JPH07222594A - ガラクトオリゴ糖の製造方法 - Google Patents
ガラクトオリゴ糖の製造方法Info
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- JPH07222594A JPH07222594A JP1663894A JP1663894A JPH07222594A JP H07222594 A JPH07222594 A JP H07222594A JP 1663894 A JP1663894 A JP 1663894A JP 1663894 A JP1663894 A JP 1663894A JP H07222594 A JPH07222594 A JP H07222594A
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- lactulose
- galactooligosaccharide
- yeast
- rhodotolura
- lactose
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【構成】 ラクチュロースとラクトースとの混合物に、
ロドトルラ(Rhodotolura) 属に属しラクチュロースから
式(I) で表されるガラクトオリゴ糖を生成する能力を有
する酵母またはその菌体処理物を作用させて式(I) で表
されるガラクトオリゴ糖を製造することを特徴とするガ
ラクトオリゴ糖の製造方法。 【化１】 （式中、ｎは１〜２の整数である） 【効果】 本発明の方法により製造される式(I) で表さ
れるガラクトオリゴ糖は、ビフィズス菌等の特定の腸内
細菌を選択的に増殖させることができるので、本発明に
より、便秘改善剤、整腸剤等の医薬品や機能性食品への
利用が期待できるガラクトオリゴ糖の製造方法を提供す
ることができた。
ロドトルラ(Rhodotolura) 属に属しラクチュロースから
式(I) で表されるガラクトオリゴ糖を生成する能力を有
する酵母またはその菌体処理物を作用させて式(I) で表
されるガラクトオリゴ糖を製造することを特徴とするガ
ラクトオリゴ糖の製造方法。 【化１】 （式中、ｎは１〜２の整数である） 【効果】 本発明の方法により製造される式(I) で表さ
れるガラクトオリゴ糖は、ビフィズス菌等の特定の腸内
細菌を選択的に増殖させることができるので、本発明に
より、便秘改善剤、整腸剤等の医薬品や機能性食品への
利用が期待できるガラクトオリゴ糖の製造方法を提供す
ることができた。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はガラクトオリゴ糖の製造
方法に関するものであり、より詳細には、ロドトルラ(R
hodotolura ) 属に属する酵母を利用してガラクトオリ
ゴ糖を製造する方法に関するものである。
方法に関するものであり、より詳細には、ロドトルラ(R
hodotolura ) 属に属する酵母を利用してガラクトオリ
ゴ糖を製造する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】最近、ラクチュロースの誘導体であるガ
ラクトオリゴ糖のいくつかが、ガラクトシルラクトース
のアルカリ異性化によって得られ、同糖が多くのビフィ
ズス菌には資化されるが、大腸菌を代表とする腸内にお
ける増殖が好ましくない細菌によっては資化されにくい
ために、このようなガラクトオリゴ糖は特定の腸内菌を
選択的に増殖できることが見出されている。
ラクトオリゴ糖のいくつかが、ガラクトシルラクトース
のアルカリ異性化によって得られ、同糖が多くのビフィ
ズス菌には資化されるが、大腸菌を代表とする腸内にお
ける増殖が好ましくない細菌によっては資化されにくい
ために、このようなガラクトオリゴ糖は特定の腸内菌を
選択的に増殖できることが見出されている。
【０００３】このような作用を有するガラクトオリゴ糖
は、医薬原料や便性改良糖としての利用が期待されるた
め、ガラクトオリゴ糖の新規な製造方法のさらなる開発
が強く望まれている。
は、医薬原料や便性改良糖としての利用が期待されるた
め、ガラクトオリゴ糖の新規な製造方法のさらなる開発
が強く望まれている。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明は特定
の酵母を利用したガラクトオリゴ糖の新規な製造方法を
提供することを目的とする。
の酵母を利用したガラクトオリゴ糖の新規な製造方法を
提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、酵母の一
種であるロドトルラ(Rhodotolura ) 属に属する微生物
を用いる反応により数種のガラクトオリゴ糖を製造する
ことに成功し、本発明を完成させるに至った。すなわ
ち、本発明は、ラクチュロースとラクトースとの混合物
に、ロドトルラ(Rhodotolura ) 属に属しラクチュロー
スから式(I) で表されるガラクトオリゴ糖を生成する能
力を有する酵母またはその菌体処理物を作用させて式
(I) で表されるガラクトオリゴ糖を製造することを特徴
とするガラクトオリゴ糖の製造方法を提供するものであ
る。
種であるロドトルラ(Rhodotolura ) 属に属する微生物
を用いる反応により数種のガラクトオリゴ糖を製造する
ことに成功し、本発明を完成させるに至った。すなわ
ち、本発明は、ラクチュロースとラクトースとの混合物
に、ロドトルラ(Rhodotolura ) 属に属しラクチュロー
スから式(I) で表されるガラクトオリゴ糖を生成する能
力を有する酵母またはその菌体処理物を作用させて式
(I) で表されるガラクトオリゴ糖を製造することを特徴
とするガラクトオリゴ糖の製造方法を提供するものであ
る。
【０００６】
【化２】
【０００７】（式中、ｎは１〜２の整数である） 以下、本発明を詳細に説明する。本発明において、出発
物質としてラクチュロースを用いる。ラクチュロースは
市販のものを使用することができ、粉末状、シロップ状
などのいかなる形態のものであってもよい。
物質としてラクチュロースを用いる。ラクチュロースは
市販のものを使用することができ、粉末状、シロップ状
などのいかなる形態のものであってもよい。
【０００８】また、ガラクトース供与体として、ラクト
ースを用いる。ラクトースは、市販のものを使用するこ
とができ、粉末状、シロップ状などのいかなる形態のも
のであってもよい。ラクトースはラクチュロースに対し
て、0.８〜1.２、好ましくは１：１の比率で添加するこ
とができる。ラクチュロースに作用させるロドトルラ(R
hodotolura ) 属に属する酵母は、ラクチュロースから
式(I) で表されるガラクトオリゴ糖を生成する能力を有
するものであれば何れのものでもよいが、例えばロドト
ルラ・マイニュータ（Rhodotolura minuta）が好まし
く、ロドトルラ・マイニュータIFO-879 がより好まし
い。本発明において、上記ロドトルラ(Rhodotolura )
属に属する酵母自体を使用することができるが、これに
代えて、該酵母菌体の処理物を使用することができる。
そして、この処理物としては該酵母菌体の磨砕物、ある
いは、該酵母菌体から分離した粗酵素並びに精製酵素が
あげられる。
ースを用いる。ラクトースは、市販のものを使用するこ
とができ、粉末状、シロップ状などのいかなる形態のも
のであってもよい。ラクトースはラクチュロースに対し
て、0.８〜1.２、好ましくは１：１の比率で添加するこ
とができる。ラクチュロースに作用させるロドトルラ(R
hodotolura ) 属に属する酵母は、ラクチュロースから
式(I) で表されるガラクトオリゴ糖を生成する能力を有
するものであれば何れのものでもよいが、例えばロドト
ルラ・マイニュータ（Rhodotolura minuta）が好まし
く、ロドトルラ・マイニュータIFO-879 がより好まし
い。本発明において、上記ロドトルラ(Rhodotolura )
属に属する酵母自体を使用することができるが、これに
代えて、該酵母菌体の処理物を使用することができる。
そして、この処理物としては該酵母菌体の磨砕物、ある
いは、該酵母菌体から分離した粗酵素並びに精製酵素が
あげられる。
【０００９】上記のロドトルラ(Rhodotolura ) 属に属
する酵母は、反応処理に使用するに先立って、前培養す
ることが好ましい。前培養により、菌体を活性化するこ
とができ、これにより酵母菌の大量を目的とした本培養
を効率的に行うことが可能となる。前培養は、酵母用の
麦芽寒天培地中、好気的条件下で、約３０℃の温度で、
３日間程度行うことができる。
する酵母は、反応処理に使用するに先立って、前培養す
ることが好ましい。前培養により、菌体を活性化するこ
とができ、これにより酵母菌の大量を目的とした本培養
を効率的に行うことが可能となる。前培養は、酵母用の
麦芽寒天培地中、好気的条件下で、約３０℃の温度で、
３日間程度行うことができる。
【００１０】前培養に続いて、Rhodotolura 属に属する
菌株を本培養する。本培養により、大量の菌体を得るこ
とができ、また、菌体の糖利用の活性を高めることがで
きる。本培養は、ホエー液体培地中で、約３０℃の温度
で、８日間程度、約１２０r.p.m の回転速度で振盪培養
により行うことができる。ホエー液体培地を用いると、
ホエーの有効利用および乳糖資化性酵母であるRhodotol
ura minutaのラクトース資化に対する活性化の点で有利
である。上記のホエー培地には、ペプトン、酵母エキ
ス、カザミノ酸などの窒素源等を添加してもよい。この
ような物質を添加することにより、菌体の収量を高める
ことができる。
菌株を本培養する。本培養により、大量の菌体を得るこ
とができ、また、菌体の糖利用の活性を高めることがで
きる。本培養は、ホエー液体培地中で、約３０℃の温度
で、８日間程度、約１２０r.p.m の回転速度で振盪培養
により行うことができる。ホエー液体培地を用いると、
ホエーの有効利用および乳糖資化性酵母であるRhodotol
ura minutaのラクトース資化に対する活性化の点で有利
である。上記のホエー培地には、ペプトン、酵母エキ
ス、カザミノ酸などの窒素源等を添加してもよい。この
ような物質を添加することにより、菌体の収量を高める
ことができる。
【００１１】上記のような本培養の後、遠心分離により
菌体を分離し、生理食塩水、蒸留水等で洗浄して湿菌体
を得ることができる。この湿菌体を用いて、以下の酵素
反応を行うことができる。各々６〜１０重量％のラクチ
ュロースとラクトースとを含有する溶液をｐＨ約2.０〜
約8.０に調整し、望ましくは、この溶液を滅菌した後、
上記のロドトルラ属に属する酵母菌株の湿菌体１０〜２
００ｍｇ（湿重量）／ｍｌ添加し、好気的条件下で、約
２０〜約８０℃で、約１０分〜約５０時間、振盪させな
がらインキュベートすることにより、反応を行うことが
できる。リン酸水素二ナトリウム−クエン酸緩衝液等を
用いて、ラクチュロースとラクトースとの混合溶液のｐ
Ｈを調整することができる。好ましくは、各々６〜１０
重量％のラクチュロースとラクトースとを含有する水溶
液をｐＨ約4.０〜約5.０に調整し、滅菌した後、上記の
Rhodotolura 属に属する菌株の湿菌体４０〜１６０ｍｇ
（湿重量）／ｍｌ添加し、好気的条件下で、約６０℃
で、約２０時間、振盪させながらインキュベートするこ
とにより反応を行う。上記の条件で反応させると、目的
のガラクトオリゴ糖が高い収率で得られる他、約６０℃
という高温で反応を行うことができるため、微生物の汚
染が起こりにくいという利点もある。
菌体を分離し、生理食塩水、蒸留水等で洗浄して湿菌体
を得ることができる。この湿菌体を用いて、以下の酵素
反応を行うことができる。各々６〜１０重量％のラクチ
ュロースとラクトースとを含有する溶液をｐＨ約2.０〜
約8.０に調整し、望ましくは、この溶液を滅菌した後、
上記のロドトルラ属に属する酵母菌株の湿菌体１０〜２
００ｍｇ（湿重量）／ｍｌ添加し、好気的条件下で、約
２０〜約８０℃で、約１０分〜約５０時間、振盪させな
がらインキュベートすることにより、反応を行うことが
できる。リン酸水素二ナトリウム−クエン酸緩衝液等を
用いて、ラクチュロースとラクトースとの混合溶液のｐ
Ｈを調整することができる。好ましくは、各々６〜１０
重量％のラクチュロースとラクトースとを含有する水溶
液をｐＨ約4.０〜約5.０に調整し、滅菌した後、上記の
Rhodotolura 属に属する菌株の湿菌体４０〜１６０ｍｇ
（湿重量）／ｍｌ添加し、好気的条件下で、約６０℃
で、約２０時間、振盪させながらインキュベートするこ
とにより反応を行う。上記の条件で反応させると、目的
のガラクトオリゴ糖が高い収率で得られる他、約６０℃
という高温で反応を行うことができるため、微生物の汚
染が起こりにくいという利点もある。
【００１２】この反応により、ラクチュロースにガラク
トースが転移し、式(I) で表されるガラクトオリゴ糖が
生成する。また、上記の反応は、バイオリアクターを用
いて行ってもよい。バイオリアクターを用いることによ
り、目的のガラクトオリゴ糖を連続生産することが可能
となる。例えば、ロドトルラに属する酵母菌株の菌体
を、担体結合法、架橋結合法、包括法などの公知の方法
を用いて固定化して、上記のような反応を行ってもよ
い。基質であるラクチュロースとラクトースの分子量が
中位であること、固定化操作が容易であることから、担
体結合法を用いることが好ましく、また、透過性が良好
であることから、ホロファイバーに菌体を固定化するこ
とが好ましい。バイオリアクター装置の一例を図３に示
した。図３のバイオリアクター装置を用いて、例えば、
以下のような操作で反応を行うことができる。予め酵母
菌体を基質を含む0.１Ｍクエン酸−リン酸緩衝液に懸濁
し、これをホロファイバーに固定化し、固定化菌体酵素
とした後、６０℃の恒温槽中でホロファイバー内部へ基
質をマイクロチューブポンプを用いて強制的に透過さ
せ、反応を行う。
トースが転移し、式(I) で表されるガラクトオリゴ糖が
生成する。また、上記の反応は、バイオリアクターを用
いて行ってもよい。バイオリアクターを用いることによ
り、目的のガラクトオリゴ糖を連続生産することが可能
となる。例えば、ロドトルラに属する酵母菌株の菌体
を、担体結合法、架橋結合法、包括法などの公知の方法
を用いて固定化して、上記のような反応を行ってもよ
い。基質であるラクチュロースとラクトースの分子量が
中位であること、固定化操作が容易であることから、担
体結合法を用いることが好ましく、また、透過性が良好
であることから、ホロファイバーに菌体を固定化するこ
とが好ましい。バイオリアクター装置の一例を図３に示
した。図３のバイオリアクター装置を用いて、例えば、
以下のような操作で反応を行うことができる。予め酵母
菌体を基質を含む0.１Ｍクエン酸−リン酸緩衝液に懸濁
し、これをホロファイバーに固定化し、固定化菌体酵素
とした後、６０℃の恒温槽中でホロファイバー内部へ基
質をマイクロチューブポンプを用いて強制的に透過さ
せ、反応を行う。
【００１３】上記の反応は、菌体を沸騰水浴上で、５〜
２０分間加熱することにより、また、菌体にメタノール
を添加することにより、停止させることができる。生成
したガラクトオリゴ糖は、常法に従って、分離および精
製することができる。例えば、反応液にエタノールを添
加して除タンパクを行った後、デカンテーションによっ
て得られる上澄液、または、遠心分離により反応液から
菌体を除去した上澄液から、イオン交換樹脂またはゲル
濾過剤によるカラムクロマトグラフ法、活性炭吸着等に
よりガラクトオリゴ糖を分離および精製することができ
る。あるいはまた、さらに、ANALYTICAL BIOCHEMISTRY
162, 325-329 (1987) に記載のアニリン反応を利用した
ガラクトオリゴ糖の精製方法を用いてもよい。簡単に説
明すると、上記のような上澄液に、糖の含量以上の量の
アニリンおよび酢酸を添加し、８０〜１００℃で３０〜
９０分間反応させた後、分液ロート中で水層を酢酸エチ
ルで洗浄する。アルドースはアニリンと反応してシッフ
塩基を形成し、有機溶媒に可溶となるので、酢酸エチル
層に移動するが、ケトースは反応速度が遅いために水層
中に残る。従って、ケトースである式(I) で表されるガ
ラクトオリゴ糖は水層中に残る。水層から酢酸エチルを
蒸発させた後、活性炭を加えて攪拌し、濾過する。濾液
に少量のリン酸二水素ナトリウムを添加して弱アルカリ
性とし、濾液の１／５０〜１／１０の量の陽イオン交換
樹脂を添加し攪拌した後、濾過により陽イオン交換樹脂
を除き、濾液を酢酸エチルで洗浄して、ガラクトオリゴ
糖を含む水溶液を得ることができる。得られた溶液か
ら、結合しているガラクトースの数が異なるガラクトオ
リゴ糖を高純度で分離精製することができる。
２０分間加熱することにより、また、菌体にメタノール
を添加することにより、停止させることができる。生成
したガラクトオリゴ糖は、常法に従って、分離および精
製することができる。例えば、反応液にエタノールを添
加して除タンパクを行った後、デカンテーションによっ
て得られる上澄液、または、遠心分離により反応液から
菌体を除去した上澄液から、イオン交換樹脂またはゲル
濾過剤によるカラムクロマトグラフ法、活性炭吸着等に
よりガラクトオリゴ糖を分離および精製することができ
る。あるいはまた、さらに、ANALYTICAL BIOCHEMISTRY
162, 325-329 (1987) に記載のアニリン反応を利用した
ガラクトオリゴ糖の精製方法を用いてもよい。簡単に説
明すると、上記のような上澄液に、糖の含量以上の量の
アニリンおよび酢酸を添加し、８０〜１００℃で３０〜
９０分間反応させた後、分液ロート中で水層を酢酸エチ
ルで洗浄する。アルドースはアニリンと反応してシッフ
塩基を形成し、有機溶媒に可溶となるので、酢酸エチル
層に移動するが、ケトースは反応速度が遅いために水層
中に残る。従って、ケトースである式(I) で表されるガ
ラクトオリゴ糖は水層中に残る。水層から酢酸エチルを
蒸発させた後、活性炭を加えて攪拌し、濾過する。濾液
に少量のリン酸二水素ナトリウムを添加して弱アルカリ
性とし、濾液の１／５０〜１／１０の量の陽イオン交換
樹脂を添加し攪拌した後、濾過により陽イオン交換樹脂
を除き、濾液を酢酸エチルで洗浄して、ガラクトオリゴ
糖を含む水溶液を得ることができる。得られた溶液か
ら、結合しているガラクトースの数が異なるガラクトオ
リゴ糖を高純度で分離精製することができる。
【００１４】上記のようにして、ｏ−β−Ｄ−ガラクト
ピラノシル−（１→４）−ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノ
シル−（１→４）−Ｄ−フラクトース（式(I) 中、ｎは
１である）およびｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−
（１→４）−ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→
４）−ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→４）−
Ｄ−フラクトース（式(I) 中、ｎは２である）を得るこ
とができる。これらは、以下のような理化学的性質を有
していることから、上記の物質であることが確認でき
る。 〈ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→４）−ｏ−
β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→４）−Ｄ−フラク
トースの理化学的性質〉 分子量：５０４ 溶解性：水に可溶性であるが、ベンゼン、クロロホル
ム、アセトンに難溶である。
ピラノシル−（１→４）−ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノ
シル−（１→４）−Ｄ−フラクトース（式(I) 中、ｎは
１である）およびｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−
（１→４）−ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→
４）−ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→４）−
Ｄ−フラクトース（式(I) 中、ｎは２である）を得るこ
とができる。これらは、以下のような理化学的性質を有
していることから、上記の物質であることが確認でき
る。 〈ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→４）−ｏ−
β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→４）−Ｄ−フラク
トースの理化学的性質〉 分子量：５０４ 溶解性：水に可溶性であるが、ベンゼン、クロロホル
ム、アセトンに難溶である。
【００１５】呈色反応：硝酸銀反応 陰性（−） アンスロン硫酸反応 陽性（＋） ニンヒドリン反応 陰性（−） ビュレット反応 陰性（−） 物質の色：乾燥、粉末化したものはいずれも白色を呈す
る。
る。
【００１６】ＮＭＲ：１００ＭＨｚ 13Ｃ−ＮＭＲ JEOL JNM GSX-400または270(日本電子社製) で測定し
た。溶媒はD2O を用い、化学シフトは内部標準物質とし
てTNS に対するppm 値で示した。結果を図１に示す。下
方の標準品（特開昭６３−２４６３８９に記載の方法に
よって、β−１，４結合ガラクトシルラクトースのアル
カリ異性化によって作製した）のスペクトルと比較し
て、本発明の方法により製造できる三糖のスペクトル
は、７3.９ppm に還元末端フルクトース残基のアノマー
由来のシグナルピークの欠落はあるが、シグナルパター
ンは良く一致している。 〈ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→４）−ｏ−
β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→４）−ｏ−β−Ｄ
−ガラクトピラノシル−（１→４）−Ｄ−フラクトース
の理化学的性質〉 分子量：６６６ 溶解性：水に可溶性であるが、ベンゼン、クロロホル
ム、アセトンに難溶である。
た。溶媒はD2O を用い、化学シフトは内部標準物質とし
てTNS に対するppm 値で示した。結果を図１に示す。下
方の標準品（特開昭６３−２４６３８９に記載の方法に
よって、β−１，４結合ガラクトシルラクトースのアル
カリ異性化によって作製した）のスペクトルと比較し
て、本発明の方法により製造できる三糖のスペクトル
は、７3.９ppm に還元末端フルクトース残基のアノマー
由来のシグナルピークの欠落はあるが、シグナルパター
ンは良く一致している。 〈ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→４）−ｏ−
β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→４）−ｏ−β−Ｄ
−ガラクトピラノシル−（１→４）−Ｄ−フラクトース
の理化学的性質〉 分子量：６６６ 溶解性：水に可溶性であるが、ベンゼン、クロロホル
ム、アセトンに難溶である。
【００１７】呈色反応：硝酸銀反応 陰性（−） アンスロン硫酸反応 陽性（＋） ニンヒドリン反応 陰性（−） ビュレット反応 陰性（−） 物質の色：乾燥、粉末化したものはいずれも白色を呈す
る。
る。
【００１８】ＮＭＲ：１００ＭＨｚ 13Ｃ−ＮＭＲ 結果を図２に示す。下方の標準品（特開昭６３−２４６
３８９に記載の方法において、β−１，４結合ガラクト
シルラクトースに代えて、ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノ
シル−（１→４）−ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−
（１→４）−ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→
４）−Ｄ−グルコースのアルカリ異性化によって作製し
た）のスペクトルと比較して、本発明の方法により製造
できる四糖のスペクトルは、シグナルパターンが良く一
致している。
３８９に記載の方法において、β−１，４結合ガラクト
シルラクトースに代えて、ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノ
シル−（１→４）−ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−
（１→４）−ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→
４）−Ｄ−グルコースのアルカリ異性化によって作製し
た）のスペクトルと比較して、本発明の方法により製造
できる四糖のスペクトルは、シグナルパターンが良く一
致している。
【００１９】式(I) で表されるガラクトオリゴ糖は、ビ
フィズス菌等の特定の腸内細菌を選択的に増殖させるこ
とができるので、便秘改善剤、整腸剤等の医薬品や機能
性食品への利用が期待できる。以下、本発明を実施例に
より具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらに限定
されることはない。
フィズス菌等の特定の腸内細菌を選択的に増殖させるこ
とができるので、便秘改善剤、整腸剤等の医薬品や機能
性食品への利用が期待できる。以下、本発明を実施例に
より具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらに限定
されることはない。
【００２０】
〔実施例１〕ラクチュロースとラクトースの混合物
（１：１）を用いたガラクトオリゴ糖の製法。麦芽寒天
培地（日水製薬）で培養し、５℃冷蔵庫中で保存してあ
ったRhodotolura 属のRhodotorula minuta IFO-879を、
同じ麦芽寒天培地で30℃、３日間前培養した。
（１：１）を用いたガラクトオリゴ糖の製法。麦芽寒天
培地（日水製薬）で培養し、５℃冷蔵庫中で保存してあ
ったRhodotolura 属のRhodotorula minuta IFO-879を、
同じ麦芽寒天培地で30℃、３日間前培養した。
【００２１】脱塩ホエーパウダー（明治乳業から入手）
に水道水を加え５％の濃度とし、これに１Ｎ塩酸を添加
してpH５に調整した。この溶液を沸騰水中で20分加熱し
た後、静置し、沈澱したホエータンパクを除去した。こ
れに0.５％ペプトンを加えて、５％ホエー液体培地とし
た。前培養した菌体一白菌耳を１Ｌの前記液体培地に接
種し、８日間、30℃で振盪培養（120r.p.m.)した。
に水道水を加え５％の濃度とし、これに１Ｎ塩酸を添加
してpH５に調整した。この溶液を沸騰水中で20分加熱し
た後、静置し、沈澱したホエータンパクを除去した。こ
れに0.５％ペプトンを加えて、５％ホエー液体培地とし
た。前培養した菌体一白菌耳を１Ｌの前記液体培地に接
種し、８日間、30℃で振盪培養（120r.p.m.)した。
【００２２】５％ホエー液体培地で培養した後、高速冷
凍遠心機（HITACHI SCR20B）を用いて、培養液を10℃、
7000 r.p.m.で、10分間遠心し、沈殿した菌体を回収し
た。回収した菌体に滅菌生理食塩水を添加し、上記と同
じ高速冷凍機を用いて遠心することにより、菌体を洗浄
する処理を２回繰り返した。このようにして得られた湿
菌体を酵素源として以下の反応に使用した。
凍遠心機（HITACHI SCR20B）を用いて、培養液を10℃、
7000 r.p.m.で、10分間遠心し、沈殿した菌体を回収し
た。回収した菌体に滅菌生理食塩水を添加し、上記と同
じ高速冷凍機を用いて遠心することにより、菌体を洗浄
する処理を２回繰り返した。このようにして得られた湿
菌体を酵素源として以下の反応に使用した。
【００２３】湿菌体14.7ｇにラクトース／ラクチュロー
ス（１：１）（但し、ラクトースは和光純薬一級のもの
を使用し、ラクチュロースは森永乳業から入手した）の
混合基質を16％含有する０.1Ｍクエン酸−リン酸水素二
ナトリウム緩衝液（pH５）100ml を加えて、60℃で46時
間インキュベートした。菌体沈澱による酵素反応の低下
を防ぐため、スターラーによる反応液の攪拌を行なっ
た。反応停止は、10分間沸水浴上で加熱して酵素を失活
させることにより行なった。培養液の一部をメタノール
と水の混合溶媒（１：１ｖ／ｖ）で適当な濃度に希釈し
た溶液を、市販の薄層プレート（pre-coated Silica Ge
l 60 aluminum sheets; Merk) にスポットし、続いて展
開溶媒（酢酸エチル：酢酸：水＝２：１：１）で展開し
た。展開後、ドライヤーで薄層プレートから溶媒を蒸発
させ、５％硫酸−メタノールを噴霧し、１２０℃で数分
間加熱することにより発色させたところ、単糖類、三糖
類、四糖類および五糖類の糖の生成が確認できた。ま
た、発色させた薄層プレートをコピーし、予め面積計算
を行うように設定したDIGITIZER(GRAPHTEC KD4300)でコ
ピー上の糖スポットを忠実にトレースし、計算された面
積値を換算することにより糖の生成量を算出したとこ
ろ、当初のラクチュロースとラクトースの重量を１００
％としたとき、単糖類２９％、三糖類２８％、四糖類７
％、および五糖類１％であった。
ス（１：１）（但し、ラクトースは和光純薬一級のもの
を使用し、ラクチュロースは森永乳業から入手した）の
混合基質を16％含有する０.1Ｍクエン酸−リン酸水素二
ナトリウム緩衝液（pH５）100ml を加えて、60℃で46時
間インキュベートした。菌体沈澱による酵素反応の低下
を防ぐため、スターラーによる反応液の攪拌を行なっ
た。反応停止は、10分間沸水浴上で加熱して酵素を失活
させることにより行なった。培養液の一部をメタノール
と水の混合溶媒（１：１ｖ／ｖ）で適当な濃度に希釈し
た溶液を、市販の薄層プレート（pre-coated Silica Ge
l 60 aluminum sheets; Merk) にスポットし、続いて展
開溶媒（酢酸エチル：酢酸：水＝２：１：１）で展開し
た。展開後、ドライヤーで薄層プレートから溶媒を蒸発
させ、５％硫酸−メタノールを噴霧し、１２０℃で数分
間加熱することにより発色させたところ、単糖類、三糖
類、四糖類および五糖類の糖の生成が確認できた。ま
た、発色させた薄層プレートをコピーし、予め面積計算
を行うように設定したDIGITIZER(GRAPHTEC KD4300)でコ
ピー上の糖スポットを忠実にトレースし、計算された面
積値を換算することにより糖の生成量を算出したとこ
ろ、当初のラクチュロースとラクトースの重量を１００
％としたとき、単糖類２９％、三糖類２８％、四糖類７
％、および五糖類１％であった。
【００２４】次いで、高速冷凍遠心機を用いて、残りの
培養液を15℃、7000r.p.m.で、10分間遠心して菌体を除
去し、上澄液を得た。この上澄液をロータリーエバポレ
ーターにより濃縮し、５倍量のエタノールを加え、静置
し、除タンパクを行なった。次いで、デカンテーション
によって、上澄液を得、これを再度濃縮した後、30ml蒸
留水を加え、試料溶液とした。
培養液を15℃、7000r.p.m.で、10分間遠心して菌体を除
去し、上澄液を得た。この上澄液をロータリーエバポレ
ーターにより濃縮し、５倍量のエタノールを加え、静置
し、除タンパクを行なった。次いで、デカンテーション
によって、上澄液を得、これを再度濃縮した後、30ml蒸
留水を加え、試料溶液とした。
【００２５】上記の試料溶液60mlに、アニリン10mlおよ
び酢酸６ml（モル比１／１）を加え、沸水浴上で１時間
反応させた後、分液ロート中で水層を酢酸エチルで３回
洗浄した。上記と同様にしてＴＬＣで糖の存在を確認し
た後、エバポレーターで水層から酢酸エチルを蒸発さ
せ、次いで活性炭を薬匙大一匙加え、１時間攪拌した。
続いて、濾過を行い、５mlの濾液にリン酸二水素ナトリ
ウム薬匙小一匙加えて弱アルカリ性とした後、陽イオン
交換樹脂( 商品名:Dowex-X2, H+ form、 Dow Chemical
Co.)を薬匙小一匙加えて攪拌した後、酢酸エチルで洗浄
を行ない精製した。
び酢酸６ml（モル比１／１）を加え、沸水浴上で１時間
反応させた後、分液ロート中で水層を酢酸エチルで３回
洗浄した。上記と同様にしてＴＬＣで糖の存在を確認し
た後、エバポレーターで水層から酢酸エチルを蒸発さ
せ、次いで活性炭を薬匙大一匙加え、１時間攪拌した。
続いて、濾過を行い、５mlの濾液にリン酸二水素ナトリ
ウム薬匙小一匙加えて弱アルカリ性とした後、陽イオン
交換樹脂( 商品名:Dowex-X2, H+ form、 Dow Chemical
Co.)を薬匙小一匙加えて攪拌した後、酢酸エチルで洗浄
を行ない精製した。
【００２６】上記のようにアニリン処理した５mlの試料
溶液を濾紙（Whatman ３MMCHR 40×40cm）にバンド状に
スポットし、続いて展開溶媒（酢酸エチル：酢酸：水＝
２：１：１）を用い、展開槽内で三重展開した。展開
後、ケトースに特異的発色試薬のジメドン溶液を噴霧
し、 120℃で10分間加熱発色させたところ、４個のスポ
ットが得られた。次に濾紙を各スポット毎に細片に切断
し、蒸留水で一夜抽出し、抽出液を濾過した後、濾液を
濃縮した。
溶液を濾紙（Whatman ３MMCHR 40×40cm）にバンド状に
スポットし、続いて展開溶媒（酢酸エチル：酢酸：水＝
２：１：１）を用い、展開槽内で三重展開した。展開
後、ケトースに特異的発色試薬のジメドン溶液を噴霧
し、 120℃で10分間加熱発色させたところ、４個のスポ
ットが得られた。次に濾紙を各スポット毎に細片に切断
し、蒸留水で一夜抽出し、抽出液を濾過した後、濾液を
濃縮した。
【００２７】その結果、１９０ｍｇ（収率１４％）のｏ
−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→４）−ｏ−β−
Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→４）−Ｄ−フラクトー
スおよび４０ｍｇ（収率３％）のｏ−β−Ｄ−ガラクト
ピラノシル−（１→４）−ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノ
シル−（１→４）−ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−
（１→４）−Ｄ−フラクトースが得られた。尚、各生成
糖の構造解析は、JEO;JUN GSX-400または270 （日本電
子）を用いた13Ｃ−ＮＭＲにより行った。ｏ−β−Ｄ−
ガラクトピラノシル−（１→４）−ｏ−β−Ｄ−ガラク
トピラノシル−（１→４）−Ｄ−フラクトースおよびｏ
−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→４）−ｏ−β−
Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→４）−ｏ−β−Ｄ−ガ
ラクトピラノシル−（１→４）−Ｄ−フラクトースの13
Ｃ−ＮＭＲスペクトルは、それぞれ、図１および２の上
方に示した。
−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→４）−ｏ−β−
Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→４）−Ｄ−フラクトー
スおよび４０ｍｇ（収率３％）のｏ−β−Ｄ−ガラクト
ピラノシル−（１→４）−ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノ
シル−（１→４）−ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−
（１→４）−Ｄ−フラクトースが得られた。尚、各生成
糖の構造解析は、JEO;JUN GSX-400または270 （日本電
子）を用いた13Ｃ−ＮＭＲにより行った。ｏ−β−Ｄ−
ガラクトピラノシル−（１→４）−ｏ−β−Ｄ−ガラク
トピラノシル−（１→４）−Ｄ−フラクトースおよびｏ
−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→４）−ｏ−β−
Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→４）−ｏ−β−Ｄ−ガ
ラクトピラノシル−（１→４）−Ｄ−フラクトースの13
Ｃ−ＮＭＲスペクトルは、それぞれ、図１および２の上
方に示した。
【００２８】〔実施例２〕バイオリアクターを用いたガ
ラクトオリゴ糖の製法。図３に示す装置を用いて、ガラ
クトオリゴ糖の製造を行った。実施例１と同様の方法で
得られた湿菌体53.5ｇを、８％ラクトース（和光純薬一
級）と８％ラクチュロース（森永乳業から入手）とを含
むpH５の０.1Ｍクエン酸−リン酸緩衝液400ml に懸濁さ
せた後、菌体懸濁液を医療用の赤血球除去用のディスポ
ホロファイバー（Duo-Flux-HF, CD Medical)に添加する
ことにより、菌体を該ファイバーに固定化した。60℃の
恒温槽中において、マイクロチューブポンプ（EYELA)を
用い、ホロファイバー内部に８％ラクトースと８％ラク
チュロースとを含むpH５の０.1Ｍクエン酸−リン酸緩衝
液を流速毎分0.83mlで強制的に透過させることにより、
14時間反応を行なった。反応液をＴＬＣで分析したとこ
ろ、三転移糖が１６ｇ（収率２５％）および四転移糖が
４ｇ（収率６％）生成していることが確認された。この
結果は、本発明により、バイオリアクターシステムによ
るガラクトオリゴ糖の連続生産が可能であることを証明
している。連続生産が可能となることにより、ガラクト
オリゴ糖の大量生産、供給が可能になり、医薬原料、食
品用途へのより一層の拡大が行なわれることが期待でき
る。
ラクトオリゴ糖の製法。図３に示す装置を用いて、ガラ
クトオリゴ糖の製造を行った。実施例１と同様の方法で
得られた湿菌体53.5ｇを、８％ラクトース（和光純薬一
級）と８％ラクチュロース（森永乳業から入手）とを含
むpH５の０.1Ｍクエン酸−リン酸緩衝液400ml に懸濁さ
せた後、菌体懸濁液を医療用の赤血球除去用のディスポ
ホロファイバー（Duo-Flux-HF, CD Medical)に添加する
ことにより、菌体を該ファイバーに固定化した。60℃の
恒温槽中において、マイクロチューブポンプ（EYELA)を
用い、ホロファイバー内部に８％ラクトースと８％ラク
チュロースとを含むpH５の０.1Ｍクエン酸−リン酸緩衝
液を流速毎分0.83mlで強制的に透過させることにより、
14時間反応を行なった。反応液をＴＬＣで分析したとこ
ろ、三転移糖が１６ｇ（収率２５％）および四転移糖が
４ｇ（収率６％）生成していることが確認された。この
結果は、本発明により、バイオリアクターシステムによ
るガラクトオリゴ糖の連続生産が可能であることを証明
している。連続生産が可能となることにより、ガラクト
オリゴ糖の大量生産、供給が可能になり、医薬原料、食
品用途へのより一層の拡大が行なわれることが期待でき
る。
【００２９】
【発明の効果】本発明の方法により製造される式(I) で
表されるガラクトオリゴ糖は、ビフィズス菌等の特定の
腸内細菌を選択的に増殖させることができるので、本発
明により、便秘改善剤、整腸剤等の医薬品や機能性食品
への利用が期待できるガラクトオリゴ糖を提供すること
ができた。また、本発明により、上記のようなガラクト
オリゴ糖の新規な製造方法を提供することができた。
表されるガラクトオリゴ糖は、ビフィズス菌等の特定の
腸内細菌を選択的に増殖させることができるので、本発
明により、便秘改善剤、整腸剤等の医薬品や機能性食品
への利用が期待できるガラクトオリゴ糖を提供すること
ができた。また、本発明により、上記のようなガラクト
オリゴ糖の新規な製造方法を提供することができた。
【図１】図１は、ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−
（１→４）−ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→
４）−Ｄ−フラクトースの13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示
す図である。上方には、本発明の方法により製造された
上記の三糖のスペクトルを、下方には、上記の三糖の標
準品のスペクトルを示した。
（１→４）−ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→
４）−Ｄ−フラクトースの13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示
す図である。上方には、本発明の方法により製造された
上記の三糖のスペクトルを、下方には、上記の三糖の標
準品のスペクトルを示した。
【図２】図２は、ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−
（１→４）−ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→
４）−ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→４）−
Ｄ−フラクトースの13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図で
ある。上方には、本発明の方法により製造された上記の
四糖のスペクトルを、下方には、上記の四糖の標準品の
スペクトルを示した。
（１→４）−ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→
４）−ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−（１→４）−
Ｄ−フラクトースの13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを示す図で
ある。上方には、本発明の方法により製造された上記の
四糖のスペクトルを、下方には、上記の四糖の標準品の
スペクトルを示した。
【図３】図３は、本発明の製造方法に用いることができ
るバイオリアクター装置の概念図である。
るバイオリアクター装置の概念図である。
Claims (3)
- 【請求項１】 ラクチュロースとラクトースとの混合物
に、ロドトルラ(Rhodotolura ) 属に属しラクチュロー
スから式(I) で表されるガラクトオリゴ糖を生成する能
力を有する酵母またはその菌体処理物を作用させて式
(I) で表されるガラクトオリゴ糖を製造することを特徴
とするガラクトオリゴ糖の製造方法。 【化１】 （式中、ｎは１〜２の整数である） - 【請求項２】 ロドトルラ(Rhodotolura ) 属に属する
酵母が ロドトルラ・マイニュータ（Rhodotolura minu
ta）である、請求項１記載のガラクトオリゴ糖の製造方
法。 - 【請求項３】 ロドトルラ・マイニュータ（Rhodotolur
a minuta）がロドトルラ・マイニュータ IFO 879であ
る、請求項２記載のガラクトオリゴ糖の製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1663894A JPH07222594A (ja) | 1994-02-10 | 1994-02-10 | ガラクトオリゴ糖の製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1663894A JPH07222594A (ja) | 1994-02-10 | 1994-02-10 | ガラクトオリゴ糖の製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07222594A true JPH07222594A (ja) | 1995-08-22 |
Family
ID=11921910
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1663894A Pending JPH07222594A (ja) | 1994-02-10 | 1994-02-10 | ガラクトオリゴ糖の製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07222594A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2012115390A3 (ko) * | 2011-02-23 | 2012-12-06 | 건국대학교 산학협력단 | 셀로비오스 2-에피머레이즈 또는 엔아세틸 글루코사민 2-에피머레이즈를 이용한 유당으로부터 락툴로스의 제조방법 |
-
1994
- 1994-02-10 JP JP1663894A patent/JPH07222594A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2012115390A3 (ko) * | 2011-02-23 | 2012-12-06 | 건국대학교 산학협력단 | 셀로비오스 2-에피머레이즈 또는 엔아세틸 글루코사민 2-에피머레이즈를 이용한 유당으로부터 락툴로스의 제조방법 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A02 | Decision of refusal |
Effective date: 20040113 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 |