リガンドと受容体の結合に起因する信号を受信器に集中せしめるように成形されておればよい。
当該領域は金属材質を用いたミクロプレス法で成形してもよく、ガラス性基体と金属材質を組み合わせた鏡状材質で成形してもよい。本明細書においてプレスには、ミクロプレス法、射出成形法等の成形方法が含まれる。該領域は信号を受信器に収束させうる凹面状の形状が好適であり、その直径は特に限定はされないが例えば、２０〜２０００μｍ、好ましくは５０〜５００μｍ、より好適には１００〜２００μｍである。
本発明において、受信器が設置されたリガンドと受容体の結合の検出器は基体を検出器に対して一次元的もしくは二次元的に移動させる形式でも、検出器を基体上に一次元的もしくは二次元的に移動させる形式でも良い。さらに、検出器及び基体の両者の移動を組み合わせて移動させる形式であってもよい。
また、複数のリガンドを含んでなる発明の基体に、当該リガンドとの結合性を調べようとする少なくとも１つの受容体、例えば標識受容体を曝露し、当該基体上の前記標識の場所を検出することにより、リガンドとその受容体との結合を測定することができる。受容体の曝露は基体全体に行っても良く、またその一部から順次行ってもよい。
また、リガンドとその受容体との結合を測定する場合、その検出は基体全体に行っても良く、またその一部から順次行ってもよい。
本発明のリガンド固定基体を用いることにより、微量の試料を用いても超高感度で、例えば検出感度が数倍〜数オーダー上昇した結果を得ることができる。すなわち、リガンドと受容体の結合を検出することを可能にする超高感度のリガンド固定基体及びリガンド固定用基体が提供される。さらに、高シグナル、低Ｓ／Ｎ比でかつ再現性に優れているリガンド固定基体が提供される。
実施例
以下、実施例を挙げて、本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらの記載に何ら限定されるものではない。
実施例１
（１）基体の作製
ＤＮＡをリガンドとした場合について検討した。すなわち、図１に示すようなリガンド固定基体を作製した。図１（ａ）は本発明のリガンド固定基体の一態様を示す斜視図、図１（ｂ）は本発明のリガンド固定基体の一態様を示す一部拡大図である。図１に示すリガンド固定基体は、支持基体１と表面コート２からなり、支持基体はプラスチック、表面コートは金属からなるようにした。該支持基体はプラスチックの射出成型で作製し、その表面に直径２００μｍ、深さ５０〜２００μｍの凹面を、中心距離３００μｍ間隔で形成させた。さらにその表面は、金属にてコーティング処理を施した。
（２）リガンドの固定化
内分泌かく乱物質の影響を受ける遺伝子を固定化用リガンドとして用いた。すなわち、内分泌かく乱物質の影響を受ける可能性のある遺伝子群から３３種類の遺伝子を選択した。その遺伝子を表１に示す。

上記表１から選択した遺伝子について該遺伝子あるいはそのＤＮＡ断片を、以下のように調製した。まず、ジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）から特定のアクセッション番号（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．）のもとに登録されている固定したい遺伝子あるいは遺伝子産物の遺伝子の塩基配列情報を得、これに基いてオリゴ プライマー アナリシス ソフトウエア（ＯＬＩＧＯ^ＴＭ Ｐｒｉｍｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、宝酒造社製）を使用して、本発明の方法に最適な約１００ｂ〜約１ｋｂのＤＮＡ断片を得られるように該ソフトのパラメータを設定し、ＰＣＲ増幅用プライマー対を構築した。次に、得られたプライマーの塩基配列をもとにＤＮＡ合成機を用いて合成した。なお、ｃａｔｈｅｐｓｉｎ Ｇ、ＮＧＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＣＳＦ１ ｒｅｃｅｐｔｏｒの各遺伝子については、Ｈｕｍａｎ ＵｎｉＧｅｎｅ ＤＮＡ（リサーチジェネティックス社製）セット中の該遺伝子用プライマーを用いた。なお、当該プライマーは、その５’末端がメルカプトヘキシル基を有するように修飾を施した。
上記プライマー対を用いて、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡライブラリーあるいは、ｃＤＮＡライブラリーを鋳型とし、市販のＰＣＲキットに添付されている標準プロトコール条件に従い、目的のＰＣＲ増幅断片を得た。得られた該ＤＮＡ断片は、ＳＵＰＲＥＣ−０２（宝酒造社製）を用いて精製した。増幅したｃＤＮＡの塩基配列分析を行って、目的の断片であることを確認するとともに、エタノール沈殿法により増幅断片を回収し、１００ｍＭ 炭酸バッファー（ｐＨ９．５）で１μＭとなるように溶解した。この他、ポジティブコントロールとしてハウスキーピング遺伝子のβ−アクチン遺伝子を上記の方法と同様に作製した。また、ネガティブコントロールとしてプラスミドｐＢＲ３２２ＤＮＡを用いた。
上記の精製ＤＮＡ断片の一部を５０ｍＭ 炭酸バッファー（ｐＨ９．５）に溶解後、２６０ｎｍの吸光度を測定することにより濃度を測定し、０．１〜０．５ｍｇ／ｍｌの範囲で５段階に希釈したものをそれぞれ調製した。このＤＮＡ溶液をＧＭＳ４１７アレイヤー（ジェネティック マイクロシステムズ、ＧＭＳ社製）を用いて、上記（１）で作製したリガンド固定化用基体の各凹面の中心部分に上記方法で作製した５’末端にメルカプトヘキシル基を有するＤＮＡ溶液をスポットした。即ち、３５種類のＤＮＡ断片を５段階希釈した群（３５×５＝１７５スポット）をスポットした。上記のＤＮＡ断片をスポットした基体は、室温で２時間放置した後、超純水で洗浄後、乾燥させた。このようにして本発明のＤＮＡアレイを調製した。
（３）ハイブリダイズ用標的核酸の調製
１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＤＭＥ培地で生育させたヒト乳がん細胞ＭＣＦ−７をトリプシン処理した後、直径１０ｃｍのデッシュに、デッシュ当り２×１０^６の細胞を入れ、活性炭−デキストラン処理でステロイドホルモン類を除去したウシ胎児血清を５％含むＤＭＥ培地で２４時間培養した。培地を除去した後、１０ｎＭのジエチルスチルベストロール（ＤＥＳ）を含む同上培地で２時間培養した。また、対照として、前述の化学物質の非存在下のものも同様に調製した。各処理後の細胞を回収し、トリゾール試薬（ギブコＢＲＬ社製）を用いて全ＲＮＡを調製した。
次に上記（３）で調製した全ＲＮＡのＤＮａｓｅ処理を行った。上記の全ＲＮＡ約１００〜約３００μｇ、１０×ＡＭＶバッファー（ライフサイエンス社製）１０μｌ及び１０ＵのＤＮａｓｅＩ（宝酒造社製）を含む１２μｌの反応液を調製し、３７℃で１０分間インキュベートした後、フェノール／クロロホルム抽出を２回行った後、エタノール沈殿を行った。得られた全ＲＮＡの一部を取って濃度測定を行った。
さらに、上記で調製した全ＲＮＡを用いて逆転写反応を行った。反応液組成を以下に示す。
反応液Ａ：上記全ＲＮＡ約１３０μｇ、１０μｇのオリゴｄＴプライマー（宝酒造社製）及び２０μｌのジエチルピロカーボネート（ＤＥＰＣ、和光純薬社製）処理水。
反応液Ｂ：５×ＡＭＶ ＲＴａｓｅ用緩衝液（ライフサイエンス社製）１２μｌ、各０．５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及び０．２ｍＭのｄＴＴＰ、６０ＵのＲＮａｓｅインヒビター（宝酒造社製）、０．１ｍＭのＣｙ３標識ｄＵＴＰ（アマシャムファルマシア社製）。
反応液Ａを７０℃で１０分間保持した後、氷浴上で冷却した。その後、反応液Ｂを加え、４２℃で５分間保持した。その後、さらにＡＭＶ ＲＴａｓｅ（ライフサイエンス社製）を約６０Ｕ加え、反応液量を６０μｌにした。このＲＴ反応液を４２℃で７０分間保持した。この反応液に５００ｍＭのＥＤＴＡ溶液 ７．５μｌ、１Ｍの水酸化ナトリウム １５μｌを加え、６０℃で１時間保持し、鋳型ＲＮＡを分解させた。室温まで冷却した後、１Ｍのトリス−塩酸（ｐＨ７．５）を３７．５μｌ添加した。この溶液をマイクロコン^ＴＭ−３０（ミリポア社製）で２０μｌまで濃縮し、１ｍＭのＥＤＴＡを含む１０ｍＭのトリス−塩酸を２００μｌ加えた後、再度２０μｌまで濃縮した。このＣｙ３−標識ｃＤＮＡ溶液を以降のハイブリダイズに使用した。
（４）ハイブリダイゼーション
上記（２）で作製したリガンド固定基体を２×ＳＳＣで１分間浸透させた後、４×ＳＳＣ、０．２％ ＳＤＳ及び１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡを含む溶液中で４０℃、１時間、プレハイブリダイゼーションを行った。次に、（３）で調製したＣｙ−３標識したターゲットＤＮＡを熱変性した後、約１０μｇ／ｍｌになるように、４×ＳＳＣ、０．２％ ＳＤＳ及び１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡを含むハイブリダイゼーション溶液に懸濁し、該ハイブリダイゼーション溶液中で、ＤＮＡアレイを４０℃、一晩インキュベーションした。ハイブリダイゼーションの後、２×ＳＳＣ及び０．１％ ＳＤＳを含む溶液で室温、５分間の洗浄操作を２回行った。さらに、０．１×ＳＳＣ及び０．１％ ＳＤＳを含む溶液で、６８℃、１５分間の洗浄工程を２回行った。
（５）検出
上記処理後、当該マイクロアレイを本発明の蛍光スキャナーにより解析した。その模式図を図２に示す。すなわち、図２は、該リガンド固定基体上でハイブリダイズした蛍光プローブを検出する蛍光検出装置の一例であり、３はレンズであり、４は照射レーザー、５はレーザー光源、６は光学フィルター、７はレンズ、８は検出器である。
さらに、リガンド固定基体上での蛍光物質から発した蛍光が集光せしめられる原理を図３及び図４に模式的に示す。図３及び図４中、９はリガンド固定基板上の蛍光物質であり、蛍光は蛍光物質から全方向に発せられるが、本発明におけるリガンド固定基体を用いることにより、蛍光物質からレンズ３方向以外に発せられた蛍光は、リガンド固定基板の凹面にてレンズ３に集光するように反射する。
蛍光スキャンニングの結果、従来の方法で作製されたＤＮＡマイクロアレイに比較して本発明のリガンド固定基体の方がシグナル強度が向上することが確認できた。
産業上の利用の可能性
本発明のリガンド固定基体は、その表面のあらかじめ定められた領域に複数のリガンドが固定化された基体であり、当該基体上の領域の形状が、当該領域におけるリガンドと受容体の結合に起因する信号をその受信器に集中せしめる形状である。該基体を用いることにより、微量の試料を用いても超高感度で結果を得ることができる。さらに、該基体を用いることにより、高シグナル、低Ｓ／Ｎ比でかつ再現性に優れている解析結果を得ることが可能である。

【配列表】

【図面の簡単な説明】
図１：本発明のリガンド固定基体の一態様を示す模式図である。
図２：本発明のリガンド固定基体の解析装置の一態様を示す模式図である。
図３：本発明のリガンド固定基体における、リガンドと受容体の結合に起因する信号をその受信器に集中せしめる一態様を示す模式図である。
図４：本発明のリガンド固定基体における、リガンドと受容体の結合に起因する信号をその受信器に集中せしめる一態様を示す模式図である。

Claims (14)

1. その表面のあらかじめ定められた領域に複数のリガンドが固定化された基体であって、当該基体上の領域の形状が、当該領域におけるリガンドと受容体の結合に起因する信号をその受信器に集中せしめる形状であることを特徴とするリガンド固定基体。
2. 領域の形状が、信号を受信器に収束させうる凹面状の形状である請求項１記載のリガンド固定基体。
3. 信号が蛍光又は発光である請求項１記載のリガンド固定基体。
4. 領域が信号反射性物質でコートされている請求項１記載のリガンド固定基体。
5. 信号反射性物質が鏡状物質である請求項４記載のリガンド固定基体。
6. 信号反射性物質が金属である請求項４記載のリガンド固定基体。
7. 領域がプレスにより形成されている請求項１記載のリガンド固定基体。
8. その表面のあらかじめ定められた領域に複数のリガンドを固定化するための基体であって、当該基体上の領域の形状が、当該領域におけるリガンドと受容体の結合に起因する信号をその受信器に集中せしめる形状であることを特徴とするリガンド固定用基体。
9. 領域の形状が、信号を受信器に収束せしめる凹面状の形状である請求項８記載のリガンド固定用基体。
10. 信号が蛍光又は発光である請求項８記載のリガンド固定用基体。
11. 領域が信号反射性物質でコートされている請求項８記載のリガンド固定基体。
12. 信号反射性物質が鏡状物質である請求項１１記載のリガンド固定基体。
13. 信号反射性物質が金属である請求項１１記載のリガンド固定用基体。
14. 領域がプレスにより形成されている請求項８記載のリガンド固定用基体。

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