CN100432085C - 一种寡糖的合成方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种新的寡糖合成方法，该方法主要包括以下步骤：(a)在不加糖基受体的情况下用促进剂活化糖基供体，该糖基供体的异头碳上连有可活化的糖苷配基且不含裸露羟基，获得活性中间体；(b)向活性中间体中加入保护的糖基供/受体，该糖基供/受体的异头碳上有可活化的糖苷配基且含一个裸露羟基，生成新的糖基供体；(c)重复步骤(a)和(b)，加入目标寡糖组成中下一个所需的保护的糖基供/受体；(d)加入保护的糖基受体，该糖基受体含一个裸露羟基且异头碳上有不可活化的糖苷配基，得到目标寡糖。本发明寡糖合成方法具有步骤简捷、便于监测和收率高等优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种糖的合成方法，尤其涉及一种寡糖的合成方法，属于糖化学领域。
背景技术
在众多的生理过程中糖扮演着重要的角色，比如免疫反应、炎症过程、肿瘤转移以及细菌/病毒感染等等。然而寡糖的合成由于缺乏通用的方法从而极大地阻碍了糖生物学的研究。在过去十年中，已发展了寡糖的液相一釜合成和固相合成方法。一釜合成法是指在同一个反应容器中实现几个糖基化偶联反应，而不用对中间体进行分离。目前的一釜合成法主要将糖基结构模块按异头位活性顺序从大到小的方式顺次加入而得以实现(图1a)。结构模块的活性可以靠糖上的保护基团的不同，也可以靠糖的异头位上的离去基团的不同加以调节。一釜寡糖合成法是糖合成方面的重要进展，它省去了繁杂的中间体纯化操作，使糖的合成步骤更简化。然而，为了调节糖结构模块的反应活性，需要对糖结构模块上的羟基进行广泛的保护基修饰，这使得依赖于结构模块反应活性的一釜合成法的应用受到严重制约。
另一种寡糖的合成方法是固相合成(图1b)。在固相载体上进行寡糖合成的优势也是很明显的：它不需要对中间体进行分离纯化，过程具有自动化的可能性。然而在固相载体上进行糖基化反应的不可预见性以及对反应过程监测的困难，极大阻碍了寡糖固相合成的发展。
因此，发展一个结合了液相一釜合成和固相合成的优点、克服了它们缺点的寡糖合成方法就显得十分必要。
图1.
a)依赖于活性的一釜寡糖合成
b)固相寡糖合成
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种步骤简捷、便于监测、收率高的寡糖合成方法。
本发明所要解决的技术问题是通过以下技术途径来实现的：
本发明是一种寡糖的合成方法，该寡糖包含三个或三个以上的糖基单元，彼此通过糖苷键连接，该寡糖从第一个具非还原端的糖基单元开始，到最后一个具还原端的糖基单元结束，在第一个和最后一个糖基单元之间有一个或多个中间糖基单元按顺序排列，该合成方法包括以下几个步骤：
(a)合成对应于第一个糖基单元的羟基被保护的糖基供体，其异头碳上连有能够被活化的糖苷配基，并且没有裸露的羟基；合成一个或多个分别对应于中间糖基单元的经过保护的糖基供/受体，该糖基供/受体既是糖基供体，同时也是糖基受体，它们既含有在异头碳上能够被活化的糖苷配基，又含有一个裸露的羟基；合成对应于最后一个糖基单元的经过保护的糖基受体，它仅有一个裸露的羟基，在异头碳上没有能够被活化的糖苷配基。
(b)在加入糖基受体前，用促进剂将糖基供体活化，生成活性中间体；
(c)加入一个保护的糖基供/受体，它与活性中间体反应生成一个新的糖基供体；
(d)重复(b)和(c)的操作，将其它的糖基供/受体加入；
(e)加入保护的糖基受体，生成寡糖。
本发明中寡糖的另一种合成方法，包括以下几个步骤：
(a)在加入糖基受体前，用促进剂将保护的糖基供体活化，生成活性中间体。糖基供体对应于第一个糖基单元，其异头碳上连有能够被活化的糖苷配基，并且没有裸露的羟基。
(b)加入一个保护的糖基供/受体，使之与活性中间体反应生成一个新的糖基供体。糖基供/受体对应于一个中间糖基单元，它既含有在异头碳上能够被活化的糖苷配基，又含有一个裸露的羟基。
(c)重复(a)和(b)的操作，将其它的对应于中间糖基单元的糖基供/受体加入；
(d)加入保护的糖基受体，生成寡糖。糖基受体对应于最后一个糖基单元，它仅有一个裸露的羟基，在异头碳上没有能够被活化的糖苷配基。
本发明中寡糖合成方法的另一种表述，包括以下几个步骤：
(e)合成对应于第一个糖基单元的保护的糖基供体；合成对应于各个中间糖基单元的保护的糖基供/受体；合成对应于最后一个糖基单元的保护的糖基受体，糖基受体包括引入一个亲和标记物；
(a)在加入糖基受体前，用促进剂将糖基供体活化，生成活性中间体；
(b)加入一个保护的糖基供/受体，使之与上述活性中间体反应生成一个新的糖基供体；
(c)重复(b)和(c)的操作，将其它的糖基供/受体加入；
(d)加入保护的糖基受体，生成寡糖。该寡糖的还原端连有一个亲和标记物，简化了寡糖的分离纯化。
本发明中寡糖的另一种合成方法，包括以下几个步骤：
(a)通过对不同单糖的保护修饰，合成一系列保护的糖基供体、保护的糖基供/受体和保护的糖基受体，其中糖基供/受体中分别让2-OH、3-OH、4-OH或6-OH裸露，糖基受体中分别让2-OH、3-OH、4-OH或6-OH裸露，并连有一个亲和标记物；
(b)在加入糖基受体前，用促进剂将糖基供体活化，生成活性中间体；
(c)加入一个保护的糖基供/受体，使之与上述活性中间体反应生成一个新的糖基供体；
(d)重复(b)和(c)的操作，将形成第一个寡糖所需要的其它糖基供/受体加入；
(e)加入一个保护的糖基受体，生成第一个寡糖。该寡糖在其还原末端连有一个亲和标记物；
(f)将所生成的寡糖通过亲和标记物连接在高聚物载体上；
(g)重复步骤(b)到(f)，将糖基供体、糖基供/受体、糖基受体采用不同的组合方式生成不同的寡糖，构建寡糖库。
本发明中寡糖的另一种合成方法，包括以下几个步骤：
(a)通过对不同单糖的保护修饰，合成一系列保护的糖基供体、保护的糖基供/受体和保护的糖基受体，其中糖基供/受体和糖基受体中分别让2-OH、3-OH、4-OH或6-OH裸露；
(b)在加入糖基受体前，用促进剂将糖基供体活化，生成活性中间体；
(c)加入一个保护的糖基供/受体，使之与上述活性中间体反应生成一个新的糖基供体；
(d)重复(b)和(c)的操作，将形成第一个寡糖所需要的其它糖基供/受体加入；
(e)加入一个保护的糖基受体，生成第一个寡糖；
(f)重复步骤(b)到(e)，将糖基供体、糖基供/受体、糖基受体采用不同的组合方式生成不同的寡糖，构建寡糖库。
以下通过详细描述，可以更加清楚地看到本发明的众多优势。
本发明的详细描述：
本发明提供了一种通用的重复性一釜寡糖合成法，极大地提高了寡糖的合成速度。合成步骤如图2所示。
本发明对于合成一个由三个或更多个糖基单元通过糖苷键相连构成的寡糖是有用的。该寡糖从第一个在非还原端的糖基单元开始，到最后一个在还原端的糖基单元结束，在第一个和最后一个糖基单元之间有一个或多个中间糖基单元按顺序排列。
图2.重复性一釜寡糖合成
首先是合成各种糖基结构模块。合成对应于第一个糖基单元的保护的糖基供体，合成分别对应于中间糖基单元的一个或多个保护的糖基供/受体，合成对应于最后一个糖基单元的保护的糖基受体。保护的糖基供体，其异头碳上连有能够被活化的糖苷配基，并且没有裸露的羟基；每个保护的糖基供/受体，它们既有在异头碳上能够被活化的糖苷配基，又有一个裸露的羟基；保护的糖基受体，仅有一个裸露的羟基，在异头碳上没有能够被活化的糖苷配基。
以上这些糖基结构模块有可能购买得到，用在以下的合成步骤中。
下一步，在未加入糖基受体的情况下，用促进剂将糖基供体活化，生成活性中间体，活性中间体的异头碳上连有活泼的糖苷配基X’。
所有合适的糖基供体都可以使用，比如从常见的单糖合成的糖基供体。在本发明的一些表述中，糖基结构模块选用的是硫糖苷，这是从硫糖苷、碘糖苷及亚砜糖苷中选取的。
促进剂能够按照化学计量对糖基供体进行活化。在此过程中，任何合适的促进剂都可以被选用。在本发明的一些表述中，亲硫促进剂被用来活化硫糖苷结构模块，比如对甲苯硫基三氟甲磺酸酯(TolSOTf)及其它芳硫基或烷硫基的三氟甲磺酸酯。
糖基供体被促进剂活化后所生成的活性中间体在反应的温度条件下直到下一个糖基结构模块加入之前足够稳定。然而活性中间体在室温(21℃)条件下往往是不稳定的。活性中间体在反应进程的温度条件下又是活泼的，典型的反应进程的温度往往处于-30℃以下。
下一步，向上述反应体系中加入一个保护的糖基供/受体。糖基供/受体与活性中间体反应生成一个新的糖基供体(在糖的还原端有能被活化的糖苷配基X)。原先的糖基供体和糖基供/受体最好含有相同的可被活化的糖苷配基。
如果所要合成的寡糖含有不止一个的中间糖单元，就重复以上两步操作。每一次的重复过程都会添加上一个中间糖基单元。
最后一步，向反应体系中加入保护的糖基受体，生成带有保护基的寡糖。这样整个过程以一釜方式合成所需要的寡糖，从非还原端开始糖链顺序向还原端延伸。其优点是，一釜合成的实现是不依赖于糖基供体和糖基供/受体的异头位的反应活性的。
反应的过程一般都是在液相中完成的，所以反应进程可以方便地用常规方法所监测。
此时得到的寡糖产品仍然带有保护基。因此反应过程通常还包括脱除所有保护基的步骤，得到最后的目标寡糖。保护基可以选择任何合适的方法进行脱除。
由于保护基对于糖基化反应有着很大的影响，因此可以通过选择不同的保护基来为每个特定的糖苷键的连接提供最合适的供体。对于新生成的糖苷键的立体构型，可以通过糖基结构模块2-OH上所连基团的邻基参与作用的有或无来进行控制。在整个的一釜寡糖合成过程中，不需要对中间产物的保护基或糖苷配基做任何的调整。
选择任何合适的方法对寡糖进行纯化，既可以在脱保护之前，也可在其之后。例如，可以用一种合适的过滤方法来纯化寡糖。本发明的优点在于对最终寡糖产物的纯化是整个过程中唯一必要的分离步骤，这样就省去了对中间产物的繁杂的分离过程，从而大大简化了合成步骤。
以下通过实施例来进一步描述本发明的有益效果，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的范围。
具体实施方式
糖基化反应按照参与反应的硫苷供体和硫苷供/受体的性质不同可以分为四类：即活泼的供体(如1-3)和活泼的供/受体(如4，5)，不活泼的供体(如6)和活泼的供/受体，活泼的供体和不活泼的供/受体(如7，8)，不活泼的供体和不活泼的供/受体。通过多次实验，我们建立了一种对这四种情况都通用的实验条件：用对甲苯硫糖苷作为结构模块，用对甲苯硫氯和三氟甲磺酸银反应生成现制现用的化学计量的促进剂对甲苯硫基三氟甲磺酸酯，乙醚作为溶剂，AW300型分子筛作为除水剂。在所有情形中，都得到了不同供体的化学选择性糖基化产物，而跟它们的活性无关。
[实施例1]
在-60℃的温度条件下，向活泼供体1和三氟甲磺酸银(AgOTf)的乙醚溶液中加入1当量的对甲基苯硫氯(TolSCl)，AW300型分子筛作为除水剂，当供体1活化完全后，再加入活泼供/受体4的乙醚溶液，结果以74％的收率得到二糖2，α和β异构体的比例为3.3∶1(表1，序号1)，二糖2的异头位带有对甲苯硫基。二糖2再与供/受体4进行糖基化反应，得到三糖9，收率71％(序号2)。活泼供/受体5直立键上羟基分别与供体1和3反应生成二糖10和11，收率均为66％(序号3和4)。
对甲苯硫基三氟甲磺酸酯(TolSOTf)是一种很强的活化剂，能够化学计量地活化不活泼的供体。不活泼供体6能够顺利地与很活泼的供/受体4反应，得到-异头体二糖12，收率69％(序号5)。没有分离得到供/受体4的自身偶联产物。这种较低活性的供体与较高活性的供/受体进行反活性顺序的选择性糖基化反应，利用传统的活性依赖的一釜法是无法实现的。
亲核性较差的不活泼供/受体进行糖基化反应时，往往由于在反应体系中存在其它的一些亲核性较强的化合物的竞争作用使得糖基化反应的收率降低。为了拓展本方法的应用范围，我们对这类反应进行了尝试。不活泼的供/受体7分别与预活化的活泼的供体1和不活泼的供体6进行糖基化偶联反应，收率分别为72％和67％(序号6和7)。供体1顺利地与亲核性较差的不活泼供/受体8反应得到二糖15，收率65％(序号8)。
表1.硫苷供体化学选择性糖基化反应的结果
aα∶β指的是新生成糖苷键的构型的比例
[实施例2]
图3.一釜寡糖合成
为了验证不依赖于活性的一釜法在多步糖基化反应中的可行性，我们采用在同一反应容器中按顺序依次加入不同的结构模块的方法合成了几种寡糖9，16，17和18(图3)。值得注意的是利用一釜法合成三糖9的收率是66％(图3a)，而分步合成的总收率只有53％(表1，序号1，2)。我们用不同的结构模块6，4，7，19采用一釜法合成得到四糖16，用结构模块3，5，7，20得到四糖17，用结构模块6，7，4，20得到四糖18，总收率分别为68％，55％和48％。因此，一釜合成法不仅省去了对中间体的分离纯化，而且通过纯化步骤的减少提高了反应的总收率。通过一釜法合成的寡糖最终产物，可以很容易地利用硅胶柱层析法得以纯化。
[实施例3]
图4
在本发明的另一个例子中，一个亲和标记物被引入寡糖以简化目标寡糖产物的纯化(图4)。
亲和标记物的引入一般是通过将糖基受体通过其还原端与亲和标记物相连。该过程中可使用任何合适的亲和标记物。在本发明的一些例子中，亲和标记物可被连接到不溶性的聚合物上。例如，叠氮(图4)或酮/醛均可用作亲和标记物。寡糖合成完成后，把不溶性聚合物加入到反应液中，使寡糖连接到聚合物上。任何适于与寡糖连接的不溶性聚合物均可被使用，如含有膦的聚合物。可以以任何合适的方式加入聚合物。例如，在寡糖合成完成后，聚合物可以树脂珠的形式加入并与反应液温育。
在图中所示的例子中，当含有叠氮标记的最后一步糖基化完成后，含有三芳基膦的聚合物被加到反应液中。只有含有叠氮基的化合物(主要是目标寡糖产物)，可以和聚合物上的三芳基膦反应(通过Staudinger反应实现)。在应用酮或醛作亲和标记的例子中，带有酰肼或氨基氧基团的聚合物可被用来简化目标产物的分离操作。
连在聚合物上的寡糖可通过过滤或其它合适的方法从反应液中容易地分离。连有聚合物的寡糖产物分离较单独分离寡糖更为容易。洗掉所有副产物后，寡糖可通过水解从聚合物上切下，并且聚合物可再生。另外，连接在聚合物上的带有保护基的寡糖也可直接脱保护，得到连在聚合物上的脱除保护基的寡糖直接用于对糖结合蛋白和核酸的体外筛选。
[实施例4]
图5.a)葡萄糖和甘露糖结构模 示例.b)寡糖库构建以及与聚合物连接示意图.
在本发明的另一例子中，寡糖库可被构建并连接到聚合物上。因为本发明的寡糖合成过程不需调节糖基供体的活性，对各类型的糖苷键只需一套结构模块。这极大地降低了结构模块制备的复杂性，可以方便地构建寡糖库(图5)。
合成寡糖库的程序的第一步(a)是从不同的单糖合成一套保护的糖基供体，保护的糖基供/受体和保护的糖基受体。它们可以从普通的单糖比如葡萄糖、甘露糖、半乳糖、乙酰氨基葡萄糖和乙酰氨基半乳糖等合成得到。糖基供体/受体分别让2位、3位、4位或6位上的一个羟基裸露，糖基受体带有亲和标记并且让其2位、3位、4位或6位上的一个羟基裸露。
接下来的程序如前所述，只是用不同的糖基结构模块合成不同的寡糖来构建寡糖库。该过程包括以下几步：(b)在不加糖基受体的情况下用促进剂活化糖基供体，获得活性中间体；(c)加入一个保护的糖基供体/受体，使它与活性中间体反应生成新的糖基供体；(d)重复步骤(b)和(c)，加入目标寡糖中下一个所需的保护的糖基供/受体；(e)加入保护的糖基受体，得到第一个目标寡糖；(f)加入聚合物，并与寡糖所带的亲和标记进行连接；(g)用其它的糖基供体、糖基供/受体和糖基受体的组合重复步骤(b)到(f)，合成寡糖库中的其它分子。该方法可应用于各种线性及分支寡糖的合成。
在本发明的另一例子中，寡糖库可被构建。合成寡糖库的程序的第一步(a)是从不同的单糖合成一套保护的糖基供体、保护的糖基供/受体和保护的糖基受体。它们可以从普通的单糖比如葡萄糖、甘露糖、半乳糖、乙酰氨基葡萄糖和乙酰氨基半乳糖等合成得到。糖基供/受体和糖基受体分别让2位、3位、4位或6位上的一个羟基裸露。
接下来的过程如前所述，只是用不同的结构模块来合成不同的寡糖。该过程包括以下几步：(b)在不加糖基受体的情况下用促进剂活化糖基供体，获得活性中间体；(c)加入一个保护的糖基供/受体，使它与活性中间体反应生成新的糖基供体；(d)重复步骤(b)和(c)，加入目标寡糖组成中下一个所需的保护的糖基供/受体；(e)加入一个保护的糖基受体，得到第一个目标寡糖；(f)用其它的糖基供体、糖基供/受体和糖基受体的组合重复步骤(b)到(e)，合成寡糖库中的其它分子。该方法可应用于各种线性及分支寡糖的合成。
可以使用这些结构模块进行组合合成，用这种方法组装的寡糖库可用于寻找蛋白或核酸的糖配体的研究。
总之，本发明提供了一个用重复一釜糖基化方法有效合成寡糖的新途径。不经过任何中间体分离步骤即可以较高产率合成寡糖。并且，它避开了传统的基于活性的一釜合成所必需的大量的保护基调整步骤，有效地节省了结构模块制备的时间。此外，该方法对所有的偶联步骤只需一种单一的糖基化方法，使得寡糖合成更为流水线化。
本发明人用以上首选的例子解释并阐述了本发明操作的原理和方法。但是，应该理解的是，本发明不限于上述专门解释和阐述的范围，它还会有更多的应用。
Claims (9)
1、一种寡糖的合成方法，该寡糖包含三个或三个以上的糖基单元，彼此通过糖苷键连接，该寡糖从第一个具有非还原端的糖基单元开始，到最后一个具有还原端的糖基单元结束，在第一个和最后一个糖基单元之间有一个或多个中间糖基单元按顺序排列，其合成方法包括以下步骤：
(a)合成对应于第一个糖基单元的羟基被保护的糖基供体，该糖基供体异头碳上连有能够被活化的糖苷配基，并且没有裸露的羟基；合成一个或多个分别对应于中间糖基单元的经过保护的糖基供/受体，该糖基供/受体既是糖基供体，同时也是糖基受体，既含有在异头碳上能够被活化的糖苷配基，又含有一个裸露的羟基；合成对应于最后一个糖基单元的经过保护的糖基受体，该糖基受体仅有一个裸露的羟基，在异头碳上没有能够被活化的糖苷配基，
(b)在加入糖基受体前，用亲硫促进剂将糖基供体活化，生成活性中间体，
(c)加入一个保护的糖基供/受体，该糖基供/受体与活性中间体反应生成一个新的糖基供体，
(d)重复(b)和(c)的操作，将其它的糖基供/受体加入，
(e)加入保护的糖基受体，生成寡糖。
2、按照权利要求1中的合成方法，其特征是：所用的糖基单元选自硫苷、碘代糖或糖基亚砜。
3、按照权利要求1中的合成方法，其特征是：步骤(b)中使用化学计量的亲硫促进剂活化糖基供体。
4、按照权利要求1中的合成方法，其特征是：糖基供体和糖基供/受体含有相同的可活化的糖苷配基。
5、按照权利要求1中的合成方法，其特征是：步骤(a)中糖基受体的合成时引入亲和标记物。
6、按照权利要求5中的合成方法，其特征是：所述的亲和标记物选自叠氮基、酮基或醛基。
7、按照权利要求5或6的合成方法，其特征是：将所述的亲和标记物连接到不溶性的聚合物上。
8、按照权利要求7的合成方法，其特征是：所述的不溶性的聚合物含有膦、酰肼或氨基氧基团。
9、一种连有聚合物的寡糖库的合成方法，步骤如下：
(a)从不同的单糖合成一套保护的糖基供体、保护的糖基供/受体和保护的糖基受体，糖基供/受体分别让2位、3位、4位或6位的一个羟基裸露，糖基受体带有亲和标记并且让2位、3位、4位或6位的一个羟基裸露，
(b)在不加糖基受体的情况下用亲硫促进剂活化糖基供体，获得活性中间体，
(c)向活性中间体中加入保护的糖基供/受体，生成新的糖基供体，
(d)重复步骤(b)和(c)，加入目标寡糖组成中下一个所需的保护的糖基供/受体，
(e)加入保护的糖基受体，得到第一个目标寡糖，
(f)加入聚合物，并与寡糖所带的亲和标记进行连接，
(g)用其它的糖基供体、糖基供/受体和糖基受体的组合重复步骤(b)到(f)，合成连有聚合物的寡糖库中的其它分子。
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