JPH01174395A

JPH01174395A - 固定化酵素膜を用いたフラクトオリゴ糖を含有する甘味料の製造法

Info

Publication number: JPH01174395A
Application number: JP33491087A
Authority: JP
Inventors: Atsuo Watanabe; 敦夫渡辺; Mitsutoshi Nakajima; 光敏中嶋; Hiroshi Nabeya; 浩志鍋谷; Toshiaki Kono; 敏明河野; Koji Nishizawa; 耕治西沢
Original assignee: Meiji Seika Kaisha Ltd; National Food Research Institute
Current assignee: Meiji Seika Kaisha Ltd; National Food Research Institute
Priority date: 1987-12-28
Filing date: 1987-12-28
Publication date: 1989-07-10

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（発明の利用分野）本発明は、難う（馬）触性、低カロリー、脂質代謝改善
効果、腸内ビフィズス菌増殖効果を有する甘味料として
使用されているフラクトオリゴ糖を得るための製造法に
関するものである。

（従来の技術および問題点）シュークロースにフラクトース転移作用を有する酵素を
作用させると、フラクトース転移反応の結果、シューク
ロースにフラクトースが１〜４分子結合した３糖類（Ｇ
Ｆ２）、４糖類（ＧＦ３）、５糖類（Ｇｐｓ）　、　６
ｔｌｌｔ類（ＧＦｓ）を含むフラクトオリゴ糖、副生じ
たグルコースおよび少量の未反応のシュークロースを含
有する甘味組成物が生成する。

このフラクトオリゴ糖はう蝕原因菌であるストレプトコ
ッカス・ムタンスの生産するデキストランシュークラー
ゼの基質とはならない難う触性甘味料であり（特開昭５
６−１５４９６７号）、さらに生体内で消化吸収されな
い低カロリー甘味料であること（特開昭５８−４００６
５号）に加えて、腸内ビフィズス菌の選択的増殖因子と
もなり得ること（特開昭５９−５３８３４号）も知られ
ている。

上記のフラクトオリゴ糖製造に用いられるフラクトース
転移作用を有する酵素としては、アスペルギルスウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、オーレオバシデウ
ムの微生物起源の酵素やアスパラガス、キクイモなどの
植物起源の酵素を用いることが知られている（特開昭５
６−１５４９６７号）。

上記の酵素を用いたフラクトオリゴ環の工業的な製法と
しては、上記微生物の菌体、培養液、菌体粉砕物、抽出
・精製酵素などを適当なシュークロース濃度、ｐＨ、温
度条件下て混合し、攪拌しながら反応させる回分方式が
実施されている（特開昭５６−１５４９６７号）。さら
に製造コスト低減を図りアルギン酸カルシウムゲルに微
生物菌体を包括固定化してカラムに充填し、そのカラム
にシュークロースを供給し連続的にフラクトオリゴ環を
得る方法か提案されている（特開昭５０−４１４９７号
）。

（本発明が解決しようとする問題点）しかしながら上記回分方式においては、酵素を１回しか
使用しないためコストか高くなり、また酵素を失活させ
るのに多大なエネルギーを消費し、しかも酵素と生成物
との分離が必要である他、さらに生成物組成の制御は反
応時間で行なうが、酵素を失活させるまで時間遅れかあ
るために厳密な制御は難しいという問題がある。

また酵素固定化物をカラムに充填する方式においては、
単体内部に固定化した酵素への基質の供給が十分でなく
、酵素の有効係数が低いことから反応に長い時間を要し
て、カラム内で微生物汚染を受ける恐れがあるためサニ
タリー性を十分に考慮しなければならない。また工業的
な通液条件例えばシュークロース濃度５０％、５０℃で
カラム通液を行なった場合、供給基質液の粘度が高いた
め圧力損失により多量の動力エネルギーを要するといっ
た問題がある。

（問題点を解決するための手段）そこで本発明らは、上記問題点を解決する目的で、フラ
クトース転移作用を有する酵素を固定化して用いる方法
を鋭意検討したとご己、酵素を共有結合法によって結合
させた固定化酵素膜を用いることにより、フラクトオリ
ゴ環を極めて短時間で生成させることができることを見
出し、本発明を完成させたものである。

物理的吸着法で酵素を固定化した場合には、共有結合法
と比較して著しくその固定量が少なくしか得られず、し
かも酵素が反応中にリークする虞れもある。

而して本発明方法の特徴は、無機多孔質膜にフラクトー
ス転移作用を有する酵素を共有結合法により固定化した
固定化酵素膜を用いるフラクトオリゴ環の製造法であっ
て、シュークロース溶液を加圧濾過させることにより極
めて短時間にフラクトオリゴ環を高含有の甘味料を連続
的に得るところにある。

以下に本発明の詳細な説明する。

大発明に用いられるフラクトース転移作用を有する酵素
としては、例えば後述する実施例において使用したアス
ペルギルス・ニガー（Ａｓｐａｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇ
ｅｒ　ＦＥＲＭ−Ｐ　５８８６）由来の酵素を例示する
ことができるが、特にこれに限定されるものではない。

同微生物を適当な培地、例えばシュークロース５．０％
、ペプトン１．０％、肉エキス０．７％、食塩０．３％
を含有する培地に至適生育温度２５〜３０℃で２４〜９
６時間培養し、培養液中に酵素を生産させ、固定化用酵
素の調整手順としては、上記培養液から濾過、遠心分離
操作などにより菌体を除去した後、限外濾過、硫安塩析
、溶剤沈殿、イオン交換クロマト、ゲル濾過なとの酵素
精製法によって分画精製した高純度の酵素を用いるか、
あるいは上記培養液から同様の操作により分離した菌体
を純水に分散させた後、精密濾過相当の孔径な有する管
状多孔質セラミック膜てその菌体分散液の濾過を行ない
、濾液中に菌体より漏出した酵素を得る方法を例示でき
１．。

酸素の固定化担体である無機多孔質膜は、耐薬品性、耐
圧性、耐熱性、耐久性に優れ、膜の厚みを例えば０．５
〜数ｍｍと自由にコントロールして酵素保持能を犬とす
ることができるものが好ましく用いられる。このような
無機多孔質膜の材質は、本発明においては酵素を共有結
合法により固定化して担持するものであるため、シリカ
を含有している無機多孔質膜例えばシリカ−アルミナ膜
、ガラス膜が好ましく採用される。膜の厚みは特に限定
されないが、酵素の固定化量、強度、取扱いの点などか
ら一般的には０５〜５ｍｍ程度とされるのがよい場合が
多い。

膜の孔径は、酵素の入り込みを許容する孔径が必要とさ
れ、例えば１０ｎｍ以上の孔径が適当とされる。また孔
径が大きすぎると膜内部の酵素の固定化のための比表面
積が小さくなるため、数μｍ以下であることが望ましい
。

無機多孔質膜の形状としては、板状や円筒状内圧式、あ
るいは円筒状外圧式など種々の形状とすることができる
。

この担体として使用できる無機多孔質膜として実用的に
はＴＯＴＯセラミック膜（東向機器社製）、多孔質ガラ
ス膜（伊勢化学社製）などの市販されているものを例示
することができるが、特に限定されるものではない。

前記無機多孔質膜への酵素の固定化法は、例えばまず膜
の水洗を行った後、当該無機多孔質膜のシラン化を行な
うが、その際、通常用いられているシラン化剤を用いる
ことができ、例えばγ−アミノプロピルトリメトキシシ
ラン、γ−アミノプロピルトリエトキシシランの溶液と
当該無機多孔質膜とを接触させる。シラン化操作は、−
船釣には有機溶媒中で行なうがシラン化剤として上記中
のγ−アミノプロピルトリメトキシシランを用いると、
水溶媒中でシラン化することができ溶媒にかかるコスト
を低減できる。当該シラン化剤の濃度としては１〜５％
前後が適当である。次にシラン化処理を行なった膜をジ
アルデヒド化合物の溶液例えばグルタルアルデヒド溶液
に接触させ、シラン化剤の末端のアミノ基にグルタルア
ルデヒドを結合させる。当該グルタルアルデヒド溶液の
濃度としては２〜１０％前後が適当である。以上のよう
な操作で無機多孔質膜を活性化した後、酵素液を当該無
機多孔質膜に通過させることにより固定化を行なうこと
ができる。尚、酵素固定化時のｐＨは３〜８、好ましく
は５〜７が適当であり、また固定化時の温度は酵素の安
定性が十分確保される０〜３０℃の範囲で行なわれ、引
き続き通常０〜３０℃の純水で洗浄して不純物を除去す
ることも可能である。

固定化酵素量は膜の種類によって異なるが上記例示の酵
素の場合単位膜面積あたり５０〜５００単位／ｃｍ２、
好ましくは１５０〜５００車位／ｃｍ２が適当である。

単位膜面積あたりの固定化酵素量については、単体膜面
積あたり　５００単位以上固定化しようとすると、膜の
孔径が小さいものを用い膜内表面積を大とする必要があ
るが、その場合には逆に膜の透過抵抗が大となり、高濃
度シュークロースのような高粘度溶液の透過流速を高く
することができなくなり、したがってフラクトオリゴ環
を含有する甘味料の生産性が低下する。

また、５０Ｊ＃位以下では変換効率が低いため、膜内通
過時間が長くなり効率的ではない。

尚、以下の説明でフラクトース転移作用を有する酵素の
活性測定法および酵素活性の表示法は下記に従った。

マクルベイン（Ｍｃｌｌｖａｉｎｅ）緩衝液（ｐＨ５，
０）２、ＯｍＵに酵素液１＋ｎＱを混合し、２５％（Ｗ
／Ｖ）シュークロース溶液２．Ｏｎ＋ｕ加えて、４０℃
で１時間反応させる。反応の停止は、１０分間の煮沸処
理によって行なう。反応液中に生成したＧＦ２を高速液
体クロマトグラフで定量し、反応液中に１分間で１μｍ
ｏＲのフラクトース転移作用を有する酵素量を１単位と
する。

本発明方法の実施に供される製造装置は、例えは膜モジ
ュールを使用して、一般の膜分離装置と同様に、液温か
３０〜６０℃にコントロールされた１０〜７０％（ｗ　
、７’　ｗ　）濃度、好ましくは３０〜６０（Ｗ／Ｗ）
濃度、ｐＨ５，ｃｌ〜７．５のシュークロース溶ン夜を
、ポンプによりｌｌｉモジュールにクロスフロー濾過方
式て圧力０．１〜２０　Ｋ　ｇ／ｃｍ２、好ましくは０
５〜８　Ｋｇ／ｃｍ２＋加圧濾過させる形式、あるいは
ガス圧により膜モジュールにデッドエンド濾過方式で上
記圧力で加圧濾過させる形式のものとして構成させるこ
とができる。また、さらに膜モジュールと共にその上流
側の前処理装置を設けて装置が構成されるが、別に独立
した前処理装置を用いることもできる。

前記シュークロース溶液の濃度が１０％以下では転移反
応が起きにくく、トータルのオリゴ糖収率が低くなり。

また７０％以上では粘度が非常に高く膜透過流速が低く
なる。

第１図は本発明方法の実施に供される上記クロスフロー
濾過方式の装置例の概要を示したものであり、この図に
おいて１は恒温装置であり、基質を充填した基質タンク
２内の基質温度を所定温度に制御する。この基質タンク
２内の基質は送液７を通りポンプ３を介して、酵素固定
膜を有するモジュール４に送液され、一部は転化された
フラクトオリゴ糖としてプロダクト回収経路８より回収
され、液は循環路９を介して基質タンク２に戻される。

モして送液路７．循環路９の送液状態と圧力状態を流量
計５および圧力計６により検出しながらポンプ３の稼動
を制御して、膜モジュール４に対する基質の送液圧力が
コントロールされる。

第２図は本発明実施に供され別の装置例（ガス圧利用の
デッドエンド方式）の概要を示したものであり、この図
において基質タンク１２にガスボンへ１）からガス圧を
供給して、熱交換器１３を経て膜モジュール１４に基質
を送液し、加圧濾過するようにしている。基質の送液圧
はガスボンベ１）からの供給圧でコントロールされる。

（作　　　用）本発明方法によれば、膜の二次側に得られた透過物中の
フラクトオリゴ糖成分の収率、組成は固定化酵素量とシ
ュークロース溶？ルの暎透過時間を操作圧で調整するこ
とにより、オリゴ糖収率最大６０％（Ｗ／Ｗ）　まで任
意のものを７得ることができる。

（発明の効果）本発明による固定化酵素膜を用いたフラクトオリゴ糖の
製造法は、無機多孔質膜に共有結合法により多重の酵素
を固定化しているため、シュークロース溶液を固定化酵
素膜を通過させてフラクトオリゴ糖を含有する透過液を
得るまでに要する時間か１０秒前後といった極めて短い
時間であり、従来の固定化酵素カラ八方式と比較して生
産性が著しく向上すると共に、サニタリー性の面で極め
て有効であり、さらには脱色、脱塩の操作を軽減できる
ので産業上有利である。

また当該固定化酵素による反応生成物も非固定化酵素の
回分方式によるものとほぼ同等のフラクトオリゴ糖収率
を有し、さらには負荷圧力の調整という簡便容易な操作
によって応答性よく広範囲に変化させることができると
いう効果もある。

従って、本発明方法により工業上極めて有利にフラクト
オリゴ糖を製造できる。

（実　施　例）以下本発明を実施例に基づいて説明するが、これによっ
て本発明が限定されるものではない。

〈実施例１〉（１）酵素の調整アスペルギルスｎｉｇｅｒ　ＦＥＲＭ−Ｐ　５８８６）をブイヨン２％
、シュークロース５％の組成を有する３００ｍＵの培地
に植菌し、２８℃で２４時間培養したものを種母培養液
とした。３０℃ジャーファーメンタ−にシュークロース
１５％、酵母エキス３．６％を含む培地１ｉを入れ、１
２０℃で３０分間殺菌後、上記種母培養液３００Ｊを植
菌し、２８℃で９６時間培養した。通気攪拌条件は、　
４００ｒｐｍ、１５ｆｉ／ｍｉｎであった。培養終了後
、培養液を濾過して菌体を除き、フラクトース転移作用
を有する培養濾液を得た。次にこの培養濾液を限外濾過
膜（分画分子量１００００　）で精製濃縮し、更に塩析
、イオン交換カラム、ゲル濾過カラム、限外濾過、透析
により精製後濃縮し高純度酵素（２０００単位／ｍｇ蛋
白）を得た。

（２）固定化酵素膜の調整東向機器（株）社製の管状シリカアルミナ系多孔質セラ
ミックＩＩｕ（外径１０ｍｍ、内径８ｍｒＬｌ、長さ２
００ｍｍ　）で平均孔径０．５μｍの対称構造の無機多
孔質膜を、予め前述の方法で活性化した後、上記より調
整した約１９０単位／ｍ＋の精製酵素液１℃を１０℃、
ｐ）１６でガス加圧（圧力０．１ＭＰａ）　シ、外圧デ
ッドエンド濾過方式で濾過させた。その際−度透過して
きた液を再度透過させ、同様の操作を３回〜５回繰り返
すことにより固定化率を向上させた。

その結果膜−木あたり１．ＯＸ１０４単位の酵素が固定
された。尚、固定化活性量は調整した酵素液中の全活性
量から最終透過液中に残存した活性量の差より求めた。

（３）フラクトオリゴ糖連続生産第１図の装置を使用して、装置の運転条件を温度５０℃
、ｐ）１８．０　、流速１．５　ｍ／ｓとし、３０％お
よび５０％濃度のシュークロース溶液をクロスフロー濾
過方式で内圧型で加圧濾過させ、上述酵素との接触によ
り転移反応を行わせフラクトオリゴ糖を含有する透過液
を得た。糖組成は高速液体クロマトグラフを用いて測定
した。

以上により行なった結果を表１、表２、および第３図に
示した。表１にフラクトオリゴ糖液（ＣＦ２とＣＦ３の
成分量が等しい組成）を得るための透過流束および固形
分としての生産性を示した。その生産性は０．４０ｔ−
ｍ−２・ｄａｙ−’であった。表２に前記透過流束にお
ける透過物の糖組成を示したが従来の回分方式の場合と
比較して糖組成およびフラクトオリゴ糖含有量に問題は
なかった。

また第３図はシュークロースが膜を通過するのに要した
時間に対しその時点の透過液の糖組成を見たものである
が、この図より操作圧力を制御すること、すなわち透過
流束を制御し、基質の膜内滞留時間を調整することによ
り短時間に、任意の組成をもつオリゴ環の連続生産が可
能である事がわかる。たとえばＣＦ２　　成分がより多
く含まれる透過物を得たいときには、膜内滞留時間を約
４〜５秒に制御すればよいことになる。

また、透過液中には酵素の漏洩は全くなかった。

表−１表−２透過液の糖組成〈実施例２〉（１）酵素の調整上記アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ
ｎｉｇｅｒ　ＦＥＲｈｔ−Ｐ　５８８６）をブイヨン２
％、シュークロース５％の組成を有するｌＯｍＵの培地
に植菌し、２８℃で２４時間培養したものを種母培養ン
夜とした。３℃のジャーファーメンタ−にシュークロー
ス１５％、酵母エキス３．６％を含む培地１．５Ｉｌを
入れ、１２０℃で３０分間殺菌後、上記種母培養液１０
ｍＵを植菌し、２８℃て９６時間培養した。通気攪拌条
件は、　４００ｒｐｍ、ＩＦＪ／ｍｉｎてあった。培養
終了後、培養液を濾過して菌体を分離し、凍結乾燥して
約１８０ｇの菌体を得た。次にその菌体を純水に分散さ
せ０２μｍの孔径を有する対称構造の東向機器（株）社
製の管状多孔質セラミック膜を用いて菌体分散液のクロ
スフロー濾過を行い、菌体から溶出してきた酵素を含有
する透過液約３Ｉｌを得た。尚その透過液には６３車位
／ｍ１の活性があり、その透過液を固定化用の酵素液と
して用いた。

（２）固定化酵素膜の調整東向機器（株）社製の管状シリカアルミナ系多孔質セラ
ミック膜（外径１０ｍｍ、内径８ｍｍ、長さ２００ｍｍ
　）で膜内側緻密層孔径００５μｍ、膜外側支持層孔径
０６５μｍの非対称構造の無機多孔質膜に、上記により
調整した酵素液を実施例１と同様の方法で固定化した。

その結果膜−木あたり４．４　Ｘ　１０３単位の酵素か
固定化された。

（３）フラクトオリゴ糖連続生産第１図の装置を使用して、運転条件を温度５０℃、ｐＨ
６，０、流速１．５ｍ／ｓ、内圧循環とし、上述の酵素
固定化膜に５０％濃度のシュークロース溶液をクロスフ
ロー濾過方式て内圧で加圧濾過させ、転移反応を行わせ
た。

この操作により実施例１と同様にフラクトオリゴ糖を短
時間に連続して生産することができ、生産性は０．０９
ｔ−ｍ−２−ｄａｙ−’であった。

〈実施例３〉（１）酵素の調整実施例１と同様にアスペルギルス・ニガーを培養し、フ
ラクトース転移作用を有する酵素を調整した。

（２）固定化酵素膜の調整東向機器（株）社製の管状シリカアルミナ系多孔質セラ
ミック膜（外径１０ｍｍ、内径８　ｍｍ、長さ２００ｍ
ｍ　）で平均孔径０．２μｍの対称構造の無機多孔質膜
を、予め前述の方法で活性化した後、上記により調整し
た約１９０　ｉ位／ｍ９．の精製酵素液ｉＩＬを１０℃
、ｐＨ６でガス加圧（圧力０．２ＭＰａ）　シ、外圧プ
ツトエンド濾過方式で透過させた。その際−度透過して
きた液を再度透過させ、同様の操作を３回〜５回繰り返
すことにより固定化率を向上させた。その結果膜−木あ
たり１．３ｘｌｏ’単位の酵素が固定化された。尚、固
定化活性量は調整した酵素液中の全活性量から最終透過
液中に残存した活性量の差より求めた。

（３）連続生産運転３０％濃度のシュークロース溶液を、反応運転前処理と
して旭化成（株）社製のホロファイバー型限外濾過膜（
商品名　「ジホモジュへル５ＩＰ−１０１３八分画分子
１６０００）を用い、温度５０℃、ｐＨ６，０、圧力０
．３ＭＰａてクロスフロー濾過を行ない、約６ｋｇの清
澄な供給液を得た。

次に第２図の装置を使用して、基質タンクに上述のシュ
ークロース溶液を入れ、ガス加圧し熱交換器を経て、固
定化酵素膜を温度５０℃、ｐｌ（６，０で透過させ転移
反応を行なわせて透過液中にフラクトオリゴ糖を得た。

その際、実施例１と同様に短時間に安定してフラクトオ
リゴ糖を生産することかでき、その組成にも問題はなか
った。尚、生産性は１．２３ｔ−ｍ−２・ｄａｙ−’　
であった。

〈比較例１〉（１）酵素の調製実施例１と同様にアスペルギルス゛ニガーを培養し、フ
ラクトース転移作用を有する酵素を調製した。

（２）固定化酵素膜の調製東向機器■社製の管状シリカルアルミナ系多孔質セラミ
ック膜　（外径１０ｍｍ、内径８ｍｍ、長さ２００ｍｍ
）で内側緻密層の孔径０１０５μｍ、外側支持層の孔径
０．５μｍの非対称構造の無機多孔質膜を水洗した後、
ただちに約１９０単位／ｍｌの精製酵素液Ｉｋを１０℃
、ｐ）１６、圧力０．２ＭＰａでガス加圧し、外圧デッ
ドエンド濾過方式で透過させた。その際−度透過してき
た液を再度濾過させ、同様の操作を３〜５回繰り返すこ
とにより固定化率を向上させた。その結果膜−本あたり
　１．４Ｘ　１０３単位の酵素が固定化された。尚、固
定化活性量は調製した酵素液中の全活性量から最終透過
液中に残存した活性量の差より求めた。

次に上記固定化酵素膜に純粋的ＩＡを１０℃、ｐＨ６、
圧力０．２ＭＰａでガス加圧し、内圧デッドエンド濾過
方式で透過させ、膜の洗浄を行なったところ、透過液に
０．６Ｘ　１０’単位の酵素が漏出した。

（３）連続生産運転第１図の装置を使用して、運転条件を温度５０℃、ｐｉ
（６，０、流速１．５ｍ／ｓとし、上述の酵素固定化膜
に５０％濃度のシュークロース溶液をクロスフロー濾過
方式で内圧で加圧濾過させ、転移反応を行わせた。

この操作により、反応操作中に徐々に酵素の漏出が観測
され、フラクトオリゴ糖の収率が低減し、長時間にわた
る連続生産は困難で第１図および第２図は本発明の実施
に用いる装置の構成概要を示した図、第３図は実施例１
によってフラクトオリゴ糖を生産したとぎの基質滞留時
間に対する糖組成の関係を示した図である。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）フラクトース転移作用を有する酵素を共有結合法
により固定化した無機多孔質膜に、シュークロース溶液を加圧濾過させることを特徴とする
フラクトオリゴ糖を含有する甘味料の製造法。
（２）フラクトース転移作用を有する酵素がアスペルギ
ルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒＦ
ＥＲＭ−Ｐ５８８６）由来のものである特許請求の範囲
第（１）項記載の甘味料の製造法。
（３）上記無機多孔質膜の単位膜面積に対するフラクト
ース転移作用を有する酵素の量比が５０〜５００単位／
ｃｍ＾２である特許請求の範囲第（１）項記載の甘味料
の製造法。（４）上記無機多孔質膜がシリカ−アルミナ
あるいはガラス材質のものである特許請求の範囲第（１
）項記載の甘味料の製造法。