JP4005557B2 - 糖鎖合成装置 - Google Patents
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Description
技術分野
本発明は、糖鎖の合成，分離処理の自動化を図るための糖鎖合成装置に関する。
背景技術
細胞内における複合糖質は、情報伝達や細胞間の識別、例えば、ウイルス，がん細胞，血液型の認識等の重要な役割を果たしており、糖鎖の機能解明はポストゲノム研究のターゲットの一つに位置付けられている。
しかしながら、オリゴ核酸やペプチド合成法は、すでに確立され自動化されているが、糖鎖合成法は、まだ多くの課題を残している。糖鎖の機能解明に向けて、糖鎖合成法の確立と、効率的な合成装置の実現が望まれており、現在、以下の３つの糖鎖合成の方法が行なわれている。
（１） 化学合成による方法
（２） 遺伝子組換え細胞あるいは微生物による発酵法
（３） 糖転移酵素を用いて合成する方法
前記（１）の方法は、化学結合させるＯＨ基以外のＯＨ基を保護しながら、目的とする糖鎖を順次合成するため、反応ステップが多く複雑になる。前記（２）の方法は、目的の糖鎖を大量に得ることができるが、その後の精製過程が複雑である。
前記（３）の方法は、上記（１），（２）の複雑さを克服する方法として開発されたものであり、例えば、特開平１１−４２０９６号公報に開示されたものである。この（３）の方法では、選択的な糖転移酵素による合成のため、（１）のようなＯＨ基を保護する必要はない。また、副産物も少ないので、合成後の精製過程も容易である。
また近年、遺伝子組換え技術の発達により生理活性蛋白質を容易に調製できるようになった。しかし、大半の生理活性蛋白質は糖蛋白質であり、宿主により結合する糖鎖が異なり、活性が失われたり、著しく低下することがある。
もし、この異なってしまった糖鎖を元の糖鎖に改変できる方法があれば、非常に有用である。また、もともと結合していた糖鎖とは異なる糖鎖に改変することにより、生理機能の強化や生理活性の改変に役立つことが期待される。糖蛋白質糖鎖を改変する方法としては、大きく分けて２つの方法が現在採られている。
（Ａ）宿主の変更、糖転移酵素遺伝子の宿主への導入により改変した宿主を利用した発酵法
（Ｂ）得られた糖蛋白質のエンドあるいはエキゾグリコシターゼと糖転移酵素を利用した発酵法
（Ａ）の方法では、結合する糖鎖は変わるが、必ずしも望むものに変わるとは限らない。特定の糖鎖に改変するためには（Ｂ）の方法が望ましい。エンドグリコシターゼの糖転移反応を利用した方法としては、例えば、特開平５−６４５９４号公報などがある。エキゾグリコシターゼと糖転移酵素を用いる方法としては、例えば、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９１：７１−７３（１９９０）などに開示されている方法がある。
しかしながら、いずれの方法もせいぜい非還元末端の糖残基を改変する程度であり、本格的な糖鎖の改変とはいえない。また、エンドグリコシターゼと糖転移酵素を用いる方法もあり、例えば、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１９：２１１４−２１１８（１９９７）にその方法が開示されている。ここでは、エンドグリコシターゼで加水分解した後、蛋白質上に残ったＮ−アセチルグルコサミン残基の非還元末端に糖転移酵素により糖鎖を伸長させ、シアリルルイスＸ４糖が結合した糖蛋白質へ改変しているが、結合している糖鎖は、糖蛋白質糖鎖の非還元末端部分であり、糖鎖全体を改変するという点では不十分である。
糖鎖合成装置に関しては、特表平５−５００９０５号公報に開示されたものがある。
発明の開示
上記（３）あるいは（Ｂ）の方法を用いる糖鎖の合成を実際の装置を用いて実現する際、現在は、各ステップ毎に、生成物の分離精製を行い、その後、次の反応に進むと云うバッチ方式で行われており、全ての処理を行うためには、必ず人の手を介していた。
上記特表平５−５００９０５号公報に開示されている装置では、糖転移酵素を用いて単糖、オリゴ糖、糖蛋白質などを基質に糖鎖を伸長させることが可能になるが、反応させる糖の順序に応じて、反応カラムおよび分離精製手段を、シリーズに、連続的に連結することが必要になる。即ち、同種の糖を繰り返し反応させる場合であっても、その数だけ反応カラムおよび分離精製手段も必要となり、装置が大掛かりなものになると云う問題がある。また、糖鎖合成を自動的に連続して行う方法が示されていない。さらに、用いる酵素は、糖転移酵素のみであり、糖質加水分解酵素を用いるようにはなっていない。
本発明の目的は、糖鎖の合成を容易に行うことのできる糖鎖合成装置を提供することである。
本発明の特徴的な構成は、糖転移酵素及び／または糖質加水分解酵素を固定化した一つまたは複数の反応カラムと、当該反応カラムの下流側に配置され、前記反応カラムからの溶出液中の反応生成物と未反応および副産物を分離する一つまたは複数の分離手段を備え、更に、これらを選択的に繰り返し循環させるための循環流路を備えたものである。
本発明においては、水溶性ポリマーのプライマーに対して糖を結合、または、解離させるために、プライマーに結合した糖を、目的の反応に必要な反応カラムに対して、容易に送液することが可能となる。したがって、所望の糖鎖の合成を容易に行うことができる。
発明を実施するための最良の形態
〔実施例１〕
図１は、本実施例のシステム構成図である。
糖鎖合成装置は、複数の溶媒を選択し、時間と共にそれら溶媒を混合しながら、かつ、送液溶媒の組成を変えながら送液できる機能（いわゆる低圧グラジエント機能）を有するポンプ１，２、流路を切り替えるためのバルブ３〜８（６台）、反応カラム１８〜２０、分離カラム２１〜２３，反応生成物を検出する検知器９，１０、そして、これらを制御するコントローラ１１により構成されている。
本装置で用いる検知器９には、生成物をモニターするために、例えば、屈折率検知器（ＲＩ），紫外可視分光検知器（ＵＶ），ダイオードアレイ吸光度検知器（ＤＡＤ）が用いられる。検知器１０には、分子構造情報を得るために、ダイオードアレイ吸光度検知器（ＤＡＤ）、質量分析計（ＭＳ）、核磁気共鳴装置（ＮＭＲ）が用いられる。
また、反応カラムは、糖転移酵素（例えば、ガラクトース転移酵素、Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素、Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素、フコース転移酵素、シアル酸転移酵素、マンノース転移酵素等）あるいは糖質加水分解酵素（例えば、マンノシダーゼ、ガラクトシダーゼ、フコシダーゼ、シアリダーゼ、キシロシダーゼなど）を固定化したものである。糖転移酵素を固定化したカラムを用いれば、糖鎖に新たな糖を結合させて伸長させることができ、糖質加水分解酵素を固定化したカラムを用いれば、糖鎖から所定の糖を解離させる（切り離す）ことが可能になる。本実施例では、反応カラムＲｎと称す。
また、反応生成物とは、水溶性ポリマーのプライマー（例えば、蛋白質、糖蛋白質、糖ペプチド、脂質、糖脂質、オリゴ糖、多糖などの生体高分子や、特開平１１−４２０９６号公報や特開２００１−２２０３９９号公報に記載されているポリアクリルアミド誘導体等の合成高分子であり、分子量１００００以上のものが更に望ましい。本実施例では、以下、プライマー（Ｐ）と呼ぶ）と、糖（Ｓｎ）が化学結合したもの（以下、プライマー（Ｐ−Ｓｎ）と称す。）を云う。
また、分離カラムとしては、反応生成物と糖ヌクレオチド、ヌクレオチド、あるいは加水分解により生じた単糖やオリゴ糖とを分離できる機能を有するものを用いる。例えばゲルろ過クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、透析、限外ろ過などの方法を用いたカラムが挙げられる。
図２は、本実施例の流路図である。
ポンプ１，２は、ボトル１３〜１７内の溶液を送液する。ここで、ボトル１３はプライマー（Ｐ）、ボトル１４はバッファー溶液、そして、ボトル１５〜１７は糖ヌクレオチド溶液（例えば、ウリジン−５’−ジホスホガラクトース，ウリジン−５’−ジホスホ−Ｎ−アセチルグルコサミン，ウリジン−５’−ジホスホ−Ｎ−アセチルガラクトサミン、グアノシン−５’−ジホスホフコース、グアノシン−５’−ジホスホマンノース、シチジン−５’−モノホスホ−Ｎ−アセチルノイラミン酸等。本実施例では、以下、Ｘｎ−Ｓｎと称す。）を入れたボトルである。
各ボトルには、ポンプに内蔵されているソレノイドバルブ１０１〜１０６がそれぞれ割り当てられており、このバルブが開になった溶液がポンプで送液される。また、ボトル１２は分取用ボトル（ＦＣ：フラクションコレクター）、ドレイン（１），ドレイン（２）はドレインボトルである。
図２に基づき本装置の動作を説明する。
ここでは、プライマーＰと糖Ｓ１，Ｓ２，Ｓ３は、Ｐ−Ｓ１−Ｓ２−Ｓ３の順序で結合させるものと仮定する。また、反応カラムは、糖転移酵素を固定化したカラムを用いるものとする。しかし、実際には、糖Ｓ１，Ｓ２，Ｓ３の順序には制限はなく、また、Ｐ−Ｓ１−Ｓ２−Ｓ１−Ｓ３と云ったＳ１の繰り返しも可能である。
但し、Ｐ−Ｓ１−Ｓ１と云うように同じ糖Ｓ１の繰り返しが連続する場合は、ボトル１６か１７を糖ヌクレオチドＸ１−Ｓ１に入ったものに置き換え、さらに反応カラム１９か２０をＲ１に置き換えるか、もう１流路、即ち、反応カラムおよび分離手段（以下分離カラムと呼ぶ）を４列に拡張する。Ｓ２（またはＳ３）の連続繰り返しの場合も同様である。
また、糖の解離を行う場合は、反応カラムに糖質加水分解酵素を固定化したカラムを加える。糖質加水分解酵素を固定化したカラムでの処理については、糖ヌクレオチド溶液は必要としない。
Ｐ−Ｓ１−Ｓ２−Ｓ３の順序で反応させる場合、本装置は基本的には、次の１０ステップからなる。
ステップ１：プライマー（Ｐ）および糖ヌクレオチド（Ｘ１−Ｓ１）の反応カラム１８（Ｒ１）への導入と反応。
ステップ２：プライマー（Ｐ−Ｓ１）と未反応の糖ヌクレオチド（Ｘ１−Ｓ１）及び反応副産物であるヌクレオチド（Ｘ１）を分離カラム２１（Ｃ１）で分離。
ステップ３：プライマー（Ｐ−Ｓ１）と糖ヌクレオチド（Ｘ２−Ｓ２）の反応カラム１９（Ｒ２）への導入。
ステップ４：プライマー（Ｐ−Ｓ１）と糖ヌクレオチド（Ｘ２−Ｓ２）の反応と分離カラム２１（Ｃ１）の洗浄。
ステップ５：プライマー（Ｐ−Ｓ１−Ｓ２）と未反応の糖ヌクレオチド（Ｘ２−Ｓ２）及び反応副産物であるヌクレオチド（Ｘ２）を分離カラム２２（Ｃ２）で分離。
ステップ６：プライマー（Ｐ−Ｓ１−Ｓ２）と糖ヌクレオチド（Ｘ３−Ｓ３）の反応カラム２０（Ｒ３）への導入。
ステップ７：プライマー（Ｐ−Ｓ１−Ｓ２）と糖ヌクレオチド（Ｘ３−Ｓ３）の反応と分離カラム２２（Ｃ２）の洗浄。
ステップ８：プライマー（Ｐ−Ｓ１−Ｓ２−Ｓ３）と未反応の糖ヌクレオチド（Ｘ３−Ｓ３）及び反応副産物であるヌクレオチド（Ｘ２）を分離カラム２３（Ｃ３）で分離。
ステップ９：プライマー（Ｐ−Ｓ１−Ｓ２−Ｓ３）の分取（ＦＣ）。
ステップ１０：分離カラム２３（Ｃ３）の洗浄。
以下、図２に基づき各ステップの詳細を説明する。また、表１に各ステップにおける各バルブの位置について示す。
尚、表１において、バルブ１０１〜１０６は、“開”以外は、全て“閉”である。また、バルブ３〜５（Ｖ）は、接続されるポジション位置を“Ｐ１”〜“Ｐ４”として示し、バルブ６〜８（Ｗ）は、検出器側であるかドレイン側であるかを“検”または“Ｄ”として示している。
＜ステップ１の説明＞
（１） ポンプ１のバルブ１０１，ポンプ２のバルブ１０４を開き、バルブ３，５を、それぞれポジション（２）に接続し、プライマー（Ｐ）と糖ヌクレオチド（Ｘ１−Ｓ１）を反応カラム１８（Ｒ１）に導入する。導入量は、式（１）および（２）で示すように流量と送液時間で決まる。
Ｐの導入量（ｍｌ）＝流量（ｍｌ／ｍｉｎ）×時間（ｍｉｎ）…〔１〕
Ｘ１−Ｓ１の導入量（ｍｌ）＝流量（ｍｌ／ｍｉｎ）×時間（ｍｉｎ）…〔２〕
送液時間を同じとした場合、プライマー（Ｐ）と糖ヌクレオチド（Ｘ１−Ｓ１）の比率は、流量比率で決まる。例えば、５０％／５０％のとき、ポンプ１の流量＝ポンプ２の流量となる。
（２） ポンプ１のバルブ１０２，ポンプ２のバルブ１０３を開き、バッファー１４を同じ流量で流して、プライマー（Ｐ）と糖ヌクレオチド（Ｘ１−Ｓ１）を反応カラム１８（Ｒ１）に導入する。その後、流量を下げ、例えば、流量＝０ｍｌ／ｍｉｎで一定時間反応を継続させる。
＜ステップ２の説明＞
反応終了後、ポンプ流量を上げて、反応カラム１８（Ｒ１）における反応生成物であるプライマー（Ｐ−Ｓ１）と未反応の糖ヌクレオチド（Ｘ１−Ｓ１）および反応副産物のヌクレオチド（Ｘ１、糖ヌクレオチド（Ｘ１−Ｓ１）から糖（Ｓ１）が外れたもの）を分離カラム２１（Ｃ１）に導き、分離する。
分離モードとして、例えば、以下のものが考えられる。
（ａ） ゲルろ過：プライマー（Ｐ−Ｓ１）の分子量がＧＰＣカラムの排除限界を超えているならば、糖ヌクレオチド（Ｘ１−Ｓ１）やヌクレオチド（Ｘ１）より早く溶出する（保持容量が小さい）。
（ｂ） 陰イオン交換：中性であるプライマー（Ｐ−Ｓ１）は保持されないが、陰イオンである糖ヌクレオチド（Ｘ１−Ｓ１）やヌクレオチド（Ｘ１）はカラムに保持されることから溶出が遅れる。
（ｃ） 陽イオン交換：中性であるプライマー（Ｐ−Ｓ１）は保持されないが、陰イオンである糖ヌクレオチド（Ｘ１−Ｓ１）やヌクレオチド（Ｘ１）はイオン排除されることにより、溶出が早まる。
（ｄ） 限外ろ過：分子サイズが小さい未反応糖ヌクレオチドや反応副産物であるヌクレオチドをろ過し、分子サイズが大きいプライマーと分離する。
以下のステップは、分離モード（ｂ）を用いた場合のものである。
＜ステップ３の説明＞
（１）プライマー（Ｐ−Ｓ１）が検知器９で検出されたら、バルブ４を反応カラム１９（Ｒ２）のポジション（３）に切り替えると共に、バルブ７をドレイン側に切り替える。同時に、ポンプ２のバルブ１０５を開き、且つバルブ５を反応カラム１９（Ｒ２）のポジション（３）にして、糖ヌクレオチド（Ｘ２−Ｓ２）を送液する。もし、糖ヌクレオチド（Ｘ２−Ｓ２）の比率が５０％ならば、ポンプ１，２の流量は同じとする（ステップ１と同じ）。
導入は、プライマー（Ｐ−Ｓ１）が検出終了するまで行う。もし、プライマー（Ｐ−Ｓ１）の容積がバンドの拡がりによって、ポンプ１，２の流量×導入時間が反応カラム１９（Ｒ２）の容積を超えてしまう場合は、導入を途中で止め（ポンプ流量＝０）、導入された分を一旦、反応させた後、残り分を再導入する必要がある。
（２）プライマー（Ｐ−Ｓ１）が、反応カラム１９（Ｒ２）に移行し終わったら、バルブ４をドレインポジション（１）に、また、バルブ７を元に戻す。バルブ１０３を開いてポンプ２の送液する溶液をバッファー１４に切り替えてプライマー（Ｐ−Ｓ１）と糖ヌクレオチド（Ｘ２−Ｓ２）を、全て反応カラム１９（Ｒ２）に導入する。その後、流量を下げて、例えば、流量＝０ｍｌ／ｍｉｎで一定時間反応を継続する。このとき、反応カラムへのバッファーの送液は、ポンプ２のみで行う。
＜ステップ４の説明＞
プライマー（Ｐ−Ｓ１）と糖ヌクレオチド（Ｘ２−Ｓ２）が反応カラム１９（Ｒ２）で反応している間に、ポンプ１は、バッファー１４を分離カラム２１（Ｃ１）に流し続け、カラムに保持されている未反応糖ヌクレオチド（Ｘ１−Ｓ１）と反応副産物のヌクレオチド（Ｘ１）をカラムから洗い出す。
＜ステップ５の説明＞
プライマー（Ｐ−Ｓ１）と糖ヌクレオチド（Ｘ２−Ｓ２）の反応終了後、バルブ３をポジション（３）にする。ポンプ１，２によってバッファー１４の流量を上げて、プライマー（Ｐ−Ｓ１−Ｓ２）と未反応の糖ヌクレオチド（Ｘ２−Ｓ２）、および反応副産物のヌクレオチド（Ｘ２）を分離カラム２２（Ｃ２）内で分離する。
＜ステッフ６の説明＞
（１） プライマー（Ｐ−Ｓ１−Ｓ２）が検知器９で検出されたら、バルブ４をポジション（４）に切り替え、同時に、バルブ８をドレインポジション（２）側に切り替える。同時に、バルブ５をポジション（４）にして、糖ヌクレオチド（Ｘ３−Ｓ３）を送液する。もし、糖ヌクレオチド（Ｘ３−Ｓ３）の比率が５０％ならば、ポンプ１，２の流量は同じにする（ステップ１と同じ）。導入は、プライマー（Ｐ−Ｓ１−Ｓ２）が検出終了するまで行う。
（２） プライマー（Ｐ−Ｓ１−Ｓ２）が、反応カラム２０（Ｒ３）に移行し終わったら、バルブ４をドレインポジション（１）に切り替え、バルブ８を元に戻す。ポンプ２をバッファー１４に切り替えて，プライマー（Ｐ−Ｓ１−Ｓ２）と糖ヌクレオチド（Ｘ３−Ｓ３）を、全て反応カラム２０（Ｒ３）に導入した後、バッファーの送液をポンプ２のみで行うとともに、流量を下げて、例えば、流量＝０ｍｌ／ｍｉｎで、一定時間反応を継続させる。
＜ステップ７の説明＞
プライマー（Ｐ−Ｓ１−Ｓ２）と糖ヌクレオチド（Ｘ３−Ｓ３）が反応カラム２０（Ｒ３）で反応している間に、ポンプ１は、バッファー１４を分離カラム２２（Ｃ２）に流し続け、カラムに保持されている未反応糖ヌクレオチド（Ｘ２−Ｓ２）と反応副産物のヌクレオチド（Ｘ２）をカラムから洗い出す。
＜ステップ８の説明＞
プライマー（Ｐ−Ｓ１−Ｓ２）と糖ヌクレオチド（Ｘ３−Ｓ３）の反応終了後、バルブ３をポジション（４）にする。ポンプ１，２によってバッファー１４の流量を上げて、水溶性ポリマー（Ｐ−Ｓ１−Ｓ２−Ｓ３）と未反応の糖ヌクレオチド（Ｘ３−Ｓ３）、および反応生成物ヌクレオチド（Ｘ３）を分離カラム２３（Ｃ３）内で分離する。
＜ステップ９の説明＞
（１） プライマー（Ｐ−Ｓ１−Ｓ２−Ｓ３）が、検知器９で検出されたら、バルブ４を分取ポジジョン（５）に切り替え、糖鎖合成物をボトル１２（ＦＣ）に分取する。
（２） 検知器９で検出されなくなったら、バルブ４をドレインポジション（１）に戻す。
＜ステップ１０の説明＞
ポンプ１，２は、バッファー１４を分離カラム２３（Ｃ３）に流し続け、カラムに保持されている未反応糖ヌクレオチド（Ｘ３−Ｓ３）と反応副産物のヌクレオチド（Ｘ３）をカラムから洗い出す。
以上が、本実施例における糖鎖合成物（Ｐ−Ｓ１−Ｓ２−Ｓ３）を作成するときの手順である。
図３に本実施例の変形例を示す。図３は、検知器１０を追加した場合の流路図である。検出器１０は、スプリッター（Ｓｐ）を介して検出器９の上流に接続され、各分離カラムからの溶出成分の分子構造を得る。この図３の場合でも、糖鎖合成における作成手順は図２の場合と同様に行える。
図３の構成では、反応生成物の分子構造に関する情報を検出する検知器１０を備えたことにより、合成反応が予想通りに行なわれたかどうかを、各反応毎に確認することが可能になる。もし、反応収率が、期待したレベルに到達しない場合は、次の合成反応を中止し、反応試薬と時間の無駄を省くことができると云った効果がある。
尚、本実施例では、各バルブによる流路を切り換えるタイミングとして、検出器９の検出結果を基に切り換える例を示したが、予定された糖の改変処理を行うものであって、予め反応カラムや分離カラムにおける溶出液の通過時間が分かっている場合は、各バルブの切り換えは、検出器９の結果によらずに時間経過によって制御しても良い。
〔実施例２〕
図４は、本実施例のシステム構成図である。
糖鎖合成装置は、ボトル１３〜１７の各溶媒をそれぞれ一定流量で一定時間送液できる機能を有するポンプ１、２、２４〜２７（６台）、流路を切り変えるためのバルブ３〜８（６台）、反応生成物を検出する検知器９，１０（２台）、そして、これらを制御するコントローラ１１により構成されている。本実施例で用いる検知器９，１０は、実施例１と同じものである。
図５は、本装置の流路図である。なお、この流路図は、使用する検出器が１台の場合を示している。６台のポンプ１、２、２４〜２７は、コントローラ１１による制御に従ってボトル１３〜１７の溶液を、一定流量で一定時間それぞれ送液する。実施例１との違いは、糖ヌクレオチド溶液（Ｘ１−Ｓ１，Ｘ２−Ｓ２，Ｘ３−Ｓ３）がそれぞれのポンプ２５，２６，２７で、直接、反応カラム１８〜２０（Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３）に送液されることである。
本実施例では、ポンプ１と２は同じバッファー１４を送液するだけとなり、いわゆる低圧グラジエント機能は不要である。また、ポンプ２５，２６，２７が、糖ヌクレオチド溶液（Ｘ１−Ｓ１，Ｘ２−Ｓ２，Ｘ３−Ｓ３）をそれぞれのソレノイドバルブを介さず、反応カラム１８〜２０に送り込める。このため、ソレノイドバルブの開閉が、ポンプの吸引過程と同期している低圧グラジエント機能と異なり、より正確に、プライマー（Ｐ）と糖ヌクレオチド溶液（Ｘ１−Ｓ１，Ｘ２−Ｓ２，Ｘ３−Ｓ３）を送液する時間を制御することが可能になると云った効果がある。
〔実施例３〕
図６は、本実施例のシステム構成図である。
バッファー（Ｂ１，Ｂ２）１４，３０をそれぞれ一定流量で一定時間送液できる機能を持ったポンプ２台（ポンプ１，２），プライマー（Ｐ）１３を流路に導入するサンプルインジェクター２８，糖ヌクレオチド溶液（Ｘ１−Ｓ１，Ｘ２−Ｓ２，Ｘ３−Ｓ３）１５，１６，１７を流路に導入するサンプルインジェクター２９、流路を切り替えるためのバルブ３〜８（６台）、反応生成物を検出する検知器９，１０（２台）、そして、これらを制御するコントローラ１１により構成されている。本実施例で用いる検知器９，１０は、実施例１と同じものである。
図７は本装置の流路図である。なお、この流路図は、使用する検出器が１台の場合を示している。２台のポンプ１，２は、コントローラ１１による制御に従って、バッファー１４，３０（必ずしもバッファーをポンプごとに備える必要は無く、共通のバッファーを使用することも可能。図７は、その際の例を示す）の溶液を、一定流量で一定時間、それぞれ送液する。実施例１との違いは、プライマー（Ｐ），糖ヌクレオチド溶液（Ｘ１−Ｓ１，Ｘ２−Ｓ２，Ｘ３−Ｓ３）がサンプルインジェクター２８，２９を用いて流路に導入され、反応カラム１８，１９，２０（Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３）に、バッファー１４（或いはバッファー３０）によって送られることである。
本実施例では、ポンプ１，２はバッファー１４，或いはバッファー３０を送液するだけとなり、いわゆる低圧グラジエント機能は不要である。また、プライマー（Ｐ），糖ヌクレオチド溶液（Ｘ１−Ｓ１，Ｘ２−Ｓ２，Ｘ３−Ｓ３）は、必要な量だけサンプルインジェクターを介して、流路に導入される。このため、ソレノイドバルブの開閉が、ポンプの吸引過程と同期している低圧グラジエント機能と異なり、プライマー（Ｐ）と糖ヌクレオチド溶液（Ｘ１−Ｓ１，Ｘ２−Ｓ２，Ｘ３−Ｓ３）の無駄な消費を無くすることができると云う効果がある。
〔実施例４〕
図８は、本実施例のシステム構成図であり、図９は流路図である。なお、この実施例において、使用する検出器は１台の場合でも、２台の場合でも良い。また、予め分析時間が既値である場合は、検出器を使用せずに制御しても良い。
実施例３との違いは、それぞれの反応カラムに直列に接続されていた分離カラムおよびバルブを、一本の分離カラムに集約している点である。また、分離カラムに限外ろ過カラム４０を使用した点である。
分離カラムを共用化したことにより、本実施例では、バルブ６〜８に代えて、バルブ４１が設けられる。
限外ろ過カラム４０の構成を図１０に示す。限外ろ過カラム４０は、内部に円筒状の限外ろ過膜４８を有し、更に、導入口４５から導入された成分の内、膜を通過しないような大きな分子量の成分を排出する排出口４７と、膜を通過した成分を排出する排出口４６の二つの排出口を備えている。限外ろ過膜４８は、例えば、プライマーは通過せず、糖ヌクレオチドやヌクレオチドは通過するようなものを選択する。プライマーの分子量は、約１０、０００以上であり、糖ヌクレオチドやヌクレオチドの分子量は約４００程度である。そのために、大きさにかなりの差があり、容易に分離可能である。
排出口４７の下流には、三方バルブ４２が設けられる。このバルブは、検出器側の流路と、何れかの排出口４６，４７を選択的に連通させるように構成される。連通されない側の排出口はバルブによって流路が遮断されることになる。
この限外ろ過カラム４０での分離は、次のように行う。即ち、反応カラムからの溶出液が導入された当初は、三方バルブ４２を排出口４６側にしておき、限外ろ過膜４８を透過したもののみを排出する。分子量の大きなプライマーとプライマーに結合した糖は、限外ろ過膜４８内に残される。所定時間経過後、三方バルブ４２を排出口４７側に切り換えると、限外ろ過膜４８内に蓄積されたプライマーとプライマーに結合した糖が検出器側に排出される。
本実施例における動作は、実施例１で示した動作と基本的に共通である。分離カラムが共通化されているが、実施例１におけるバルブ６〜８がドレインに切り替わるタイミングで、バルブ４１が点線側の流路に切り換えられることで、分離カラムを共通化しても実施例１と同様の動作を実現することができる。
本実施例においては、分離カラムを共通化したことにより、装置構成を簡易化することができる。また、分離カラムとして限外ろ過カラムを用いることにより、プライマー（Ｐ）は、一旦限外ろ過カラム中に濃縮されることになる。従って、実施例１のステップ３で述べたようなプライマー（Ｐ）のバンドの拡がりという問題が無くなり、次の反応カラムへの導入が容易になると云う効果がある。
以上説明したように、本発明によれば、複雑な糖鎖合成であっても容易に実行することが可能になる。
産業上の利用可能性
本発明を糖鎖合成装置へ適用すれば、糖鎖の合成、或いは分離を容易に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
第１図は、実施例１のシステム構成図である。
第２図は、実施例１の糖鎖合成装置の流路図である。
第３図は、実施例１の変形例である。
第４図は、実施例２のシステム構成図である。
第５図は、実施例２の糖鎖合成装置の流路図である。
第６図は、実施例３のシステム構成図である。
第７図は、実施例３の糖鎖合成装置の流路図である。
第８図は、実施例４のシステム構成図である。
第９図は、実施例４の糖鎖合成装置の流路図である。
第１０図は、限外ろ過カラムの構成例を示す図である。
本発明は、糖鎖の合成，分離処理の自動化を図るための糖鎖合成装置に関する。
背景技術
細胞内における複合糖質は、情報伝達や細胞間の識別、例えば、ウイルス，がん細胞，血液型の認識等の重要な役割を果たしており、糖鎖の機能解明はポストゲノム研究のターゲットの一つに位置付けられている。
しかしながら、オリゴ核酸やペプチド合成法は、すでに確立され自動化されているが、糖鎖合成法は、まだ多くの課題を残している。糖鎖の機能解明に向けて、糖鎖合成法の確立と、効率的な合成装置の実現が望まれており、現在、以下の３つの糖鎖合成の方法が行なわれている。
（１） 化学合成による方法
（２） 遺伝子組換え細胞あるいは微生物による発酵法
（３） 糖転移酵素を用いて合成する方法
前記（１）の方法は、化学結合させるＯＨ基以外のＯＨ基を保護しながら、目的とする糖鎖を順次合成するため、反応ステップが多く複雑になる。前記（２）の方法は、目的の糖鎖を大量に得ることができるが、その後の精製過程が複雑である。
前記（３）の方法は、上記（１），（２）の複雑さを克服する方法として開発されたものであり、例えば、特開平１１−４２０９６号公報に開示されたものである。この（３）の方法では、選択的な糖転移酵素による合成のため、（１）のようなＯＨ基を保護する必要はない。また、副産物も少ないので、合成後の精製過程も容易である。
また近年、遺伝子組換え技術の発達により生理活性蛋白質を容易に調製できるようになった。しかし、大半の生理活性蛋白質は糖蛋白質であり、宿主により結合する糖鎖が異なり、活性が失われたり、著しく低下することがある。
もし、この異なってしまった糖鎖を元の糖鎖に改変できる方法があれば、非常に有用である。また、もともと結合していた糖鎖とは異なる糖鎖に改変することにより、生理機能の強化や生理活性の改変に役立つことが期待される。糖蛋白質糖鎖を改変する方法としては、大きく分けて２つの方法が現在採られている。
（Ａ）宿主の変更、糖転移酵素遺伝子の宿主への導入により改変した宿主を利用した発酵法
（Ｂ）得られた糖蛋白質のエンドあるいはエキゾグリコシターゼと糖転移酵素を利用した発酵法
（Ａ）の方法では、結合する糖鎖は変わるが、必ずしも望むものに変わるとは限らない。特定の糖鎖に改変するためには（Ｂ）の方法が望ましい。エンドグリコシターゼの糖転移反応を利用した方法としては、例えば、特開平５−６４５９４号公報などがある。エキゾグリコシターゼと糖転移酵素を用いる方法としては、例えば、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９１：７１−７３（１９９０）などに開示されている方法がある。
しかしながら、いずれの方法もせいぜい非還元末端の糖残基を改変する程度であり、本格的な糖鎖の改変とはいえない。また、エンドグリコシターゼと糖転移酵素を用いる方法もあり、例えば、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１９：２１１４−２１１８（１９９７）にその方法が開示されている。ここでは、エンドグリコシターゼで加水分解した後、蛋白質上に残ったＮ−アセチルグルコサミン残基の非還元末端に糖転移酵素により糖鎖を伸長させ、シアリルルイスＸ４糖が結合した糖蛋白質へ改変しているが、結合している糖鎖は、糖蛋白質糖鎖の非還元末端部分であり、糖鎖全体を改変するという点では不十分である。
糖鎖合成装置に関しては、特表平５−５００９０５号公報に開示されたものがある。
発明の開示
上記（３）あるいは（Ｂ）の方法を用いる糖鎖の合成を実際の装置を用いて実現する際、現在は、各ステップ毎に、生成物の分離精製を行い、その後、次の反応に進むと云うバッチ方式で行われており、全ての処理を行うためには、必ず人の手を介していた。
上記特表平５−５００９０５号公報に開示されている装置では、糖転移酵素を用いて単糖、オリゴ糖、糖蛋白質などを基質に糖鎖を伸長させることが可能になるが、反応させる糖の順序に応じて、反応カラムおよび分離精製手段を、シリーズに、連続的に連結することが必要になる。即ち、同種の糖を繰り返し反応させる場合であっても、その数だけ反応カラムおよび分離精製手段も必要となり、装置が大掛かりなものになると云う問題がある。また、糖鎖合成を自動的に連続して行う方法が示されていない。さらに、用いる酵素は、糖転移酵素のみであり、糖質加水分解酵素を用いるようにはなっていない。
本発明の目的は、糖鎖の合成を容易に行うことのできる糖鎖合成装置を提供することである。
本発明の特徴的な構成は、糖転移酵素及び／または糖質加水分解酵素を固定化した一つまたは複数の反応カラムと、当該反応カラムの下流側に配置され、前記反応カラムからの溶出液中の反応生成物と未反応および副産物を分離する一つまたは複数の分離手段を備え、更に、これらを選択的に繰り返し循環させるための循環流路を備えたものである。
本発明においては、水溶性ポリマーのプライマーに対して糖を結合、または、解離させるために、プライマーに結合した糖を、目的の反応に必要な反応カラムに対して、容易に送液することが可能となる。したがって、所望の糖鎖の合成を容易に行うことができる。
発明を実施するための最良の形態
〔実施例１〕
図１は、本実施例のシステム構成図である。
糖鎖合成装置は、複数の溶媒を選択し、時間と共にそれら溶媒を混合しながら、かつ、送液溶媒の組成を変えながら送液できる機能（いわゆる低圧グラジエント機能）を有するポンプ１，２、流路を切り替えるためのバルブ３〜８（６台）、反応カラム１８〜２０、分離カラム２１〜２３，反応生成物を検出する検知器９，１０、そして、これらを制御するコントローラ１１により構成されている。
本装置で用いる検知器９には、生成物をモニターするために、例えば、屈折率検知器（ＲＩ），紫外可視分光検知器（ＵＶ），ダイオードアレイ吸光度検知器（ＤＡＤ）が用いられる。検知器１０には、分子構造情報を得るために、ダイオードアレイ吸光度検知器（ＤＡＤ）、質量分析計（ＭＳ）、核磁気共鳴装置（ＮＭＲ）が用いられる。
また、反応カラムは、糖転移酵素（例えば、ガラクトース転移酵素、Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素、Ｎ−アセチルガラクトサミン転移酵素、フコース転移酵素、シアル酸転移酵素、マンノース転移酵素等）あるいは糖質加水分解酵素（例えば、マンノシダーゼ、ガラクトシダーゼ、フコシダーゼ、シアリダーゼ、キシロシダーゼなど）を固定化したものである。糖転移酵素を固定化したカラムを用いれば、糖鎖に新たな糖を結合させて伸長させることができ、糖質加水分解酵素を固定化したカラムを用いれば、糖鎖から所定の糖を解離させる（切り離す）ことが可能になる。本実施例では、反応カラムＲｎと称す。
また、反応生成物とは、水溶性ポリマーのプライマー（例えば、蛋白質、糖蛋白質、糖ペプチド、脂質、糖脂質、オリゴ糖、多糖などの生体高分子や、特開平１１−４２０９６号公報や特開２００１−２２０３９９号公報に記載されているポリアクリルアミド誘導体等の合成高分子であり、分子量１００００以上のものが更に望ましい。本実施例では、以下、プライマー（Ｐ）と呼ぶ）と、糖（Ｓｎ）が化学結合したもの（以下、プライマー（Ｐ−Ｓｎ）と称す。）を云う。
また、分離カラムとしては、反応生成物と糖ヌクレオチド、ヌクレオチド、あるいは加水分解により生じた単糖やオリゴ糖とを分離できる機能を有するものを用いる。例えばゲルろ過クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、透析、限外ろ過などの方法を用いたカラムが挙げられる。
図２は、本実施例の流路図である。
ポンプ１，２は、ボトル１３〜１７内の溶液を送液する。ここで、ボトル１３はプライマー（Ｐ）、ボトル１４はバッファー溶液、そして、ボトル１５〜１７は糖ヌクレオチド溶液（例えば、ウリジン−５’−ジホスホガラクトース，ウリジン−５’−ジホスホ−Ｎ−アセチルグルコサミン，ウリジン−５’−ジホスホ−Ｎ−アセチルガラクトサミン、グアノシン−５’−ジホスホフコース、グアノシン−５’−ジホスホマンノース、シチジン−５’−モノホスホ−Ｎ−アセチルノイラミン酸等。本実施例では、以下、Ｘｎ−Ｓｎと称す。）を入れたボトルである。
各ボトルには、ポンプに内蔵されているソレノイドバルブ１０１〜１０６がそれぞれ割り当てられており、このバルブが開になった溶液がポンプで送液される。また、ボトル１２は分取用ボトル（ＦＣ：フラクションコレクター）、ドレイン（１），ドレイン（２）はドレインボトルである。
図２に基づき本装置の動作を説明する。
ここでは、プライマーＰと糖Ｓ１，Ｓ２，Ｓ３は、Ｐ−Ｓ１−Ｓ２−Ｓ３の順序で結合させるものと仮定する。また、反応カラムは、糖転移酵素を固定化したカラムを用いるものとする。しかし、実際には、糖Ｓ１，Ｓ２，Ｓ３の順序には制限はなく、また、Ｐ−Ｓ１−Ｓ２−Ｓ１−Ｓ３と云ったＳ１の繰り返しも可能である。
但し、Ｐ−Ｓ１−Ｓ１と云うように同じ糖Ｓ１の繰り返しが連続する場合は、ボトル１６か１７を糖ヌクレオチドＸ１−Ｓ１に入ったものに置き換え、さらに反応カラム１９か２０をＲ１に置き換えるか、もう１流路、即ち、反応カラムおよび分離手段（以下分離カラムと呼ぶ）を４列に拡張する。Ｓ２（またはＳ３）の連続繰り返しの場合も同様である。
また、糖の解離を行う場合は、反応カラムに糖質加水分解酵素を固定化したカラムを加える。糖質加水分解酵素を固定化したカラムでの処理については、糖ヌクレオチド溶液は必要としない。
Ｐ−Ｓ１−Ｓ２−Ｓ３の順序で反応させる場合、本装置は基本的には、次の１０ステップからなる。
ステップ１：プライマー（Ｐ）および糖ヌクレオチド（Ｘ１−Ｓ１）の反応カラム１８（Ｒ１）への導入と反応。
ステップ２：プライマー（Ｐ−Ｓ１）と未反応の糖ヌクレオチド（Ｘ１−Ｓ１）及び反応副産物であるヌクレオチド（Ｘ１）を分離カラム２１（Ｃ１）で分離。
ステップ３：プライマー（Ｐ−Ｓ１）と糖ヌクレオチド（Ｘ２−Ｓ２）の反応カラム１９（Ｒ２）への導入。
ステップ４：プライマー（Ｐ−Ｓ１）と糖ヌクレオチド（Ｘ２−Ｓ２）の反応と分離カラム２１（Ｃ１）の洗浄。
ステップ５：プライマー（Ｐ−Ｓ１−Ｓ２）と未反応の糖ヌクレオチド（Ｘ２−Ｓ２）及び反応副産物であるヌクレオチド（Ｘ２）を分離カラム２２（Ｃ２）で分離。
ステップ６：プライマー（Ｐ−Ｓ１−Ｓ２）と糖ヌクレオチド（Ｘ３−Ｓ３）の反応カラム２０（Ｒ３）への導入。
ステップ７：プライマー（Ｐ−Ｓ１−Ｓ２）と糖ヌクレオチド（Ｘ３−Ｓ３）の反応と分離カラム２２（Ｃ２）の洗浄。
ステップ８：プライマー（Ｐ−Ｓ１−Ｓ２−Ｓ３）と未反応の糖ヌクレオチド（Ｘ３−Ｓ３）及び反応副産物であるヌクレオチド（Ｘ２）を分離カラム２３（Ｃ３）で分離。
ステップ９：プライマー（Ｐ−Ｓ１−Ｓ２−Ｓ３）の分取（ＦＣ）。
ステップ１０：分離カラム２３（Ｃ３）の洗浄。
以下、図２に基づき各ステップの詳細を説明する。また、表１に各ステップにおける各バルブの位置について示す。
＜ステップ１の説明＞
（１） ポンプ１のバルブ１０１，ポンプ２のバルブ１０４を開き、バルブ３，５を、それぞれポジション（２）に接続し、プライマー（Ｐ）と糖ヌクレオチド（Ｘ１−Ｓ１）を反応カラム１８（Ｒ１）に導入する。導入量は、式（１）および（２）で示すように流量と送液時間で決まる。
Ｐの導入量（ｍｌ）＝流量（ｍｌ／ｍｉｎ）×時間（ｍｉｎ）…〔１〕
Ｘ１−Ｓ１の導入量（ｍｌ）＝流量（ｍｌ／ｍｉｎ）×時間（ｍｉｎ）…〔２〕
送液時間を同じとした場合、プライマー（Ｐ）と糖ヌクレオチド（Ｘ１−Ｓ１）の比率は、流量比率で決まる。例えば、５０％／５０％のとき、ポンプ１の流量＝ポンプ２の流量となる。
（２） ポンプ１のバルブ１０２，ポンプ２のバルブ１０３を開き、バッファー１４を同じ流量で流して、プライマー（Ｐ）と糖ヌクレオチド（Ｘ１−Ｓ１）を反応カラム１８（Ｒ１）に導入する。その後、流量を下げ、例えば、流量＝０ｍｌ／ｍｉｎで一定時間反応を継続させる。
＜ステップ２の説明＞
反応終了後、ポンプ流量を上げて、反応カラム１８（Ｒ１）における反応生成物であるプライマー（Ｐ−Ｓ１）と未反応の糖ヌクレオチド（Ｘ１−Ｓ１）および反応副産物のヌクレオチド（Ｘ１、糖ヌクレオチド（Ｘ１−Ｓ１）から糖（Ｓ１）が外れたもの）を分離カラム２１（Ｃ１）に導き、分離する。
分離モードとして、例えば、以下のものが考えられる。
（ａ） ゲルろ過：プライマー（Ｐ−Ｓ１）の分子量がＧＰＣカラムの排除限界を超えているならば、糖ヌクレオチド（Ｘ１−Ｓ１）やヌクレオチド（Ｘ１）より早く溶出する（保持容量が小さい）。
（ｂ） 陰イオン交換：中性であるプライマー（Ｐ−Ｓ１）は保持されないが、陰イオンである糖ヌクレオチド（Ｘ１−Ｓ１）やヌクレオチド（Ｘ１）はカラムに保持されることから溶出が遅れる。
（ｃ） 陽イオン交換：中性であるプライマー（Ｐ−Ｓ１）は保持されないが、陰イオンである糖ヌクレオチド（Ｘ１−Ｓ１）やヌクレオチド（Ｘ１）はイオン排除されることにより、溶出が早まる。
（ｄ） 限外ろ過：分子サイズが小さい未反応糖ヌクレオチドや反応副産物であるヌクレオチドをろ過し、分子サイズが大きいプライマーと分離する。
以下のステップは、分離モード（ｂ）を用いた場合のものである。
＜ステップ３の説明＞
（１）プライマー（Ｐ−Ｓ１）が検知器９で検出されたら、バルブ４を反応カラム１９（Ｒ２）のポジション（３）に切り替えると共に、バルブ７をドレイン側に切り替える。同時に、ポンプ２のバルブ１０５を開き、且つバルブ５を反応カラム１９（Ｒ２）のポジション（３）にして、糖ヌクレオチド（Ｘ２−Ｓ２）を送液する。もし、糖ヌクレオチド（Ｘ２−Ｓ２）の比率が５０％ならば、ポンプ１，２の流量は同じとする（ステップ１と同じ）。
導入は、プライマー（Ｐ−Ｓ１）が検出終了するまで行う。もし、プライマー（Ｐ−Ｓ１）の容積がバンドの拡がりによって、ポンプ１，２の流量×導入時間が反応カラム１９（Ｒ２）の容積を超えてしまう場合は、導入を途中で止め（ポンプ流量＝０）、導入された分を一旦、反応させた後、残り分を再導入する必要がある。
（２）プライマー（Ｐ−Ｓ１）が、反応カラム１９（Ｒ２）に移行し終わったら、バルブ４をドレインポジション（１）に、また、バルブ７を元に戻す。バルブ１０３を開いてポンプ２の送液する溶液をバッファー１４に切り替えてプライマー（Ｐ−Ｓ１）と糖ヌクレオチド（Ｘ２−Ｓ２）を、全て反応カラム１９（Ｒ２）に導入する。その後、流量を下げて、例えば、流量＝０ｍｌ／ｍｉｎで一定時間反応を継続する。このとき、反応カラムへのバッファーの送液は、ポンプ２のみで行う。
＜ステップ４の説明＞
プライマー（Ｐ−Ｓ１）と糖ヌクレオチド（Ｘ２−Ｓ２）が反応カラム１９（Ｒ２）で反応している間に、ポンプ１は、バッファー１４を分離カラム２１（Ｃ１）に流し続け、カラムに保持されている未反応糖ヌクレオチド（Ｘ１−Ｓ１）と反応副産物のヌクレオチド（Ｘ１）をカラムから洗い出す。
＜ステップ５の説明＞
プライマー（Ｐ−Ｓ１）と糖ヌクレオチド（Ｘ２−Ｓ２）の反応終了後、バルブ３をポジション（３）にする。ポンプ１，２によってバッファー１４の流量を上げて、プライマー（Ｐ−Ｓ１−Ｓ２）と未反応の糖ヌクレオチド（Ｘ２−Ｓ２）、および反応副産物のヌクレオチド（Ｘ２）を分離カラム２２（Ｃ２）内で分離する。
＜ステッフ６の説明＞
（１） プライマー（Ｐ−Ｓ１−Ｓ２）が検知器９で検出されたら、バルブ４をポジション（４）に切り替え、同時に、バルブ８をドレインポジション（２）側に切り替える。同時に、バルブ５をポジション（４）にして、糖ヌクレオチド（Ｘ３−Ｓ３）を送液する。もし、糖ヌクレオチド（Ｘ３−Ｓ３）の比率が５０％ならば、ポンプ１，２の流量は同じにする（ステップ１と同じ）。導入は、プライマー（Ｐ−Ｓ１−Ｓ２）が検出終了するまで行う。
（２） プライマー（Ｐ−Ｓ１−Ｓ２）が、反応カラム２０（Ｒ３）に移行し終わったら、バルブ４をドレインポジション（１）に切り替え、バルブ８を元に戻す。ポンプ２をバッファー１４に切り替えて，プライマー（Ｐ−Ｓ１−Ｓ２）と糖ヌクレオチド（Ｘ３−Ｓ３）を、全て反応カラム２０（Ｒ３）に導入した後、バッファーの送液をポンプ２のみで行うとともに、流量を下げて、例えば、流量＝０ｍｌ／ｍｉｎで、一定時間反応を継続させる。
＜ステップ７の説明＞
プライマー（Ｐ−Ｓ１−Ｓ２）と糖ヌクレオチド（Ｘ３−Ｓ３）が反応カラム２０（Ｒ３）で反応している間に、ポンプ１は、バッファー１４を分離カラム２２（Ｃ２）に流し続け、カラムに保持されている未反応糖ヌクレオチド（Ｘ２−Ｓ２）と反応副産物のヌクレオチド（Ｘ２）をカラムから洗い出す。
＜ステップ８の説明＞
プライマー（Ｐ−Ｓ１−Ｓ２）と糖ヌクレオチド（Ｘ３−Ｓ３）の反応終了後、バルブ３をポジション（４）にする。ポンプ１，２によってバッファー１４の流量を上げて、水溶性ポリマー（Ｐ−Ｓ１−Ｓ２−Ｓ３）と未反応の糖ヌクレオチド（Ｘ３−Ｓ３）、および反応生成物ヌクレオチド（Ｘ３）を分離カラム２３（Ｃ３）内で分離する。
＜ステップ９の説明＞
（１） プライマー（Ｐ−Ｓ１−Ｓ２−Ｓ３）が、検知器９で検出されたら、バルブ４を分取ポジジョン（５）に切り替え、糖鎖合成物をボトル１２（ＦＣ）に分取する。
（２） 検知器９で検出されなくなったら、バルブ４をドレインポジション（１）に戻す。
＜ステップ１０の説明＞
ポンプ１，２は、バッファー１４を分離カラム２３（Ｃ３）に流し続け、カラムに保持されている未反応糖ヌクレオチド（Ｘ３−Ｓ３）と反応副産物のヌクレオチド（Ｘ３）をカラムから洗い出す。
以上が、本実施例における糖鎖合成物（Ｐ−Ｓ１−Ｓ２−Ｓ３）を作成するときの手順である。
図３に本実施例の変形例を示す。図３は、検知器１０を追加した場合の流路図である。検出器１０は、スプリッター（Ｓｐ）を介して検出器９の上流に接続され、各分離カラムからの溶出成分の分子構造を得る。この図３の場合でも、糖鎖合成における作成手順は図２の場合と同様に行える。
図３の構成では、反応生成物の分子構造に関する情報を検出する検知器１０を備えたことにより、合成反応が予想通りに行なわれたかどうかを、各反応毎に確認することが可能になる。もし、反応収率が、期待したレベルに到達しない場合は、次の合成反応を中止し、反応試薬と時間の無駄を省くことができると云った効果がある。
尚、本実施例では、各バルブによる流路を切り換えるタイミングとして、検出器９の検出結果を基に切り換える例を示したが、予定された糖の改変処理を行うものであって、予め反応カラムや分離カラムにおける溶出液の通過時間が分かっている場合は、各バルブの切り換えは、検出器９の結果によらずに時間経過によって制御しても良い。
〔実施例２〕
図４は、本実施例のシステム構成図である。
糖鎖合成装置は、ボトル１３〜１７の各溶媒をそれぞれ一定流量で一定時間送液できる機能を有するポンプ１、２、２４〜２７（６台）、流路を切り変えるためのバルブ３〜８（６台）、反応生成物を検出する検知器９，１０（２台）、そして、これらを制御するコントローラ１１により構成されている。本実施例で用いる検知器９，１０は、実施例１と同じものである。
図５は、本装置の流路図である。なお、この流路図は、使用する検出器が１台の場合を示している。６台のポンプ１、２、２４〜２７は、コントローラ１１による制御に従ってボトル１３〜１７の溶液を、一定流量で一定時間それぞれ送液する。実施例１との違いは、糖ヌクレオチド溶液（Ｘ１−Ｓ１，Ｘ２−Ｓ２，Ｘ３−Ｓ３）がそれぞれのポンプ２５，２６，２７で、直接、反応カラム１８〜２０（Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３）に送液されることである。
本実施例では、ポンプ１と２は同じバッファー１４を送液するだけとなり、いわゆる低圧グラジエント機能は不要である。また、ポンプ２５，２６，２７が、糖ヌクレオチド溶液（Ｘ１−Ｓ１，Ｘ２−Ｓ２，Ｘ３−Ｓ３）をそれぞれのソレノイドバルブを介さず、反応カラム１８〜２０に送り込める。このため、ソレノイドバルブの開閉が、ポンプの吸引過程と同期している低圧グラジエント機能と異なり、より正確に、プライマー（Ｐ）と糖ヌクレオチド溶液（Ｘ１−Ｓ１，Ｘ２−Ｓ２，Ｘ３−Ｓ３）を送液する時間を制御することが可能になると云った効果がある。
〔実施例３〕
図６は、本実施例のシステム構成図である。
バッファー（Ｂ１，Ｂ２）１４，３０をそれぞれ一定流量で一定時間送液できる機能を持ったポンプ２台（ポンプ１，２），プライマー（Ｐ）１３を流路に導入するサンプルインジェクター２８，糖ヌクレオチド溶液（Ｘ１−Ｓ１，Ｘ２−Ｓ２，Ｘ３−Ｓ３）１５，１６，１７を流路に導入するサンプルインジェクター２９、流路を切り替えるためのバルブ３〜８（６台）、反応生成物を検出する検知器９，１０（２台）、そして、これらを制御するコントローラ１１により構成されている。本実施例で用いる検知器９，１０は、実施例１と同じものである。
図７は本装置の流路図である。なお、この流路図は、使用する検出器が１台の場合を示している。２台のポンプ１，２は、コントローラ１１による制御に従って、バッファー１４，３０（必ずしもバッファーをポンプごとに備える必要は無く、共通のバッファーを使用することも可能。図７は、その際の例を示す）の溶液を、一定流量で一定時間、それぞれ送液する。実施例１との違いは、プライマー（Ｐ），糖ヌクレオチド溶液（Ｘ１−Ｓ１，Ｘ２−Ｓ２，Ｘ３−Ｓ３）がサンプルインジェクター２８，２９を用いて流路に導入され、反応カラム１８，１９，２０（Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３）に、バッファー１４（或いはバッファー３０）によって送られることである。
本実施例では、ポンプ１，２はバッファー１４，或いはバッファー３０を送液するだけとなり、いわゆる低圧グラジエント機能は不要である。また、プライマー（Ｐ），糖ヌクレオチド溶液（Ｘ１−Ｓ１，Ｘ２−Ｓ２，Ｘ３−Ｓ３）は、必要な量だけサンプルインジェクターを介して、流路に導入される。このため、ソレノイドバルブの開閉が、ポンプの吸引過程と同期している低圧グラジエント機能と異なり、プライマー（Ｐ）と糖ヌクレオチド溶液（Ｘ１−Ｓ１，Ｘ２−Ｓ２，Ｘ３−Ｓ３）の無駄な消費を無くすることができると云う効果がある。
〔実施例４〕
図８は、本実施例のシステム構成図であり、図９は流路図である。なお、この実施例において、使用する検出器は１台の場合でも、２台の場合でも良い。また、予め分析時間が既値である場合は、検出器を使用せずに制御しても良い。
実施例３との違いは、それぞれの反応カラムに直列に接続されていた分離カラムおよびバルブを、一本の分離カラムに集約している点である。また、分離カラムに限外ろ過カラム４０を使用した点である。
分離カラムを共用化したことにより、本実施例では、バルブ６〜８に代えて、バルブ４１が設けられる。
限外ろ過カラム４０の構成を図１０に示す。限外ろ過カラム４０は、内部に円筒状の限外ろ過膜４８を有し、更に、導入口４５から導入された成分の内、膜を通過しないような大きな分子量の成分を排出する排出口４７と、膜を通過した成分を排出する排出口４６の二つの排出口を備えている。限外ろ過膜４８は、例えば、プライマーは通過せず、糖ヌクレオチドやヌクレオチドは通過するようなものを選択する。プライマーの分子量は、約１０、０００以上であり、糖ヌクレオチドやヌクレオチドの分子量は約４００程度である。そのために、大きさにかなりの差があり、容易に分離可能である。
排出口４７の下流には、三方バルブ４２が設けられる。このバルブは、検出器側の流路と、何れかの排出口４６，４７を選択的に連通させるように構成される。連通されない側の排出口はバルブによって流路が遮断されることになる。
この限外ろ過カラム４０での分離は、次のように行う。即ち、反応カラムからの溶出液が導入された当初は、三方バルブ４２を排出口４６側にしておき、限外ろ過膜４８を透過したもののみを排出する。分子量の大きなプライマーとプライマーに結合した糖は、限外ろ過膜４８内に残される。所定時間経過後、三方バルブ４２を排出口４７側に切り換えると、限外ろ過膜４８内に蓄積されたプライマーとプライマーに結合した糖が検出器側に排出される。
本実施例における動作は、実施例１で示した動作と基本的に共通である。分離カラムが共通化されているが、実施例１におけるバルブ６〜８がドレインに切り替わるタイミングで、バルブ４１が点線側の流路に切り換えられることで、分離カラムを共通化しても実施例１と同様の動作を実現することができる。
本実施例においては、分離カラムを共通化したことにより、装置構成を簡易化することができる。また、分離カラムとして限外ろ過カラムを用いることにより、プライマー（Ｐ）は、一旦限外ろ過カラム中に濃縮されることになる。従って、実施例１のステップ３で述べたようなプライマー（Ｐ）のバンドの拡がりという問題が無くなり、次の反応カラムへの導入が容易になると云う効果がある。
以上説明したように、本発明によれば、複雑な糖鎖合成であっても容易に実行することが可能になる。
産業上の利用可能性
本発明を糖鎖合成装置へ適用すれば、糖鎖の合成、或いは分離を容易に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
第１図は、実施例１のシステム構成図である。
第２図は、実施例１の糖鎖合成装置の流路図である。
第３図は、実施例１の変形例である。
第４図は、実施例２のシステム構成図である。
第５図は、実施例２の糖鎖合成装置の流路図である。
第６図は、実施例３のシステム構成図である。
第７図は、実施例３の糖鎖合成装置の流路図である。
第８図は、実施例４のシステム構成図である。
第９図は、実施例４の糖鎖合成装置の流路図である。
第１０図は、限外ろ過カラムの構成例を示す図である。
Claims (11)
- 糖転移酵素及び／または糖質加水分解酵素を固定化した一つまたは複数の反応カラムと、
前記反応カラムの下流側に配置され、前記反応カラムからの溶出液中の反応生成物と未反応および副産物を分離する一つまたは複数の分離手段と、
水溶性ポリマーのプライマー及びバッファー溶液を第１の切換バルブを介して前記反応カラムに送液する第１のポンプと、
バッファー溶液及び糖ヌクレオチド溶液を第２の切換バルブを介して前記反応カラムの何れかに送液する第２のポンプと、
前記分離手段下流側の流路と前記各反応カラムの上流側の流路を結ぶ一つまたは複数の循環流路と、
前記分離手段と前記一つまたは複数の循環流路間に配置され、分離手段と任意の循環流路を選択的に連通する第３の切換バルブとを備えたことを特徴とする糖鎖合成装置。 - 請求の範囲第１項において、前記第３の切換バルブには、反応生成物を分取するための分取用流路が接続される糖鎖合成装置。
- 請求の範囲第１項において、前記第１及び第２のポンプは、開閉によって送液を行う複数のソレノイドバルブを有し且つ低圧グラジエント機能を有するポンプであって、前記各溶液が入ったボトルは、それぞれ前記ソレノイドバルブに接続される糖鎖合成装置。
- 請求の範囲第１項において、水溶性ポリマーのプライマー、バッファー溶液、糖ヌクレオチド溶液が入ったボトルごとに、各溶液を前記第１又は第２の切換バルブに送液するポンプを備えた糖鎖合成装置。
- 請求の範囲第１項において、前記第１のポンプと前記第１の切換バルブ間の流路に、水溶性ポリマーのプライマーを導入する第１のサンプルインジェクターを備え、前記第２のポンプと前記第２の切換バルブ間の流路に、糖ヌクレオチド溶液を導入する第２のサンプルインジェクターを備えた糖鎖合成装置。
- 請求の範囲第１項において、前記分離手段の下流に、分離手段からの溶出液を検出する検知器を備え、前記検知器は、屈折率検知器（ＲＩ），紫外可視分光検知器（ＵＶ），ダイオードアレイ吸光度検知器（ＤＡＤ）の何れかである糖鎖合成装置。
- 請求の範囲第６項において、前記分離カラムと前記検知器間の流路に、前記流路を分岐するスプリッターを備え、前記スプリッターには、溶出液の分子構造を検出可能な第２の検知器を接続する糖鎖合成装置。
- 請求の範囲第７項において、前記第２の検知器は、ダイオードアレイ吸光度検知器（ＤＡＤ）、質量分析計（ＭＳ）、核磁気共鳴装置（ＮＭＲ）の何れかである糖鎖合成装置。
- 請求の範囲第１項において、前記分離手段は、ゲルろ過クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、限外ろ過のいずれかである糖鎖合成装置。
- 請求の範囲第１項において、前記反応カラムを複数備え、且つ、各反応カラムの下流に分離手段を備えた場合に、前記各分離手段の下流に、前記分離手段と前記第３の切換バルブを結ぶ流路と、前記分離手段とドレインとを結ぶ流路を選択的に切り換える第４のバルブを備えた糖鎖合成装置。
- 請求の範囲第１項において、前記反応カラムを複数備え、且つ各反応カラムからの溶出液を一つの分離手段に導入する場合に、前記反応カラムと前記分離手段の間に、前記反応カラムと前記分離手段を結ぶ流路と、前記第１のバルブとドレインを結ぶ流路を形成する第１の状態と、前記第１のバルブと前記分離手段を結ぶ流路と、前記反応カラムとドレインとを結ぶ流路を形成する第２の状態を選択的に切り換える第５のバルブを備えた糖鎖合成装置。
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