JP4005557B2 - 糖鎖合成装置 - Google Patents
糖鎖合成装置 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4005557B2 JP4005557B2 JP2003510756A JP2003510756A JP4005557B2 JP 4005557 B2 JP4005557 B2 JP 4005557B2 JP 2003510756 A JP2003510756 A JP 2003510756A JP 2003510756 A JP2003510756 A JP 2003510756A JP 4005557 B2 JP4005557 B2 JP 4005557B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- reaction
- sugar chain
- separation means
- sugar
- flow path
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/18—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a glycosyl transferase, e.g. alpha-, beta- or gamma-cyclodextrins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/14—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a carbohydrase (EC 3.2.x), e.g. by alpha-amylase, e.g. by cellulase, hemicellulase
Landscapes
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
本発明は、糖鎖の合成,分離処理の自動化を図るための糖鎖合成装置に関する。
背景技術
細胞内における複合糖質は、情報伝達や細胞間の識別、例えば、ウイルス,がん細胞,血液型の認識等の重要な役割を果たしており、糖鎖の機能解明はポストゲノム研究のターゲットの一つに位置付けられている。
しかしながら、オリゴ核酸やペプチド合成法は、すでに確立され自動化されているが、糖鎖合成法は、まだ多くの課題を残している。糖鎖の機能解明に向けて、糖鎖合成法の確立と、効率的な合成装置の実現が望まれており、現在、以下の3つの糖鎖合成の方法が行なわれている。
(1) 化学合成による方法
(2) 遺伝子組換え細胞あるいは微生物による発酵法
(3) 糖転移酵素を用いて合成する方法
前記(1)の方法は、化学結合させるOH基以外のOH基を保護しながら、目的とする糖鎖を順次合成するため、反応ステップが多く複雑になる。前記(2)の方法は、目的の糖鎖を大量に得ることができるが、その後の精製過程が複雑である。
前記(3)の方法は、上記(1),(2)の複雑さを克服する方法として開発されたものであり、例えば、特開平11−42096号公報に開示されたものである。この(3)の方法では、選択的な糖転移酵素による合成のため、(1)のようなOH基を保護する必要はない。また、副産物も少ないので、合成後の精製過程も容易である。
また近年、遺伝子組換え技術の発達により生理活性蛋白質を容易に調製できるようになった。しかし、大半の生理活性蛋白質は糖蛋白質であり、宿主により結合する糖鎖が異なり、活性が失われたり、著しく低下することがある。
もし、この異なってしまった糖鎖を元の糖鎖に改変できる方法があれば、非常に有用である。また、もともと結合していた糖鎖とは異なる糖鎖に改変することにより、生理機能の強化や生理活性の改変に役立つことが期待される。糖蛋白質糖鎖を改変する方法としては、大きく分けて2つの方法が現在採られている。
(A)宿主の変更、糖転移酵素遺伝子の宿主への導入により改変した宿主を利用した発酵法
(B)得られた糖蛋白質のエンドあるいはエキゾグリコシターゼと糖転移酵素を利用した発酵法
(A)の方法では、結合する糖鎖は変わるが、必ずしも望むものに変わるとは限らない。特定の糖鎖に改変するためには(B)の方法が望ましい。エンドグリコシターゼの糖転移反応を利用した方法としては、例えば、特開平5−64594号公報などがある。エキゾグリコシターゼと糖転移酵素を用いる方法としては、例えば、Eur.J.Biochem.191:71−73(1990)などに開示されている方法がある。
しかしながら、いずれの方法もせいぜい非還元末端の糖残基を改変する程度であり、本格的な糖鎖の改変とはいえない。また、エンドグリコシターゼと糖転移酵素を用いる方法もあり、例えば、J.Am.Chem.Soc.,119:2114−2118(1997)にその方法が開示されている。ここでは、エンドグリコシターゼで加水分解した後、蛋白質上に残ったN−アセチルグルコサミン残基の非還元末端に糖転移酵素により糖鎖を伸長させ、シアリルルイスX4糖が結合した糖蛋白質へ改変しているが、結合している糖鎖は、糖蛋白質糖鎖の非還元末端部分であり、糖鎖全体を改変するという点では不十分である。
糖鎖合成装置に関しては、特表平5−500905号公報に開示されたものがある。
発明の開示
上記(3)あるいは(B)の方法を用いる糖鎖の合成を実際の装置を用いて実現する際、現在は、各ステップ毎に、生成物の分離精製を行い、その後、次の反応に進むと云うバッチ方式で行われており、全ての処理を行うためには、必ず人の手を介していた。
上記特表平5−500905号公報に開示されている装置では、糖転移酵素を用いて単糖、オリゴ糖、糖蛋白質などを基質に糖鎖を伸長させることが可能になるが、反応させる糖の順序に応じて、反応カラムおよび分離精製手段を、シリーズに、連続的に連結することが必要になる。即ち、同種の糖を繰り返し反応させる場合であっても、その数だけ反応カラムおよび分離精製手段も必要となり、装置が大掛かりなものになると云う問題がある。また、糖鎖合成を自動的に連続して行う方法が示されていない。さらに、用いる酵素は、糖転移酵素のみであり、糖質加水分解酵素を用いるようにはなっていない。
本発明の目的は、糖鎖の合成を容易に行うことのできる糖鎖合成装置を提供することである。
本発明の特徴的な構成は、糖転移酵素及び/または糖質加水分解酵素を固定化した一つまたは複数の反応カラムと、当該反応カラムの下流側に配置され、前記反応カラムからの溶出液中の反応生成物と未反応および副産物を分離する一つまたは複数の分離手段を備え、更に、これらを選択的に繰り返し循環させるための循環流路を備えたものである。
本発明においては、水溶性ポリマーのプライマーに対して糖を結合、または、解離させるために、プライマーに結合した糖を、目的の反応に必要な反応カラムに対して、容易に送液することが可能となる。したがって、所望の糖鎖の合成を容易に行うことができる。
発明を実施するための最良の形態
〔実施例1〕
図1は、本実施例のシステム構成図である。
糖鎖合成装置は、複数の溶媒を選択し、時間と共にそれら溶媒を混合しながら、かつ、送液溶媒の組成を変えながら送液できる機能(いわゆる低圧グラジエント機能)を有するポンプ1,2、流路を切り替えるためのバルブ3〜8(6台)、反応カラム18〜20、分離カラム21〜23,反応生成物を検出する検知器9,10、そして、これらを制御するコントローラ11により構成されている。
本装置で用いる検知器9には、生成物をモニターするために、例えば、屈折率検知器(RI),紫外可視分光検知器(UV),ダイオードアレイ吸光度検知器(DAD)が用いられる。検知器10には、分子構造情報を得るために、ダイオードアレイ吸光度検知器(DAD)、質量分析計(MS)、核磁気共鳴装置(NMR)が用いられる。
また、反応カラムは、糖転移酵素(例えば、ガラクトース転移酵素、N−アセチルグルコサミン転移酵素、N−アセチルガラクトサミン転移酵素、フコース転移酵素、シアル酸転移酵素、マンノース転移酵素等)あるいは糖質加水分解酵素(例えば、マンノシダーゼ、ガラクトシダーゼ、フコシダーゼ、シアリダーゼ、キシロシダーゼなど)を固定化したものである。糖転移酵素を固定化したカラムを用いれば、糖鎖に新たな糖を結合させて伸長させることができ、糖質加水分解酵素を固定化したカラムを用いれば、糖鎖から所定の糖を解離させる(切り離す)ことが可能になる。本実施例では、反応カラムRnと称す。
また、反応生成物とは、水溶性ポリマーのプライマー(例えば、蛋白質、糖蛋白質、糖ペプチド、脂質、糖脂質、オリゴ糖、多糖などの生体高分子や、特開平11−42096号公報や特開2001−220399号公報に記載されているポリアクリルアミド誘導体等の合成高分子であり、分子量10000以上のものが更に望ましい。本実施例では、以下、プライマー(P)と呼ぶ)と、糖(Sn)が化学結合したもの(以下、プライマー(P−Sn)と称す。)を云う。
また、分離カラムとしては、反応生成物と糖ヌクレオチド、ヌクレオチド、あるいは加水分解により生じた単糖やオリゴ糖とを分離できる機能を有するものを用いる。例えばゲルろ過クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、透析、限外ろ過などの方法を用いたカラムが挙げられる。
図2は、本実施例の流路図である。
ポンプ1,2は、ボトル13〜17内の溶液を送液する。ここで、ボトル13はプライマー(P)、ボトル14はバッファー溶液、そして、ボトル15〜17は糖ヌクレオチド溶液(例えば、ウリジン−5’−ジホスホガラクトース,ウリジン−5’−ジホスホ−N−アセチルグルコサミン,ウリジン−5’−ジホスホ−N−アセチルガラクトサミン、グアノシン−5’−ジホスホフコース、グアノシン−5’−ジホスホマンノース、シチジン−5’−モノホスホ−N−アセチルノイラミン酸等。本実施例では、以下、Xn−Snと称す。)を入れたボトルである。
各ボトルには、ポンプに内蔵されているソレノイドバルブ101〜106がそれぞれ割り当てられており、このバルブが開になった溶液がポンプで送液される。また、ボトル12は分取用ボトル(FC:フラクションコレクター)、ドレイン(1),ドレイン(2)はドレインボトルである。
図2に基づき本装置の動作を説明する。
ここでは、プライマーPと糖S1,S2,S3は、P−S1−S2−S3の順序で結合させるものと仮定する。また、反応カラムは、糖転移酵素を固定化したカラムを用いるものとする。しかし、実際には、糖S1,S2,S3の順序には制限はなく、また、P−S1−S2−S1−S3と云ったS1の繰り返しも可能である。
但し、P−S1−S1と云うように同じ糖S1の繰り返しが連続する場合は、ボトル16か17を糖ヌクレオチドX1−S1に入ったものに置き換え、さらに反応カラム19か20をR1に置き換えるか、もう1流路、即ち、反応カラムおよび分離手段(以下分離カラムと呼ぶ)を4列に拡張する。S2(またはS3)の連続繰り返しの場合も同様である。
また、糖の解離を行う場合は、反応カラムに糖質加水分解酵素を固定化したカラムを加える。糖質加水分解酵素を固定化したカラムでの処理については、糖ヌクレオチド溶液は必要としない。
P−S1−S2−S3の順序で反応させる場合、本装置は基本的には、次の10ステップからなる。
ステップ1:プライマー(P)および糖ヌクレオチド(X1−S1)の反応カラム18(R1)への導入と反応。
ステップ2:プライマー(P−S1)と未反応の糖ヌクレオチド(X1−S1)及び反応副産物であるヌクレオチド(X1)を分離カラム21(C1)で分離。
ステップ3:プライマー(P−S1)と糖ヌクレオチド(X2−S2)の反応カラム19(R2)への導入。
ステップ4:プライマー(P−S1)と糖ヌクレオチド(X2−S2)の反応と分離カラム21(C1)の洗浄。
ステップ5:プライマー(P−S1−S2)と未反応の糖ヌクレオチド(X2−S2)及び反応副産物であるヌクレオチド(X2)を分離カラム22(C2)で分離。
ステップ6:プライマー(P−S1−S2)と糖ヌクレオチド(X3−S3)の反応カラム20(R3)への導入。
ステップ7:プライマー(P−S1−S2)と糖ヌクレオチド(X3−S3)の反応と分離カラム22(C2)の洗浄。
ステップ8:プライマー(P−S1−S2−S3)と未反応の糖ヌクレオチド(X3−S3)及び反応副産物であるヌクレオチド(X2)を分離カラム23(C3)で分離。
ステップ9:プライマー(P−S1−S2−S3)の分取(FC)。
ステップ10:分離カラム23(C3)の洗浄。
以下、図2に基づき各ステップの詳細を説明する。また、表1に各ステップにおける各バルブの位置について示す。
尚、表1において、バルブ101〜106は、“開”以外は、全て“閉”である。また、バルブ3〜5(V)は、接続されるポジション位置を“P1”〜“P4”として示し、バルブ6〜8(W)は、検出器側であるかドレイン側であるかを“検”または“D”として示している。
<ステップ1の説明>
(1) ポンプ1のバルブ101,ポンプ2のバルブ104を開き、バルブ3,5を、それぞれポジション(2)に接続し、プライマー(P)と糖ヌクレオチド(X1−S1)を反応カラム18(R1)に導入する。導入量は、式(1)および(2)で示すように流量と送液時間で決まる。
Pの導入量(ml)=流量(ml/min)×時間(min)…〔1〕
X1−S1の導入量(ml)=流量(ml/min)×時間(min)…〔2〕
送液時間を同じとした場合、プライマー(P)と糖ヌクレオチド(X1−S1)の比率は、流量比率で決まる。例えば、50%/50%のとき、ポンプ1の流量=ポンプ2の流量となる。
(2) ポンプ1のバルブ102,ポンプ2のバルブ103を開き、バッファー14を同じ流量で流して、プライマー(P)と糖ヌクレオチド(X1−S1)を反応カラム18(R1)に導入する。その後、流量を下げ、例えば、流量=0ml/minで一定時間反応を継続させる。
<ステップ2の説明>
反応終了後、ポンプ流量を上げて、反応カラム18(R1)における反応生成物であるプライマー(P−S1)と未反応の糖ヌクレオチド(X1−S1)および反応副産物のヌクレオチド(X1、糖ヌクレオチド(X1−S1)から糖(S1)が外れたもの)を分離カラム21(C1)に導き、分離する。
分離モードとして、例えば、以下のものが考えられる。
(a) ゲルろ過:プライマー(P−S1)の分子量がGPCカラムの排除限界を超えているならば、糖ヌクレオチド(X1−S1)やヌクレオチド(X1)より早く溶出する(保持容量が小さい)。
(b) 陰イオン交換:中性であるプライマー(P−S1)は保持されないが、陰イオンである糖ヌクレオチド(X1−S1)やヌクレオチド(X1)はカラムに保持されることから溶出が遅れる。
(c) 陽イオン交換:中性であるプライマー(P−S1)は保持されないが、陰イオンである糖ヌクレオチド(X1−S1)やヌクレオチド(X1)はイオン排除されることにより、溶出が早まる。
(d) 限外ろ過:分子サイズが小さい未反応糖ヌクレオチドや反応副産物であるヌクレオチドをろ過し、分子サイズが大きいプライマーと分離する。
以下のステップは、分離モード(b)を用いた場合のものである。
<ステップ3の説明>
(1)プライマー(P−S1)が検知器9で検出されたら、バルブ4を反応カラム19(R2)のポジション(3)に切り替えると共に、バルブ7をドレイン側に切り替える。同時に、ポンプ2のバルブ105を開き、且つバルブ5を反応カラム19(R2)のポジション(3)にして、糖ヌクレオチド(X2−S2)を送液する。もし、糖ヌクレオチド(X2−S2)の比率が50%ならば、ポンプ1,2の流量は同じとする(ステップ1と同じ)。
導入は、プライマー(P−S1)が検出終了するまで行う。もし、プライマー(P−S1)の容積がバンドの拡がりによって、ポンプ1,2の流量×導入時間が反応カラム19(R2)の容積を超えてしまう場合は、導入を途中で止め(ポンプ流量=0)、導入された分を一旦、反応させた後、残り分を再導入する必要がある。
(2)プライマー(P−S1)が、反応カラム19(R2)に移行し終わったら、バルブ4をドレインポジション(1)に、また、バルブ7を元に戻す。バルブ103を開いてポンプ2の送液する溶液をバッファー14に切り替えてプライマー(P−S1)と糖ヌクレオチド(X2−S2)を、全て反応カラム19(R2)に導入する。その後、流量を下げて、例えば、流量=0ml/minで一定時間反応を継続する。このとき、反応カラムへのバッファーの送液は、ポンプ2のみで行う。
<ステップ4の説明>
プライマー(P−S1)と糖ヌクレオチド(X2−S2)が反応カラム19(R2)で反応している間に、ポンプ1は、バッファー14を分離カラム21(C1)に流し続け、カラムに保持されている未反応糖ヌクレオチド(X1−S1)と反応副産物のヌクレオチド(X1)をカラムから洗い出す。
<ステップ5の説明>
プライマー(P−S1)と糖ヌクレオチド(X2−S2)の反応終了後、バルブ3をポジション(3)にする。ポンプ1,2によってバッファー14の流量を上げて、プライマー(P−S1−S2)と未反応の糖ヌクレオチド(X2−S2)、および反応副産物のヌクレオチド(X2)を分離カラム22(C2)内で分離する。
<ステッフ6の説明>
(1) プライマー(P−S1−S2)が検知器9で検出されたら、バルブ4をポジション(4)に切り替え、同時に、バルブ8をドレインポジション(2)側に切り替える。同時に、バルブ5をポジション(4)にして、糖ヌクレオチド(X3−S3)を送液する。もし、糖ヌクレオチド(X3−S3)の比率が50%ならば、ポンプ1,2の流量は同じにする(ステップ1と同じ)。導入は、プライマー(P−S1−S2)が検出終了するまで行う。
(2) プライマー(P−S1−S2)が、反応カラム20(R3)に移行し終わったら、バルブ4をドレインポジション(1)に切り替え、バルブ8を元に戻す。ポンプ2をバッファー14に切り替えて,プライマー(P−S1−S2)と糖ヌクレオチド(X3−S3)を、全て反応カラム20(R3)に導入した後、バッファーの送液をポンプ2のみで行うとともに、流量を下げて、例えば、流量=0ml/minで、一定時間反応を継続させる。
<ステップ7の説明>
プライマー(P−S1−S2)と糖ヌクレオチド(X3−S3)が反応カラム20(R3)で反応している間に、ポンプ1は、バッファー14を分離カラム22(C2)に流し続け、カラムに保持されている未反応糖ヌクレオチド(X2−S2)と反応副産物のヌクレオチド(X2)をカラムから洗い出す。
<ステップ8の説明>
プライマー(P−S1−S2)と糖ヌクレオチド(X3−S3)の反応終了後、バルブ3をポジション(4)にする。ポンプ1,2によってバッファー14の流量を上げて、水溶性ポリマー(P−S1−S2−S3)と未反応の糖ヌクレオチド(X3−S3)、および反応生成物ヌクレオチド(X3)を分離カラム23(C3)内で分離する。
<ステップ9の説明>
(1) プライマー(P−S1−S2−S3)が、検知器9で検出されたら、バルブ4を分取ポジジョン(5)に切り替え、糖鎖合成物をボトル12(FC)に分取する。
(2) 検知器9で検出されなくなったら、バルブ4をドレインポジション(1)に戻す。
<ステップ10の説明>
ポンプ1,2は、バッファー14を分離カラム23(C3)に流し続け、カラムに保持されている未反応糖ヌクレオチド(X3−S3)と反応副産物のヌクレオチド(X3)をカラムから洗い出す。
以上が、本実施例における糖鎖合成物(P−S1−S2−S3)を作成するときの手順である。
図3に本実施例の変形例を示す。図3は、検知器10を追加した場合の流路図である。検出器10は、スプリッター(Sp)を介して検出器9の上流に接続され、各分離カラムからの溶出成分の分子構造を得る。この図3の場合でも、糖鎖合成における作成手順は図2の場合と同様に行える。
図3の構成では、反応生成物の分子構造に関する情報を検出する検知器10を備えたことにより、合成反応が予想通りに行なわれたかどうかを、各反応毎に確認することが可能になる。もし、反応収率が、期待したレベルに到達しない場合は、次の合成反応を中止し、反応試薬と時間の無駄を省くことができると云った効果がある。
尚、本実施例では、各バルブによる流路を切り換えるタイミングとして、検出器9の検出結果を基に切り換える例を示したが、予定された糖の改変処理を行うものであって、予め反応カラムや分離カラムにおける溶出液の通過時間が分かっている場合は、各バルブの切り換えは、検出器9の結果によらずに時間経過によって制御しても良い。
〔実施例2〕
図4は、本実施例のシステム構成図である。
糖鎖合成装置は、ボトル13〜17の各溶媒をそれぞれ一定流量で一定時間送液できる機能を有するポンプ1、2、24〜27(6台)、流路を切り変えるためのバルブ3〜8(6台)、反応生成物を検出する検知器9,10(2台)、そして、これらを制御するコントローラ11により構成されている。本実施例で用いる検知器9,10は、実施例1と同じものである。
図5は、本装置の流路図である。なお、この流路図は、使用する検出器が1台の場合を示している。6台のポンプ1、2、24〜27は、コントローラ11による制御に従ってボトル13〜17の溶液を、一定流量で一定時間それぞれ送液する。実施例1との違いは、糖ヌクレオチド溶液(X1−S1,X2−S2,X3−S3)がそれぞれのポンプ25,26,27で、直接、反応カラム18〜20(R1,R2,R3)に送液されることである。
本実施例では、ポンプ1と2は同じバッファー14を送液するだけとなり、いわゆる低圧グラジエント機能は不要である。また、ポンプ25,26,27が、糖ヌクレオチド溶液(X1−S1,X2−S2,X3−S3)をそれぞれのソレノイドバルブを介さず、反応カラム18〜20に送り込める。このため、ソレノイドバルブの開閉が、ポンプの吸引過程と同期している低圧グラジエント機能と異なり、より正確に、プライマー(P)と糖ヌクレオチド溶液(X1−S1,X2−S2,X3−S3)を送液する時間を制御することが可能になると云った効果がある。
〔実施例3〕
図6は、本実施例のシステム構成図である。
バッファー(B1,B2)14,30をそれぞれ一定流量で一定時間送液できる機能を持ったポンプ2台(ポンプ1,2),プライマー(P)13を流路に導入するサンプルインジェクター28,糖ヌクレオチド溶液(X1−S1,X2−S2,X3−S3)15,16,17を流路に導入するサンプルインジェクター29、流路を切り替えるためのバルブ3〜8(6台)、反応生成物を検出する検知器9,10(2台)、そして、これらを制御するコントローラ11により構成されている。本実施例で用いる検知器9,10は、実施例1と同じものである。
図7は本装置の流路図である。なお、この流路図は、使用する検出器が1台の場合を示している。2台のポンプ1,2は、コントローラ11による制御に従って、バッファー14,30(必ずしもバッファーをポンプごとに備える必要は無く、共通のバッファーを使用することも可能。図7は、その際の例を示す)の溶液を、一定流量で一定時間、それぞれ送液する。実施例1との違いは、プライマー(P),糖ヌクレオチド溶液(X1−S1,X2−S2,X3−S3)がサンプルインジェクター28,29を用いて流路に導入され、反応カラム18,19,20(R1,R2,R3)に、バッファー14(或いはバッファー30)によって送られることである。
本実施例では、ポンプ1,2はバッファー14,或いはバッファー30を送液するだけとなり、いわゆる低圧グラジエント機能は不要である。また、プライマー(P),糖ヌクレオチド溶液(X1−S1,X2−S2,X3−S3)は、必要な量だけサンプルインジェクターを介して、流路に導入される。このため、ソレノイドバルブの開閉が、ポンプの吸引過程と同期している低圧グラジエント機能と異なり、プライマー(P)と糖ヌクレオチド溶液(X1−S1,X2−S2,X3−S3)の無駄な消費を無くすることができると云う効果がある。
〔実施例4〕
図8は、本実施例のシステム構成図であり、図9は流路図である。なお、この実施例において、使用する検出器は1台の場合でも、2台の場合でも良い。また、予め分析時間が既値である場合は、検出器を使用せずに制御しても良い。
実施例3との違いは、それぞれの反応カラムに直列に接続されていた分離カラムおよびバルブを、一本の分離カラムに集約している点である。また、分離カラムに限外ろ過カラム40を使用した点である。
分離カラムを共用化したことにより、本実施例では、バルブ6〜8に代えて、バルブ41が設けられる。
限外ろ過カラム40の構成を図10に示す。限外ろ過カラム40は、内部に円筒状の限外ろ過膜48を有し、更に、導入口45から導入された成分の内、膜を通過しないような大きな分子量の成分を排出する排出口47と、膜を通過した成分を排出する排出口46の二つの排出口を備えている。限外ろ過膜48は、例えば、プライマーは通過せず、糖ヌクレオチドやヌクレオチドは通過するようなものを選択する。プライマーの分子量は、約10、000以上であり、糖ヌクレオチドやヌクレオチドの分子量は約400程度である。そのために、大きさにかなりの差があり、容易に分離可能である。
排出口47の下流には、三方バルブ42が設けられる。このバルブは、検出器側の流路と、何れかの排出口46,47を選択的に連通させるように構成される。連通されない側の排出口はバルブによって流路が遮断されることになる。
この限外ろ過カラム40での分離は、次のように行う。即ち、反応カラムからの溶出液が導入された当初は、三方バルブ42を排出口46側にしておき、限外ろ過膜48を透過したもののみを排出する。分子量の大きなプライマーとプライマーに結合した糖は、限外ろ過膜48内に残される。所定時間経過後、三方バルブ42を排出口47側に切り換えると、限外ろ過膜48内に蓄積されたプライマーとプライマーに結合した糖が検出器側に排出される。
本実施例における動作は、実施例1で示した動作と基本的に共通である。分離カラムが共通化されているが、実施例1におけるバルブ6〜8がドレインに切り替わるタイミングで、バルブ41が点線側の流路に切り換えられることで、分離カラムを共通化しても実施例1と同様の動作を実現することができる。
本実施例においては、分離カラムを共通化したことにより、装置構成を簡易化することができる。また、分離カラムとして限外ろ過カラムを用いることにより、プライマー(P)は、一旦限外ろ過カラム中に濃縮されることになる。従って、実施例1のステップ3で述べたようなプライマー(P)のバンドの拡がりという問題が無くなり、次の反応カラムへの導入が容易になると云う効果がある。
以上説明したように、本発明によれば、複雑な糖鎖合成であっても容易に実行することが可能になる。
産業上の利用可能性
本発明を糖鎖合成装置へ適用すれば、糖鎖の合成、或いは分離を容易に行うことができる。
【図面の簡単な説明】
第1図は、実施例1のシステム構成図である。
第2図は、実施例1の糖鎖合成装置の流路図である。
第3図は、実施例1の変形例である。
第4図は、実施例2のシステム構成図である。
第5図は、実施例2の糖鎖合成装置の流路図である。
第6図は、実施例3のシステム構成図である。
第7図は、実施例3の糖鎖合成装置の流路図である。
第8図は、実施例4のシステム構成図である。
第9図は、実施例4の糖鎖合成装置の流路図である。
第10図は、限外ろ過カラムの構成例を示す図である。
Claims (11)
- 糖転移酵素及び/または糖質加水分解酵素を固定化した一つまたは複数の反応カラムと、
前記反応カラムの下流側に配置され、前記反応カラムからの溶出液中の反応生成物と未反応および副産物を分離する一つまたは複数の分離手段と、
水溶性ポリマーのプライマー及びバッファー溶液を第1の切換バルブを介して前記反応カラムに送液する第1のポンプと、
バッファー溶液及び糖ヌクレオチド溶液を第2の切換バルブを介して前記反応カラムの何れかに送液する第2のポンプと、
前記分離手段下流側の流路と前記各反応カラムの上流側の流路を結ぶ一つまたは複数の循環流路と、
前記分離手段と前記一つまたは複数の循環流路間に配置され、分離手段と任意の循環流路を選択的に連通する第3の切換バルブとを備えたことを特徴とする糖鎖合成装置。 - 請求の範囲第1項において、前記第3の切換バルブには、反応生成物を分取するための分取用流路が接続される糖鎖合成装置。
- 請求の範囲第1項において、前記第1及び第2のポンプは、開閉によって送液を行う複数のソレノイドバルブを有し且つ低圧グラジエント機能を有するポンプであって、前記各溶液が入ったボトルは、それぞれ前記ソレノイドバルブに接続される糖鎖合成装置。
- 請求の範囲第1項において、水溶性ポリマーのプライマー、バッファー溶液、糖ヌクレオチド溶液が入ったボトルごとに、各溶液を前記第1又は第2の切換バルブに送液するポンプを備えた糖鎖合成装置。
- 請求の範囲第1項において、前記第1のポンプと前記第1の切換バルブ間の流路に、水溶性ポリマーのプライマーを導入する第1のサンプルインジェクターを備え、前記第2のポンプと前記第2の切換バルブ間の流路に、糖ヌクレオチド溶液を導入する第2のサンプルインジェクターを備えた糖鎖合成装置。
- 請求の範囲第1項において、前記分離手段の下流に、分離手段からの溶出液を検出する検知器を備え、前記検知器は、屈折率検知器(RI),紫外可視分光検知器(UV),ダイオードアレイ吸光度検知器(DAD)の何れかである糖鎖合成装置。
- 請求の範囲第6項において、前記分離カラムと前記検知器間の流路に、前記流路を分岐するスプリッターを備え、前記スプリッターには、溶出液の分子構造を検出可能な第2の検知器を接続する糖鎖合成装置。
- 請求の範囲第7項において、前記第2の検知器は、ダイオードアレイ吸光度検知器(DAD)、質量分析計(MS)、核磁気共鳴装置(NMR)の何れかである糖鎖合成装置。
- 請求の範囲第1項において、前記分離手段は、ゲルろ過クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、限外ろ過のいずれかである糖鎖合成装置。
- 請求の範囲第1項において、前記反応カラムを複数備え、且つ、各反応カラムの下流に分離手段を備えた場合に、前記各分離手段の下流に、前記分離手段と前記第3の切換バルブを結ぶ流路と、前記分離手段とドレインとを結ぶ流路を選択的に切り換える第4のバルブを備えた糖鎖合成装置。
- 請求の範囲第1項において、前記反応カラムを複数備え、且つ各反応カラムからの溶出液を一つの分離手段に導入する場合に、前記反応カラムと前記分離手段の間に、前記反応カラムと前記分離手段を結ぶ流路と、前記第1のバルブとドレインを結ぶ流路を形成する第1の状態と、前記第1のバルブと前記分離手段を結ぶ流路と、前記反応カラムとドレインとを結ぶ流路を形成する第2の状態を選択的に切り換える第5のバルブを備えた糖鎖合成装置。
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2001200290 | 2001-07-02 | ||
JP2001200290 | 2001-07-02 | ||
JP2002134871 | 2002-05-10 | ||
JP2002134871 | 2002-05-10 | ||
PCT/JP2002/006642 WO2003004597A1 (fr) | 2001-07-02 | 2002-07-01 | Dispositif de synthese de chaines glucidiques |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPWO2003004597A1 JPWO2003004597A1 (ja) | 2004-10-28 |
JP4005557B2 true JP4005557B2 (ja) | 2007-11-07 |
Family
ID=26617957
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2003510756A Expired - Fee Related JP4005557B2 (ja) | 2001-07-02 | 2002-07-01 | 糖鎖合成装置 |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US6962809B1 (ja) |
EP (1) | EP1405905B1 (ja) |
JP (1) | JP4005557B2 (ja) |
DE (1) | DE60218043T2 (ja) |
WO (1) | WO2003004597A1 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2019235542A1 (ja) | 2018-06-07 | 2019-12-12 | 横河電機株式会社 | 光学分析システム及び光学分析方法 |
Families Citing this family (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP4006385B2 (ja) * | 2002-11-20 | 2007-11-14 | 株式会社日立ハイテクノロジーズ | 糖鎖合成装置 |
JP2005278592A (ja) * | 2004-03-31 | 2005-10-13 | Hitachi High-Technologies Corp | 糖鎖精製装置 |
JP4252922B2 (ja) | 2004-03-31 | 2009-04-08 | 株式会社日立ハイテクノロジーズ | 糖鎖合成装置 |
JP4757863B2 (ja) | 2005-02-25 | 2011-08-24 | 三菱電機株式会社 | エレベータ装置 |
JP5344665B2 (ja) * | 2007-09-04 | 2013-11-20 | 国立大学法人広島大学 | アデノシン三リン酸を増幅させるための反応器およびアデノシン三リン酸の増幅方法、並びにその利用 |
KR20230148183A (ko) * | 2021-02-09 | 2023-10-24 | 진콴텀 헬스케어 (쑤저우) 씨오., 엘티디. | 결합 장치 및 결합 화합물을 생성하는 방법 |
Family Cites Families (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4865976A (en) * | 1986-09-10 | 1989-09-12 | Uop | Method of cyclodextrin manufacture using an immobilized cyclodextrin glycosyltransferase |
JPH01174395A (ja) | 1987-12-28 | 1989-07-10 | Natl Food Res Inst | 固定化酵素膜を用いたフラクトオリゴ糖を含有する甘味料の製造法 |
DE69133122D1 (de) | 1990-04-16 | 2002-11-07 | Univ Pennsylvania | Saccharidzusammensetzungen, Verfahren und Apparate zu deren Synthese |
US5583042A (en) * | 1990-04-16 | 1996-12-10 | Neose Pharmaceuticals, Inc. | Apparatus for the synthesis of saccharide compositions |
US5180674A (en) * | 1990-04-16 | 1993-01-19 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Saccharide compositions, methods and apparatus for their synthesis |
JP3105306B2 (ja) | 1991-09-03 | 2000-10-30 | 寳酒造株式会社 | 糖質又は複合糖質の製造方法 |
US5856082A (en) * | 1994-08-31 | 1999-01-05 | University Of British Columbia | Devices and methods for characterizing proteins and peptides |
JP2926173B2 (ja) | 1995-10-06 | 1999-07-28 | 青森県 | モノ及びオリゴガラクツロン酸の製造装置 |
JP4003093B2 (ja) | 1997-07-29 | 2007-11-07 | 東洋紡績株式会社 | 糖類の製造方法 |
JP3614279B2 (ja) | 1997-08-07 | 2005-01-26 | 塩水港精糖株式会社 | ガラクトシルスクロースの製造方法 |
US6329182B1 (en) * | 1997-11-26 | 2001-12-11 | Novozymes A/S | Method of producing oligosaccharide syrups, a system for producing the same and oligosaccharide syrups |
-
2002
- 2002-07-01 WO PCT/JP2002/006642 patent/WO2003004597A1/ja active IP Right Grant
- 2002-07-01 EP EP02743770A patent/EP1405905B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-07-01 DE DE60218043T patent/DE60218043T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2002-07-01 US US10/482,626 patent/US6962809B1/en not_active Expired - Fee Related
- 2002-07-01 JP JP2003510756A patent/JP4005557B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2019235542A1 (ja) | 2018-06-07 | 2019-12-12 | 横河電機株式会社 | 光学分析システム及び光学分析方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US6962809B1 (en) | 2005-11-08 |
EP1405905B1 (en) | 2007-02-07 |
EP1405905A1 (en) | 2004-04-07 |
DE60218043T2 (de) | 2007-09-13 |
JPWO2003004597A1 (ja) | 2004-10-28 |
DE60218043D1 (de) | 2007-03-22 |
EP1405905A4 (en) | 2005-02-02 |
WO2003004597A1 (fr) | 2003-01-16 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Panza et al. | Automated chemical oligosaccharide synthesis: novel approach to traditional challenges | |
Paulsen | Syntheses, conformations and X‐ray structure analyses of the saccharide chains from the core regions of glycoproteins | |
Kröck et al. | Streamlined access to conjugation-ready glycans by automated synthesis | |
Wu et al. | Programmable one-pot glycosylation | |
JP4005557B2 (ja) | 糖鎖合成装置 | |
Ohkura et al. | Structures of the carbohydrate moieties of two monoclonal human. lambda.-type immunoglobulin light chains | |
Kasai | Frontal affinity chromatography: a unique research tool for biospecific interaction that promotes glycobiology | |
JP4006385B2 (ja) | 糖鎖合成装置 | |
Weishaupt et al. | Solid phase synthesis of oligosaccharides | |
Ting et al. | Design of Disaccharide Modules for a Programmable One‐Pot Synthesis of Building Blocks with LacNAc Repeating Units for Asymmetric N‐Glycans | |
Ohtsuka et al. | Synthesis of a library of fucopyranosyl-galactopyranosides consisting of a complete set of anomeric configurations and linkage positions | |
Wang et al. | Synthesis of a GlcNAcylated arginine building block for the solid phase synthesis of death domain glycopeptide fragments | |
Frison et al. | Oligolysine-based saccharide clusters: synthesis and specificity | |
CN100432085C (zh) | 一种寡糖的合成方法 | |
CN109929038A (zh) | Vegf捕获剂融合蛋白的纯化方法 | |
US7883873B2 (en) | Saccharide composition synthesizer | |
Ryan et al. | Solid-phase O-glycosylation with a glucosamine derivative for the synthesis of a glycopeptide | |
Treuheit et al. | HPLC of individual site glycoforms in serum orosomucoid | |
van Dorst et al. | Synthesis of Hex p-(1→ 4)-β-d-Glc pNAc-(1→ 2)-α-d-Man p-(1→ O)(CH2) 7CH3 probes for exploration of the substrate specificity of glycosyltransferases: Part I, Hex= β-d-Gal, 4-deoxy-β-d-Gal, 4-O-methyl-β-d-Gal, 4-deoxy-4-fluoro-β-d-Gal, or β-d-Glc | |
Guberman | Development of Synthetic Strategies to Address Bottlenecks in Glycan Synthesis | |
JP2005287372A6 (ja) | 糖鎖合成装置 | |
Fukase | Combinatorial and solid-phase methods in oligosaccharide synthesis | |
Tsuji et al. | Affinity chromatography of oligosaccharides and glycopeptides with immobilized lectins | |
Martín | Automated Solid-Phase Based Methodologies for the Synthesis of Glycosylated Biomolecules | |
AU2023220538A1 (en) | Complex-type sugar asparagine and method for producing same |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20041207 |
|
RD02 | Notification of acceptance of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7422 Effective date: 20070518 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20070518 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20070821 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20070823 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100831 Year of fee payment: 3 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100831 Year of fee payment: 3 |
|
S111 | Request for change of ownership or part of ownership |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313117 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100831 Year of fee payment: 3 |
|
R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100831 Year of fee payment: 3 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110831 Year of fee payment: 4 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120831 Year of fee payment: 5 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120831 Year of fee payment: 5 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130831 Year of fee payment: 6 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |