EA017206B1 - Мультиплексный способ выявления инфекции - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к способу диагностического выявления in vitro инфицирования микроорганизмом, предусматривающему размещение биологического образца в одном аналитическом сосуде, в присутствии частиц, несущих по меньшей мере один специфичный выявляемый физический параметр и принадлежащих по меньшей мере двум различным группам, одна из групп несет иммобилизованное антитело против IgM, а другая группа несет иммобилизованный антиген, полученный из указанного микроорганизма.

Description

Изобретение относится к ίη νίίτο выявлению инфекции инфекционным, в частности вирусным, микроорганизмом.

Изобретение относится к способу одновременного выявления суммарных иммуноглобулинов и иммуноглобулинов М, направленных против одного и того же инфекционного микроорганизма. Настоящее изобретение более конкретно относится к одновременному выявлению суммарных иммуноглобулинов и иммуноглобулинов М, направленных против вируса гепатита человека.

Инфекции, вызванные микроорганизмами, в частности вирусами, такими как, например, вирус гепатита у людей, представляют в большинстве случаев вызывающую опасение проблему со здоровьем, признанную в течение долгого времени, в частности при переливании крови и в диагностике.

В основном для предотвращения бесконтрольного распространения инфекционного агента, в частности вируса гепатита, необходимо определить как можно раньше, заражен ли этим агентом или вирусом образец, полученный от пациента, или мешок для переливания крови. Более того, также важно иметь возможность следить за иммунным статусом пациента на протяжении всей инфекции для того, чтобы определить, начал ли пациент выздоравливать или нет, и, следовательно, применить соответствующие терапевтические шаги и/или иммунизацию, в тех случаях, когда имеет место последнее.

Способы для ίη νίίτο выявления этого типа инфекции чаще всего основаны на выявлении с помощью иммуноанализа (или количественного иммунологического определения) антител, направленных против инфекционных агентов. Иммуноглобулины М (1дМ), которые появляются рано или транзиторно, являются отличительным признаком ранней острой или первичной инфекции. Суммарные иммуноглобулины, группа которых совместно с различными изотипами иммуноглобулинов (1дМ, 1дС и 1дА) являются отличительным признаком хронизации или длительности инфекции на протяжении периода времени, или же фазы выздоровления пациента. Значительное время после острой инфекции суммарные иммуноглобулины состоят преимущественно из 1дС. чтобы поддерживать длительный иммунитет (Но11шдет еί а1., Б1е1йк У1то1о§у, р. 735-785, 1996). По этой причине на протяжении инфекции у пациента важно иметь возможность провести дифференцировку между 1дМ и суммарными иммуноглобулинами. Это самая общая ситуация в серологии ίη νίίτο.

Проблема этого типа, в частности, обнаруживается в случае инфекций, вызванных вирусами гепатита у людей: инфекция вирусом гепатита А, называемым НАУ; инфекция вирусом гепатита В, называемым НВУ, и т.д. Сопоставимая ситуация обнаруживается с другими вирусами крови у людей: НБУ (вирусами простого герпеса), СМУ (цитомегаловирусами), вирусом денге, другими флавивирусами (такими, как вирусом лихорадки западного Нила), вирусом краснухи, вирусом гриппа, У2У (вирус ветряной оспы) и т.д. с различными бактериями (Тгеропета раШйит, ВоттеБа ЬитдйогГеп, т.д.) и с различными одноклеточными паразитами (Тохор1акта допйп, например).

Выявление общих иммуноглобулинов в непрямом формате (взаимодействие образца на твердой фазе, несущей антиген-мишень, затем визуализация меченым антителом против иммуноглобулина человека) уже известно в течение многих лет, среди прочих, с первыми патентами ЕЫБА в 1970-х. Однако этот формат не является предпочтительным, поскольку касается неспецифического взаимодействия, среди прочего, с ревматоидным фактором, потенциально присутствующем в исследуемом образце.

Кроме того, Б.Х. Нет/, еί а1. Сотрапкоп о! ί\\Ό Й|ГГегеп1 епхуте 1ттипоа88ау8 Гог Йе1ее1юп о! ίίοΚЬогпе епсерйаЛБк νίπικ ίη кегит апй сегеЬго8рша1 Πιιίά (1оитпа1 оГ СБшса1 М1сгоЬю1оду, 14: р. 141-146, (1981)), отмечали наличие, в непрямом Е1А анализе (иммуноферментном анализе) для выявления 1дМ, конкуренции между 1дМ и 1дС, которая влияет на чувствительность и специфичность конечного выявления.

Выявление общих иммуноглобулинов с помощью формата двойного антигенного сэндвича (взаимодействие образца, несущего выявляемые иммуноглобулины, с твердой фазой, несущей антиген, затем визуализация вторым антигеном, который детектируемо мечен) известно с 1978 (Маюйш, В. еί а1.; 1оитпа1 оГ 1ттипо1од1са1 МеШойк, 20 (1978), р. 25-34; а также опубликованная французская патентная заявка, БВ 2383446).

Выявление класс-специфичных иммуноглобулинов с помощью формата иммуносорбции само по себе уже известно в течение многих лет. Оно было описано в 1979 г. авторами Энеппеуег XV. еί а1. (1оитпа1 оГ Мей1са1 У1го1о§у 4 (1979): р. 25-32) для специфического выявления анти-НАУ 1дМ с помощью ЕЫБА (также см. патент США 4292403). Принцип этого анализа основан на применении лунок микропланшета, покрытых антителами против 1дМ человека, к которым добавляют образцы крови, содержащие выявляемые 1дМ. После периода инкубирования лунки микропланшета промывали и добавляли антиген НАУ в известном количестве, а затем инкубировали. Наконец, после дополнительной промывки любой антиген, связавшийся с лункой, затем выявляли посредством конечной инкубации, проводимой в присутствии антитела (Б(аЬ')₂), направленного против антигена НАУ и меченного ферментом. В патенте США 4273756 тем же путем описываются класс-специфичные форматы иммуносорбции для выявления 1дА, Ι§Ό, 1дЕ, 1дС и 1дМ, направленных против различных вирусов гепатита (НАУ, НВУ).

В основном и после диагностики, касающейся только НАУ, разумеется, были предприняты попытки, по очевидным причинам стоимости и простоты, разработать способ одновременного выявления ранних 1дМ и поздних 1дС (которые главным образом составляют большинство суммарных иммуноглобу

- 1 017206 линов).

По сообщениям ОШ Меигтап (Эе!ес!юп οί αηΐίνίηΐ 1дМ апйЬоШек апб ίΐ8 ргоЬ1ет8 - А гсу1С\у. в №\ν Оеуе1ортеп!8 ίη ΌίαβηοδίΠ У1го1оду, редактор Ре!ег А. ВасЬтапп, §ргтдег-Уег1ад, ВеШп Не1бе1Ьегд Ыете Уогк 1983) и V. Оиегтеуег (А пе\\' рппс1р1е кот 1Ье бе!ес!юп ок 8ресШс 1дМ апйЬоб1е8 аррБеб ш ап ЕЫ8А ког Ьсра1й18 А) (1оита1 ок Меб1са1 У1го1оду 4 (1979): р. 25-32 - выше), предпринятые попытки требовали много времени и были слишком трудоемкими. Это произошло вследствие того, что предусматривали предварительную стадию разделения различных типов иммуноглобулинов либо зональным ультрацентрифугированием, либо в градиенте сахарозы, или посредством гель-фильтрации, или путем адсорбции 1дО стафилококковым белком А или же с анти-Ес гамма антителом, или же расщеплением 1дМ βмеркаптоэтанолом.

Другой альтернативой является объединение двух различных визуализаций. Апдагапо е! а1. (1оита1 ок Сйшса1 МютоЬю1оду, 1ипе 1984, р. 905-910) предлагает систему для одновременного выявления антиНВс 1дМ и суммарных 1д (главным образом 1дС), называемую КкЕЫБА (радиоиммунный твердофазный иммуноферментный анализ), который объединяет конкурентный радиоиммуноанализ для выявления всех анти-НВс иммуноглобулинов (СОВАВ анализ от АЬЬо!! ЬаЬога1от1е8) с непрямым иммуноанализом ЕЫБА для выявления анти-НВс 1дМ. В двух анализах один и тот же антиген (рекомбинантный антиген НВс) адсорбируют на одной и только твердой фазе (полистироловые бусы, расположенные в лунках), но, с одной стороны, антитело, направленное против антигена НВс и радиоактивно меченное (йод¹²⁵), используют для выявления всех иммуноглобулинов против НВс, а, с другой стороны, ферментативно меченое (пероксидазой) антитело против 1дМ используют для выявления 1дМ против-НВс. Апдагапо е! а1. (выше) указывает, что единственным необходимым моментом является то, что мечение антигенспецифичного антитела должно быть отличным и не должно препятствовать мечению иммуноглобулинкласс-специфичного антитела.

Очевидно, что система Апдагапо е! а1., с ее двумя обязательными различными сигнальными системами (т. е. с двумя детектируемыми метками) является далеко не простой: после первой иммунологической стадии, проводимой одновременно для двух анализов, сигналы должны измеряться отдельно и последовательно сложным способом. В действительности, этот способ начинается с измерения первого радиоактивного сигнала, связанного с твердой фазой, таким образом, отражая титры суммарных антиНВс иммуноглобулинов, а затем на второй стадии меченное пероксидазой антитело против 1дМ добавляют к бусам, затем после инкубирования путем добавления смеси субстрат (Н₂О₂)+хромоген (ОРЭ). После инкубирования и развития окраски эту конечную реакцию останавливают соляной кислотой и измеряют полученную конечную оптическую плотность, которая отражает титры анти-НВс 1дМ.

Кроме того, как может быть отмечено, сложная система Апдагапо е! а1., которая, к ее чести, проводит отчетливую дифференцировку между титрами суммарных иммуноглобулинов против НВс и титрами анти-НВс 1дМ, тем не менее подразумевает, что особые меры предосторожности предпринимаются вследствие рисков, связанных с применением радиоактивных соединений (т.е. иода¹²⁵). Наконец, в методике Апдагапо е! а1. все же требуется прибегать к предварительному устранению влияния ревматоидного фактора (характерно для системы непрямого иммуноанализа, используемой для выявления 1дМ) путем добавления агрегированного нагреванием иммуноглобулина О в буфере для разведения. Все это делает методику Апдагапо е! а1. относительно невыгодной.

Обычно, выявление 1дМ и 1дО, направленных против одного и того же вируса, главным образом, выполняют, проводя два иммуноанализа на отдельных сторонах фаз, так, чтобы избежать какого-либо возможного взаимодействия между двумя иммуноанализами и для получения отчетливо различимых сигналов 1дМ и 1дО.

Таким образом, применение осуществлялось в обычном формате иммуносорбции двух различных твердых фаз, например двух лунок микропланшета в соответствии с Оиегтеуег XV. е! а1. (выше) или двух нитроцеллюлозных полосок в соответствии с методикой УепШте ТесЬпо1од1С8 Ма1ах81е (Мебесте8 е! та1аШе8 тГес!1еи8С8 [Меб1сте8 апб 1пкес1юи8 б18еа8е8], 33, 2003, р. 396-412). Одна покрыта антителами против 1дМ, а другая - антителами против 1дО и образец добавляют в каждый из этих анализов. Таким образом, для этих методик требуется проводить два различных теста, и, следовательно, они являются сравнительно невыгодными.

Более того, можно использовать множество типов методик для выявления иммуноглобулинов с помощью иммуноанализа: помимо ЕЬША и радиоиммуноанализа, упомянутого выше, существуют методики посредством иммунофлуоресценции, иммунолюминесценции, и т. д., в гетерогенной или гомогенной фазе, и т.д. Также существуют методики, основанные на иммуноагглютинации частиц, конечный сигнал которой может быть определен визуально или количественно, используя показывающий прибор, среди прочего, используя инструмент для выявления с помощью проточной цитометрии. Одним из хорошо известных преимуществ измерения проточной цитометрии является то, что представляет собой быстрый и чувствительный способ выявления аналита.

Проточная цитометрия основана на переносе суспензии микрочастиц в виде потока, перед лучом света. Электрооптические сенсоры следят за тем, чтобы отдельная частица в данный момент времени проходила перед лучом света. Сигнал, вызванный резким отклонением луча света при прохождении час

- 2 017206 тицы, затем определяется и записывается.

В патенте США 6872578 В2, в частности, описывается мультиплексная иммуноаналитическая система (т.е. иммуноаналитическая система с одновременным выявлением нескольких аналитов в одном образце). Эта система объединяет в гетерогенном иммуноанализе применение проточной цитометрии и нескольких групп твердых частиц. Эти частицы являются магнитными и каждая имеет специфический детектируемый параметр (т.е. физическую характеристику, например, такую как размер, уникальный цвет или же специфическую флуоресценцию). Каждая группа микрочастиц содержит ряд величин для дифференцирования частиц на несколько неперекрывающихся групп, различаемых способами автоматической детекции, подходящими для рассматриваемых параметров.

Все эти частицы несут связанные с поверхностью различные аналитические реагенты от одной группы к другой. Все частицы одной и той же группы несут одинаковые реагенты. Магнитная характеристика этих частиц позволяет автоматизировать разделения твердой и жидкой фаз во время промывания.

В патенте США 6872578 В2 описывается, среди прочего, пример одновременного выявления антител различных классов иммуноглобулинов (1дС и 1дМ), направленных против антигена вируса краснухи. В этом примере 1дС и 1дМ иммунологически очищены с помощью первой магнитной частицы, сенсибилизированной антигеном, специфичным в отношении определяемых 1дС и 1дМ. После первого инкубирования неспецифические иммуноглобулины удаляются во время промывания. Специфические иммуноглобулины, которые захватываются антигеном, адробированным на частице, затем высвобождаются в супернатант путем добавления уксусной кислоты. Этот супернатант затем переносят в другую пробирку и 1дС и 1дМ анализируют посредством сэндвич-формата, используя фазы и конъюгаты, состоящие из антител против 1дМ человека и против 1дС человека. Эта методика является трудоемкой, поскольку требуется предварительная обработка образца, чтобы сохранить только антиген-специфичные 1д.

Также можно использовать, так же, как и систему МиШтейтх Вотгейа 1дС- ог 1дМ-а88ау от компании МиШтейтх СшЬН (Не1бе1Ьетд, Сетшаиу), смесь частиц, покрытых различными рекомбинантными антигенами Вотгейа, и дифференциальное выявление 1дМ и 1дС посредством непрямого формата, используя анти-1дС антитела и анти-1дМ антитела, меченные флуоресцентной меткой (фикоэритрин). Флуоресценцию конечного комплекса каждой бусины измеряют проточной цитометрией, используя анализатор, от компании Ьитшех Сотротайоп. Стадии промывания не требуется, что делает это исследование упрощенным иммуноанализом. Однако протокол требует наличия нескольких реакционных пробирок и нескольких реактивов, продаваемых в различных наборах. Эта система представлена, согласно полученной коммерческой брошюре, как чувствительная и надежная. Принцип выявления анти-ЕВУ 1дС и 1дМ антител на Вюр1ех 2200®, описанный в публикации К1ий8 е1 а1. (1оитпа1 о! Сйшеа1 М1етоЬю1о§у, ЫоуетЬет 2004, р. 4996-5000), является идентичным. Как описано выше, требуется два различных реактива и иммунологические реакции проводят в двух различных реакционных пробирках. В этих двух ЕВУ исследованиях используют смесь частиц, покрытых различными антигенами ЕВУ, и дифференциальное выявление 1дМ и 1дС посредством непрямого формата, используя анти-1дС антитела и анти-1дМ антитела, меченные флуоресцентной меткой (фикоэритрином), используя два различных набора. Флуоресценцию конечного комплекса каждой частицы измеряют проточной цитометрией, используя детектор от компании Ьитшех Сотротайоп.

Таким образом, существует реальная потребность в способе, который является простым для выполнения, быстрым, чувствительным, специфичным, количественным или полуколичественным и воспроизводимым и который может быть автоматизирован - в целях скрининга на всем протяжении инфекционного процесса, а также в период пре- и постиммунизационного контроля - для выявления и дифференцирования 1дМ и общих иммуноглобулинов (суммарных 1д), полностью одновременно, т.е. используя один и единственный предварительно необработанный образец, в одном и единственном сосуде для исследования, в том же числе инкубаций, используя систему одиночного сигнала, и в одном и единственном времени считывания сигнала.

Краткое изложение сущности изобретения

Таким образом, авторы настоящего изобретения постарались решить изложенную выше проблему, для этого, чтобы разработать альтернативный способ одновременного выявления 1дМ и общих иммуноглобулинов, направленных против одного и того же антигена в одном единственном сосуде, и используя один единственный биологический образец, предпочтительно предварительно не обработанный.

Таким образом, объектом настоящего изобретения является способ диагностического выявления инфекции микроорганизмом ίη νίΙΐΌ. предусматривающий одновременное выявление иммуноглобулинов О или суммарных иммуноглобулинов и иммуноглобулинов М, направленных против указанного микроорганизма, присутствующего в биологическом образце, указанный способ включает следующие стадии:

a) размещения биологического образца в одном аналитическом сосуде в присутствии частиц, несущих по меньшей мере один специфически выявляемый физический параметр и принадлежащих по меньшей мере двум различным группам, одной из групп, несущей иммобилизованное антитело против 1дМ, и другой группе, несущей иммобилизованный антиген, полученный из указанного микроорганизма;

b) инкубирования смеси в условиях, дающих возможность образованию иммунокомплексов на ка- 3 017206 ждой группе частиц;

с) элиминации иммуноглобулинов, которые не связались с частицами;

ά) инкубирования смеси со стадии Ь) по меньшей мере с одним меченым конъюгатом, указанным по меньшей мере одним конъюгатом, состоящим исключительно из детектируемого антигена, полученного из указанного микроорганизма;

е) элиминации детектируемого антигена, несвязавшегося с иммунокомплексами со стадии Ь);

Г) одновременного выявления, с помощью детектора, способного различать две группы частиц, упомянутых выше, иммунокомплексы со стадии ά) на каждой частице, посредством чего обнаруживается наличие или отсутствие иммуноглобулинов С или суммарных иммуноглобулинов и/или иммуноглобулинов М, направленных против указанного микроорганизма.

В соответствии с особым вариантом осуществления группы указанных частиц отличаются одна от другой с помощью флуорохромов, выявляемых подходящим детектором.

Предпочтительно подходящий детектор связан с проточным цитометром.

Мечение детектируемого антигена может быть прямым или опосредованным. Например, детектируемый антиген может нести биотин, который определяется добавлением меченного авидина или стрептавидина.

Предпочтительно микроорганизм представляет собой вирус человека, в частности вирус гепатита человека.

Объектом изобретения также является диагностический набор или комплект реактивов для проведения способа выявления, содержащий, в частности, частицы, несущие по меньшей мере один специфически выявляемый физический параметр и принадлежащие по меньшей мере двум различным группам, одной из групп, несущей иммобилизованное антитело против 1дМ, и другой группе, несущей иммобилизованный антиген, полученный из детектируемого микроорганизма.

Подробное описание изобретения

Для решения указанной проблемы авторы изобретения прежде всего провели мультиплексный анализ для одновременного выявления в одном сосуде анти-НАУ 1дС и 1дМ в образце (сыворотке или плазме), объединяя два формата путем иммунологического захвата (см. подробное описание протокола и результаты в экспериментальной части, сравнительный пример 1 и аналитические форматы на фиг. 1):

первый с суперпарамагнитными частицами, несущими антитела против 1дС человека;

второй с суперпарамагнитными частицами, несущими антитела против 1дМ человека.

После инкубирования (захвата 1дС и 1дМ образца и образования первых иммунных комплексов) и первого промывания добавляют антиген НАУ. После второго инкубирования антиген НАУ (Ад НАУ) был связан с двумя типами образованных иммунных комплексов.

После второго промывания две реакции выявляли путем добавления моноклонального антитела против НАУ (МаЬ), соединенного с флуорохромом (фикоэритрином, обозначенным РЕ). После инкубирования этого конъюгата и третьего промывания сигнал считывали с помощью проточной цитометрии с каждой частицы. Результаты для 1дМ и 1дС получали отдельно посредством считывания сигналов двумя соответствующими пучками лазерного излучения проточного цитометра.

Выявление 1дМ достигало приемлемой чувствительности даже при низких концентрациях, что представляет вполне обычную ситуацию после НАУ инфекции.

Чувствительность выявления 1дС была, с другой стороны, явно недостаточной, в этой конфигурации, вследствие большой природной распространенности 1дС (все антигенные специфичности включены) в образце. Действительно, анти-1дС суперпарамагнитные частицы очень быстро насыщались 1дС, неспецифичными для НАУ, присутствующими в образце, и они больше не захватывали достаточно антиНАУ 1дС, особенно при низких концентрациях анти-НАУ 1дС. В результате это приводит к недостаточной аналитической чувствительности.

Это в точности случай при выявлении суммарных анти-НАУ иммуноглобулинов, для которых существует порог клинической чувствительности, необходимый для антител против НАУ в контексте последующей постиммунизационной защиты. Этот защитный порог был фиксирован, по общему согласию, на значении 20 мМЕ/мл в отношении анти-НАУ стандарта ВОЗ (97/646). Ниже этой величины индивидуум не защищен; выше этой величины титр 1дС является достаточным для обеспечения защиты индивидуума против вируса.

Таким образом, авторы настоящего изобретения создали другие аналитические форматы для решения этой проблемы недостаточной 1дС чувствительности, описанной в приведенном выше исследовании.

Совершенно неожиданно, авторы настоящего изобретения показали, что мультиплекс, объединяющий два формата, описанный далее в примере 2 (см. подробное описание протокола и результаты в экспериментальном разделе примера 2 и аналитические форматы на фиг. 2), способен одновременно выявлять в одном сосуде низкие концентрации 1дС, не снижая чувствительности выявления 1дМ, и, более того, делает возможным дифференцировать полностью чувствительным и специфичным образом антиНАУ 1дМ антитела и суммарные анти-НАУ иммуноглобулины.

Таким образом, указанный способ для одновременного выявления в одном сосуде анти-НАУ 1дС и

- 4 017206

1дМ в образце (сыворотке или плазме) [способ, который, следовательно, представляет собой способ по настоящему изобретению] объединяет два аналитических формата (аналитический форма ловушки для иммуноглобулинов по Онсгшсусг XV. с1 а1., для 1дМ и аналитический формат двойного антигенного сэндвича по Маюйш Я. с1 а1., для 1дО):

первый с суперпарамагнитными частицами, несущими антитела против 1дМ человека, второй с суперпарамагнитными частицами, несущими иммобилизованный антиген НАУ.

После инкубирования (захвата 1дС и 1дМ из образца и образования первых иммунных комплексов) и первого промывания добавляют биотинилированный антиген НАУ. После второго инкубирования антиген НАУ связывается с двумя типами образованных комплексов.

После второго промывания две реакции проявляют путем добавления стрептавидина, соединенного с флуорохромом (фикоэритрином). После инкубирования и промывания сигнал считывают с помощью проточной цитометрии на каждой частице. Результаты для 1дМ и 1дС получают отдельно посредством считывания сигналов двумя соответствующими пучками лазерного излучения проточного цитометра.

Настоящее изобретение, результатом которого является чувствительное и дифференцированное выявление анти-НАУ 1дМ и суммарных 1д, является совершенно неожиданным: поскольку существовал высокий риск, с объединением в одном сосуде двух форматов в соответствии со способом по настоящему изобретению, что могла быть конкуренция за анти-НАУ 1дМ образца между иммобилизованным антигеном НАУ и иммобилизованным анти-1дМ антителом. Другими словами, вследствие одновременного выполнения описанных выше двух форматов в одном и том же сосуде существовал риск того, что некоторые из анти-НАУ 1дМ образца будут захвачены (как показано заштрихованной стрелкой на фиг. 2) суперпарамагнитными частицами, несущими антиген НАУ, используемыми именно для захвата 1дС. и больше не будут выявлены как 1дМ. Такая конкуренция неизбежно привела бы к полностью непригодному выявлению 1дМ ответа (недостаточной чувствительности) и, следовательно, к невозможности выявлять 1дМ на раннем этапе. Специалисты в данной области целиком и полностью осознали бы размер этого риска и, следовательно, очевидно отговорили бы от внедрения этого сочетания (мультиплекса) в соответствии с настоящим изобретением.

Авторы настоящего изобретения аналогично использовали мультиплексный способ по настоящему изобретению для одновременного выявления антител 1дС и 1дМ, направленных против капсида вируса гепатита В (выявление НВ ядерных 1дС и 1дМ антител). В этом отношении см. экспериментальный раздел, пример 3, и аналитические форматы на фиг. 3.

Исходя из этого, авторы изобретения предлагают способ общего выявления 1дС и 1дМ в мультиплексном формате, который может быть приспособлен для многих микроорганизмов, для которых это имеет большое значение с диагностической точки зрения, для выявления 1дС и 1дМ.

В разделе, приведенном ниже, представлено несколько определений, используемых для понимания настоящего изобретения.

Определения.

В контексте настоящего изобретения биологический образец предпочтительно состоит из биологической жидкости, такой как кровь, плазма, сыворотка, моча, спинно-мозговая жидкость, слюна и т.д., предпочтительно образец представляет собой плазму или сыворотку. Исследуемый образец предпочтительно получен от человека, но также может происходить от животного, для которого необходимо выявление микробиологической инфекции.

Термин мультиплексное выявление относится в контексте настоящего изобретения к одновременному выявлению по меньшей мере двух типов антител, направленных против одного и того же или нескольких инфекционных микроорганизмов и выбранных из группы, состоящей из иммуноглобулинов М, О, А, Ό и Е и суммарных иммуноглобулинов в крови.

Термин антитело относится к любому целому антителу или функциональному фрагменту антитела, содержащему или состоящему по меньшей мере из одного сайта соединения с антигеном, позволяющего указанному антителу связываться по меньшей мере с одной антигенной детерминантой антигенного вещества. В качестве примера фрагментов антитела можно упомянуть фрагменты ЕаЬ, ЕаЬ' и Е(аЬ')₂, а также цепи всЕу (одноцепочечный вариабельный фрагмент), цепи ά&Ρν (двухцепочечный вариабельный фрагмент) и т.д.; эти функциональные фрагменты, в частности, могут быть получены методами генной инженерии.

Термин антигенный фрагмент или антиген означает весь или часть природного или рекомбинантного белка инфекционного микроорганизма, такого как вирус гепатита А, способный индуцировать синтез антител у зараженного пациента или у иммунизированного животного.

В частности, выражение антиген, полученный из микроорганизма для иммобилизации или выявления означает любой антиген, выбранный из группы, состоящей из лизата указанного микроорганизма, одного из его природных антигенов, который был полуочищен или очищен, рекомбинантного белка, его фрагмента или синтетического пептида.

Термин иммобилизованный антиген означает антигенный фрагмент, присоединенный к твердой фазе, который может распознаваться антителами, направленными против микроорганизма, такими как анти-НАУ антитела, и позволяющий аффинно связываться с последними.

- 5 017206

Термин иммобилизованное антитело означает антитело или часть антитела, присоединенное к твердой фазе, способное удерживать по меньшей мере одну антигенную детерминанту антигенного соединения, находящегося в биологическом образце, путем аффинного связывания.

Анти-1дМ иммобилизованные антитела и иммобилизованные антигены могут быть присоединены к частицам с помощью любой подходящей методики. Они могут быть присоединены непосредственно ковалентно, или нековалентно, в частности, посредством аффинности. Непосредственное ковалентное присоединение может осуществляться путем активации карбоксильных групп, находящихся на частицах, включая связывание через гидроксисукцинимид или карбодиимид, например.

Термин детектирующий антиген означает меченый антиген, который дает возможность либо выявлять антитела 1дМ с помощью способа иммунологического захвата, либо выявлять антитела 1дС с помощью традиционного сэндвич-способа антиген-антитело-антиген, также называемого способом двойного антигенного сэндвича (МаюНш е! а1. (1978)). Детектирующий антиген может быть идентичным иммобилизованному антигену или отличаться от него.

Термин меченый относится как к прямому мечению (посредством флуорохромов, люминесцентных соединений и т.д.), так и к непрямому мечению (например, посредством антител или антигенов, самих непосредственно меченых, или используя реагенты меченой пары аффинности, например, но не исключительно, меченой авидин-биотиновой пары и т.д.).

Получение моноклональных антител или поликлональных антител, которые могут быть использованы в контексте настоящего изобретения, является результатом общепринятых методик.

Моноклональные антитела могут быть получены в соответствии с общепринятым способом слияния лимфоцитов и гибридомной культуры, описанной КоЫет и Μίΐκίοίη (Ыа!иге, 256, р. 495-497(1975)). Также известны другие способы получения моноклональных антител (Наг1о\у е! а1. еййогк, АпйЬоШек А ЬаЬога!оту Мапиа1, Со1й 8рпп§ НагЬог ЬаЬога!оту (1988)). Моноклональные антитела могут быть получены путем иммунизации млекопитающего (например, мыши, крысы, кролика или даже человека и т.д.) и путем использования методики слияния лимфоцитов, которые продуцируют гибридомы (КоЫет и М118!еш, 1975, выше).

Существуют методики, альтернативные этой общепринятой методике. Например, моноклональные антитела могут быть получены путем экспрессии нуклеиновой кислоты, клонированной из гибридомы. Антитела также могут быть получены с помощью технологии фагового дисплея, путем введения в векторы кДНК антител, которые обычно представляют собой нитевидные фаги (например, Еи§е5 для Е.сой, 8со11 е! а1. (8с1епсе, 249, р. 386-390 (1990)). Последние составляют библиотеки и демонстрируют на своей поверхности фрагменты ксЕу. Протоколы для конструирования этих антительных библиотек описаны у Матке е! а1. (1991) (1. Мо1. Бю1., 222, р. 581-597 (1991)).

Поликлональные антитела могут быть получены из сыворотки животного, иммунизированного против антигена пептидной природы, в соответствии с обычными протоколами.

В основном полипептид, в частности рекомбинантный полипептид, или олигопептид, может быть использован, например, в качестве иммуногена. В соответствии со стандартным протоколом кроликов иммунизируют эквивалентом 1 мг пептидного иммуногена в соответствии с процедурой, описанной ВепоП е! а1. [ΡΝΑ8 И8А, 79, р. 917-921 (1982)].

Животным вводят инъекции 20,0 мкг антигена с четырехнедельными интервалами и берут кровь спустя 10-14 дней. После третьей инъекции оценивают способность антисыворотки связываться с антигенным пептидом, меченным йодом, полученным с помощью способа хлорамин-Т. Затем очищают с помощью хроматографии на ион-обменной колонке, состоящей из карбоксиметилцеллюлозы (СМС). Молекулы антитела, собранные путем элюции, затем доводят до желаемой концентрации, способами, хорошо известными специалистам в данной области, например, используя ΌΕΑΕ 8ерйабех для получения фракции 1дС.

Термин частицы означает любые частицы, предпочтительно приблизительно сферической формы (затем их в основном называют бусами), имеющие размеры, которые могут быть от 0,3 до 100 мкм в диаметре, предпочтительно от 0,5 до 40 мкм. Такие частицы производятся, например, компаниями Ьитшех, Мегск или Эупа1.

Частицы предпочтительно состоят из полимеров, которые являются инертными в отношении составляющих биологических образцов; они являются твердыми и нерастворимыми в образцах. Используемые полимеры могут представлять собой сложные полиэфиры, простые полиэфиры, полиолефины, полиамиды, полисахариды, полиуретаны или целлюлозы. Также могут быть использованы связующие для придания частицам целостности и структуры.

Функциональные группы могут быть включены с этими полимерами для того, чтобы дать возможность для присоединения или соединения макромолекул, представляющих биологический интерес (белков, липидов, углеводов, нуклеиновых кислот). Эти функциональные группы, известные специалистам в данной области, могут представлять собой аминные функциональные группы (-ΝΗ₂) или аммонийные функциональные группы (-ΝΗ³⁺ или -ΝΚ³⁺), спиртовые функциональные группы (-ОН), карбоксильные функциональные группы (-СООН) или изодианатные функциональные группы (-Ν0Ό). Мономеры, наиболее часто используемые для введения функциональных групп СООН в полиолефины, представляют

- 6 017206 собой акриловую кислоту или метакриловую кислоту.

Присоединение реактивов к поверхности частиц можно осуществлять с помощью электростатического притяжения, аффинных взаимодействий, гидрофобных взаимодействий или ковалентного присоединения. Ковалентное присоединение является предпочтительным.

Частицы, используемые в настоящем изобретении, могут различаться тем, что они несут специфические детектируемые физические параметры, т.е. дифференциальные маркеры для того, чтобы отличить их друг от друга с помощью проточной цитометрии. Предпочтительно используют по меньшей мере два типа различных меток или параметров. Например, частицы могут быть пропитаны одним или несколькими красителями (например, флуоресцентным, люминесцентным и т.д.), когда это целесообразно, с различными концентрациями, или меткой радиоизотопного, ферментного и т.д. типа (УепкаЬакиЬЬагао 8. Мюгоаггау8-81а1и8 апб ргокресЬ Тгепбк ίη Вю1ес11по1оду Эес 2004, 22 (12): 630-637; Могдап е1 а1. Су1оте1пс Ьеаб аггау: а ти1бр1ехеб аккау ркиГогт νίίΐι аррйсабопк ίη уапоик агеак о! Ью1оду, С1т. 1ттипо1. (2004), 100:252-266). Альтернативно, могут быть использованы частицы различных размеров.

В предпочтительном варианте осуществления различимые частицы испускают люминесцентные или флуоресцентные сигналы. Например, могут быть использованы суперпарамагнитные флуоресцентные бусы от фирмы Ьиттех.

Эти физико-химические свойства также могут дать возможность во время реакции с биологическим образцом отделить фракции, захваченные этими микрочастицами, от тех, которые являются несвязанными. Это разделение может быть выполнено, среди прочего, путем центрифугирования, фильтрации или намагничивания. Разделение намагничиванием является предпочтительным, для этого могут быть использованы бусы, содержащие парамагнитные, ферромагнитные, ферримагнитные и метамагнитные компоненты. Парамагнитные компоненты являются предпочтительными, например железо, кобальт, никель или оксиды металлов, такие как Мп₂О₃, Сг₂О или Ре₃О₄. Количество магнитных компонентов может составлять от 2 до 50 мас.%, предпочтительно примерно от 3 до 25%.

В предпочтительном варианте осуществления в настоящем изобретении используют метод иммуноанализа, в котором объединяется проточная цитометрия с применением корпускулярной, предпочтительно суперпарамагнитной подложки в качестве твердой фазы (используя, в одном и том же сосуде, несколько категорий или групп различных частиц).

Каждая группа частиц специфична для иммунологической реакции и может отличаться от других частиц физико-химическими свойствами (размером, гранулометрическим составом, флуоресценцией и/или оптической плотностью). Это свойство суперпарамагнитных частиц облегчает разделение между твердой и жидкой фазами на стадиях промывания и позволяет автоматизировать исследования. Однако, необязательно, чтобы используемые бусы были суперпарамагнитными. В качестве суперпарамагнитных бус, которые могут быть использованы, можно, в частности, упомянуть бусы, описанные в патенте США 6872578. Конечная фаза выявления в соответствии со способом по настоящему изобретению в основном предусматривает:

ί) одновременное считывание с помощью детектора, способного дифференцировать сигналы от двух групп частиц, упомянутых выше, меченных иммунных комплексов со стадии с) на каждой частице;

ίί) отдельное получение результатов для каждой группы частиц и ϊϊΐ) интерпретацию результатов, как показатель наличия или отсутствия суммарных иммуноглобулинов (суммарных 1д) и/или иммуноглобулинов М, направленных против указанного микроорганизма.

Частицы предварительно подвергают определению с помощью проточной цитометрии, как описано, например, в патентной заявке Ьиттех XVО 97/14028. Таким образом, подгруппы частиц, несущих реагент (антитело или антиген), подвергают действию биологического образца, каждая подгруппа имеет один или несколько классификационных параметров, которые делают возможным различать частицы одной подгруппы от другой подгруппы. Частицы, таким образом, подвергающиеся воздействию образца, затем проходят в зону контроля (т.е. цитометр), где собираются данные, касающиеся классификационных параметров (например, интенсивностей эмиссии флуоресценции), и предпочтительно также данные, касающиеся наличия или отсутствия комплекса, сформированного между реагентом и аналитом, представляющим интерес.

Таким образом, в том случае, когда частицы испускают флуоресцентные сигналы, после добавления анализируемого образца и специфических конъюгатов (меченных, например, флуоресцентной меткой), флуоресцентные сигналы, испускаемые иммунными комплексами, образованными на каждой частице, измеряют, используя корпускулярный проточный цитометр с лазерным ридером (например, аппарат типа Ьиттех™).

Флуоресценция, специфичная для каждой частицы, регистрируется по отдельности, но одновременно для всех частиц. Полностью отдельный и различимый сигнал наконец получают для каждой группы частиц.

Таким образом, настоящее изобретение дает возможность получить, с помощью простого и автоматизируемого протокола, два отдельных и чувствительных измерения, одно для 1дМ, другое для суммарных иммуноглобулинов, направленных против одного и того же инфекционного микроорганизма.

Настоящее изобретение описано ниже более конкретно в отношении одновременного выявления

- 7 017206

1дМ и 1дС (или суммарных 1д) против вируса гепатита А и против вируса гепатита В, и для одновременного выявления 1дМ и 1дС (или суммарных 1д) в отношении Тгеропета раШйит, инфекционного бактериального агента, вызывающего сифилис.

Однако само собой разумеется, что настоящее изобретение применяется широко ко всем вирусам (Н8У, вирусу Денге, другим флавивирусам, таким как вирус лихорадки Западного Нила; вирусам краснухи и гриппа, νζν, СМУ, и т.д.), ко всем бактериям (Тгеропета раШйит, Воггейа ЬигдйогГеп. и т.д.) и/или ко всем паразитам (Тохор1а§та допйи, и т.д.), при которых также существует необходимость одновременного выявления 1дМ и 1дО (или суммарных иммуноглобулинов) в одном и том же сосуде для исследования, без какой-либо потери чувствительности.

В способе по настоящему изобретению образец не нужно подвергать предварительной обработке, такой как ферментативная реакция, расщепление или модификация, или такой как химическая реакция или модификация, или подобное и т.д. (например, с помощью зонального ультрацентрифугирования или ультрацентрифугирования в градиенте сахарозы, гель-фильтрации, адсобрции 1дО посредством стафилококкового белка А, или посредством анти-гамма Рс антитела или иного расщепления 1дМ с помощью βмеркаптоэтанола). Однако можно осуществлять способ по настоящему изобретению с образцом, который подвергался такой предварительной обработке.

Сосуд может представлять собой любой твердый контейнер, например пробирку, лунку микропланшета или реакционную кювету, изготовленную из полипропилена.

Удаление несвязавшихся реагентов можно осуществить с помощью любой методики, известной специалистам в данной области, такой как промывание, посредством повторных стадий центрифугирования, или используя преимущество суперпарамагнитной природы бус, применяя магниты.

В особом варианте осуществления способа по настоящему изобретению микроорганизм выбирают из группы, состоящей из вирусов человека, бактерий и паразитов, предпочтительно одноклеточных паразитов. В предпочтительном варианте осуществления способа по настоящему изобретению микроорганизм выбирают из группы, состоящей из вирусов человека. В особенно предпочтительном варианте осуществления способа по настоящему изобретению микроорганизм выбирают из группы, состоящей из вирусов гепатита человека, таких как вирусы НАУ и НВУ.

В предпочтительном варианте осуществления указанный микроорганизм представляет собой вирус гепатита А человека (НАУ), для которого затем возможно получить более низкий предел чувствительности для суммарных анти-НАУ иммуноглобулинов приблизительно 20 мМЕ/мл.

Объектом настоящего изобретения также является набор реагентов для осуществления способа по настоящему изобретению.

Объектом настоящего изобретения также является набор реагентов для осуществления способа по настоящему изобретению.

Тип одновременного и объединенного выявления 1дМ, направленных против инфекционного микроорганизма и 1дС антител или суммарных 1д против того же инфекционного организма, в контексте настоящего изобретения называется мультиплексным выявлением в отличие от симплексного выявления (в котором выявления 1дМ и 1дС или суммарных 1д осуществляют независимо, т.е. не объединено).

Настоящее изобретение также направлено на и охватывает все варианты одновременного способа выявления, эти варианты могут быть получены способами, известными по существу, или могут быть получены специалистами в данной области, не отклоняясь от сущности настоящего изобретения.

Настоящее изобретение теперь будет пояснено более подробно следующими примерами.

Следующие фигуры и примеры иллюстрируют изобретение, не ограничивая его объем.

Описания фигур

На фиг. 1 представлена схема, демонстрирующая выявление анти-НАУ 1дС и 1дМ с помощью формата двойной иммуносорбции (предшествующий уровень техники).

На фиг. 2 представлена схема, демонстрирующая способ по изобретению для выявления суммарных анти-НАУ 1д в сэндвич-формате и анти-НАУ 1дМ путем иммуносорбции.

На фиг. 3 представлена схема, демонстрирующая способ по изобретению для выявления суммарных анти-НВс 1д в сэндвич-формате и анти-НВс 1дМ путем иммуносорбции.

На фиг. 4 представлен график, демонстрирующий сравнение стандартных интервалов для суммарных анти-НАУ 1д, исследованных с помощью единичного формата 1дС (иммуносорбции), и с помощью единичного сэндвич-формата суммарных 1д.

На фиг. 5 представлен график, демонстрирующий сравнение стандартных интервалов для суммарных анти-НАУ 1д, исследованных с помощью единичного сэндвич-формата и с помощью мультиплексного.

На фиг. 6 представлена схема, демонстрирующая способ по изобретению для выявления суммарных 1д против Тгеропета раШйит в сэндвич-формате и 1дМ против Тгеропета раШйит с помощью иммуносорбции.

- 8 017206

Экспериментальный раздел.

Пример 1. Способ в соответствии с предшествующим уровнем техники.

Принцип этого исследования в соответствии с предшествующим уровнем техники проиллюстрирован на фиг. 1.

Материалы и методы.

Материалы.

1. Аналитическая система:

Анализатор ВюР1ех 2200® (Вю-К.аб. Магиек 1а СоцисИс. Ггаисе) использовали в соответствии с инструкциями производителя. Это автоматизированное иммуноаналитическое устройство содержит проточный цитометр и детектор Ьиттех 100™ (Ьиттех Согр.. Аик!т. Техак. иийеб 81а!ек) и использует гетерогенный набор суперпарамагнитных частиц. Каждая группа частиц. состоящая из полистирола и метакриловой кислоты (функциональная группа СООН) и имеющая размер 8 мкм в диаметре. производится с различным процентным содержанием флуорохромов (СЬ1 и СЬ2). продуцирующих уникальный идентификационный код. присвоенный каждой группе частиц и детектируемый лазером детектора Ьитшех 100™ (Ьиттех Согр.. Аик1т. Техак. Ьпйеб 81а1ек). После иммунологической реакции бусы проходят одна за другой через проточную кювету в центре жидкого матрикса. таким образом. чтобы одновременно возбуждались и считывались двумя отдельными лазерами. Измерения проводят при прохождении бус.

638 нм красный лазер возбуждает идентифицирующие флуорохромы (СЬ1 и СЬ2). находящиеся на поверхности каждой частицы. и составной сигнал интерпретируется таким образом. чтобы идентифицировать аналит частицы. Путем идентификации категории частицы этот лазер. таким образом. служит для идентификации проводимого исследования.

532 нм зеленый лазер возбуждает флуоресцентный зонд (конъюгат. меченный фикоэритрином (РЕ)). и испускаемая флуоресценция пропорциональна конъюгату. присоединенному к частице. Следовательно. этот лазер служит для измерения реакционной способности аналита. иммобилизованного на указанной частице.

Система программного обеспечения преобразует сигнал конъюгата в величину относительной интенсивности флуоресценции (НИ). Затем сигналы сравнивают со стандартной кривой. специфичной для этого исследования для определения концентрации аналита. Соотношение также может быть рассчитано для качественной классификации результата. как положительного или отрицательного.

2. Твердая фаза.

Использовали две различные группы суперпарамагнитных частиц Ьиттех™ (Ьиттех Согр.. Аикίίη. Техак. Ьпйеб 8!а!ек).

Каждая группа частиц покрыта лигандом. специфичным для конкретного исследования. Каждый лиганд соединен с помощью гетеробифункционального реагента.

Группа 1: мышиное моноклональное антитело против 1дМ человека (Ну1ек1. Финляндия). иммобилизованное с концентрацией 10 мкг/мг частиц.

Группа 2: мышиное моноклональное антитело против 1дС человека (Гс гамма; 1асккои 1ттиио Рекеагсй. Соединенные Штаты). иммобилизованное с концентрацией 20 мкг/мл частиц.

3. Антиген НАУ.

НАУ антиген от Упа1 Аийдеи. МетрЫк. Теииеккее. Соединенные Штаты.

4. Флуорохром.

Фикоэритрин от С’уапо1ес11. На\гаи. Соединенные Штаты.

5. Конъюгат.

Мышиное моноклональное антитело против НАУ (Вю-К.аб. Магиек 1а СоциеНе. Франция). соединенное с фикоэритрином (РЕ) с помощью гетеробифункционального реагента. по существу. известного специалистам в данной области.

6. Разбавители.

6.1. Разбавители суперпарамагнитных частиц.

Раствор 20 мМ цитратного буфера. рН 5.6. содержащий 116 мМ №101. 5.6 мМ БИТА. 2% Тритон. 10% сыворотку барана. 0.5 г/л мышиного 1дС. 0.5% Ргосйи 300™ (товарный знак компании 8ире1со). 25% коровьего молока (100% обезжиренное). 0.13% 1дС В83.

6.2. Разбавители для антигена НАУ и для конъюгата.

Раствор 50 мМ фосфатного буфера. рН 7.1. содержащий 150 мМ ЫаС1; 0.1% ΝιΝ₃. 1% В8А. 2.75% ПЭГ 6000. 0.1% Т\гееп20™ (товарный знак компании). 1% сыворотки барана. 1 г/л мышиного 1дС.

6.3. Разбавители для стадии 1 или промывочный раствор.

Фосфатный буфер. рН 7.4. содержащий 150 мМ №С1. 0.1% Т\гееп 20™ (товарный знак компании 8хдта). 0.034% Ргосйи 300™ (товарный знак компании 8ире1со). 0.095% ΝιΝ₃.

7. Реакционные кюветы.

Иммунологические реакции проводили в полипропиленовой реакционной кювете объемом 1 мл.

- 9 017206

8. Стандарты.

Стандарт ВОЗ суммарных иммуноглобулинов против НАУ (код 97/646) воспроизводили в соответствии с рекомендациями и разбавляли таким образом, чтобы получить следующие стандартные точки: 0; 20; 80; 160; 320 и 640 мМЕ/мл.

Методы

Протокол исследования.

Стадия 1.

1. Следующее последовательно помещали в каждую реакционную кювету:

мкл образца или стандарта + 250 мкл разбавителей для стадии 1, мкл иммунологически реактивных частиц (50:50 смесь частиц групп 1 и 2) + 250 мкл разбавителей для стадии 1.

2. После гомогенизации смесь инкубируют в течение 40 мин при 37°С.

3. Затем проводят стадии промывания: разделение твердой и жидкой фаз путем намагничивания и три последовательных промывания по меньшей мере 300 мкл промывочного раствора. При окончательном промывании частицы ресуспендируют.

Стадия 2.

4. 50 мкл раствора антигена НАУ (Ад НАУ) помещают в каждую реакционную кювету.

5. После гомогенизирования смесь инкубируют в течение 15 мин при 37°С.

6. Затем проводят стадии промывания (упомянутый ранее п.3).

Стадия 3.

7. 50 мкл конъюгата (анти-НАУ антитело-фикоэритрин, т.е. МаЬ-РЕ) помещают в каждую реакционную кювету.

8. После гомогенизации смесь инкубируют в течение 15 мин при 37°С.

9. Затем проводят стадии промывания (упомянутый выше п.3).

10. Частицы каждой лунки ресуспендируют путем добавления к ним 35 мкл промывочного раствора со встряхиванием.

11. Суспензию частиц каждой лунки извлекают с помощью проточного цитометра.

12. Суспензию частиц каждой кюветы считывают, используя два лазерных луча.

13. Результаты считываний непосредственно обрабатывают с помощью проточного цитометра и регистрируют в относительных единицах интенсивности флуоресценции (единицы ΒΕΙ).

14. Для интерпретации результатов для каждой стандартной точки (или образца) соотношение рассчитывают относительно значения величины отсечки. Относительно суммарных анти-НАУ 1д, величина отсечки соответствует величине ΒΕΙ стандартной точки при 20 мМЕ/мл, считающейся величиной отсечки защитной величины.

Таким образом, соотношение образцов рассчитывают следующим образом:

среднее* сигнала КП образца Соотношение образцов =

Величина отсечки

Образцы, соотношение которых превышает 1, признают положительными, образцы, для которых соотношения ниже 1, признают отрицательными.

* все исследования образцов, полученных от человека, проводят дважды (в виде двух повторов), и используемые результаты ΒΕΙ исходят от среднего этих двух повторов.

Результаты исследований, проводимых в стандартном интервале.

Выявление 1дМ с помощью иммуносорбции не вызывало никаких проблем.

В частности, внимание было обращено на формат иммуносорбции анти-НАУ 1дО для достижения аналитической чувствительности 20 мМЕ/мл.

Однако в проводимых исследованиях формат иммуносорбции для выявления анти-НАУ 1дО демонстрирует явную недостаточную чувствительность (см. табл. 1 и графу 1).

Это происходит вследствие того, что соотношения, рассчитанные для стандартов между 0 и 80 мМЕ/мл, существенно не отличаются один от другого и они находятся слишком близко к соотношению стандарта 20 мМЕ/мл (соотношение=1,0), чтобы быть достоверно выделенными. Эти соотношения только начинают повышаться и, следовательно, являются отражением суммарного выявления 1д для стандартов между 160 и 640 мМЕ/мл.

- 10 017206

Таблица 1

Исследование стандартного диапазона суммарных анти-НАУ 1д

Исследование 1дС с помощью иммуносорбции 1дС

Стандарт (мМЕ/мл)	ΚΓΙ	Соотношение
0 10 40 80 160 320 640	19 22 29 41 60 39 133	0,79 0,92 1.00 , _ ' ί »'»! , 1 1,21 1.71 2,50 3.71 5,54

Эта недостаточная чувствительность происходит вследствие того факта, что используемая твердая фаза (частицы против 1дС человека) не дают возможности специфически захватывать 1дС. направленные против аналита. Следовательно. твердая фаза насыщается всеми другими 1дС в сыворотке.

Этот феномен не наблюдается в формате иммуносорбции для 1дМ. поскольку редко одновременно имеется несколько инфекций и в сыворотке имеются 1дМ. направленные против различных инфекционных агентов во время острой инфекции.

Этот формат иммуносорбции. следовательно. рассматривался для выявления 1дМ. но отвергнут для выявления 1дС и заменен сэндвич-форматом. Результаты. полученные для последнего формата. будут описаны ниже.

Пример 2. Способ выявления по настоящему изобретению. применяемый для выявления суммарных 1д и 1дМ против НАУ.

Способ мультиплексного выявления в соответствии с настоящим изобретением описан ниже и на фиг. 2.

Материалы и методы.

Материалы.

Материал. по существу. идентичен материалу. используемому в примере 1. кроме исключений. указанных ниже.

1. Аналитическая система: см. описание примера 1.

2. Твердая фаза.

Используют две различные группы суперпарамагнитных частиц Ьитшех™ (Ьитшех Согр.. Аикйи. Техак. Соединенные Штаты).

Группа 1: мышиное моноклональное антитело против 1дМ человека (Ну1ек1. Еш1апй). иммобилизованное при концентрации 10 мкг/мл частиц.

Группа 2: антиген НАУ (Упа1 Ад. МетрЫк. Теппеккее. Ьпйей 81а1ек). иммобилизованный при концентрации 2.5 мкг/мг частиц.

3. Конъюгат 1.

НАУ антиген (Упа1 Ад. МетрЫк. Теппеккее. И8А). меченный биотином (Р1егсе. РоскГогй. 1Ь. Ьпйей 81а1ек).

4. Конъюгат 2.

Стрептавидин (сокращенно 81гер1а. Росйе Маппйепп. Сегшапу). соединенный с фикоэритрином (сокращенно РЕ) от Суапо1ес11. Намай. Ипйей 81а1ек.

5. Разбавители.

Разбавители для бус и для конъюгатов 1 и 2. разбавитель для стадии 1 и промывочный раствор идентичны таковым примера 1.

6. Стандарты.

Стандарт ВОЗ суммарных иммуноглобулинов против НАУ (код 97/646) идентичен стандарту. используемому в примере 1.

7. Образцы.

Исследуемые образцы. полученные от человека. представляют собой образцы плазмы или сыворотки. которые являются положительными или отрицательными в отношении суммарных иммуноглобулинов против НАУ и/или 1дМ. Эти образцы получают из внутренних библиотек образцов. составленных из образцов. продаваемых следующими компаниями:

АВО Рйаттасеийсак - 7930 Ацопк Элуе. 8ш1е А. 8ап И1едо. СА 92126. Ипйей 81а1ек:

Тетадешх - 5440 Νν 33тй Ауепие. 8ш1е 108. Е1. Ьаийетйа1е. ЕЬ 33309. Ипйей 81а1ек:

- 11 017206

РтотебЭх - 10 Соттегсе \Уау. Νοήοη, МА 02766, Ипйеб 81а1е5;

ΖορΙοιηοΙπχ Согрогайоп - 872 Мат §1.. Вийа1о, ΝΥ 14202, Ипйеб 81а1е5;

ВВ1 Э|адпо51ос - 375 ХУеЦ §1гее1. ХУеЦ Впбде\\'а1ег. МА 02379, Ипйеб 81а1е5;

ЬВе 8ега - 780 Рагк Шг111 Β1νά, 8ийе 100, С1агк81оп, ОА 30021, Ипйеб 81а1е5.

Исследуемые образцы, полученные от человека, могут быть подразделены на:

образцов, отрицательных в отношении суммарных иммуноглобулинов и 1дМ против НАУ (двойные отрицательные);

образцов, положительных в отношении суммарных иммуноглобулинов против НАУ и отрицательных в отношении анти-НАУ 1дМ;

образцов, положительных в отношении анти-НАУ 1дМ и отрицательных в отношении суммарных иммуноглобулинов против НАУ.

Способы.

Протоколы исследования.

В описанных далее исследованиях осуществляют три протокола исследования.

Мультиплексный протокол в соответствии с настоящим изобретение (т.е. протокол для суммарных 1д + протокол для 1дМ) и два единичных протокола (протокол для суммарных 1д и протокол для 1дМ). Эти три протокола идентичны, за исключением стадии добавления используемых иммунологически реактивных суперпарамагнитных частиц. В мультиплексном протоколе используют две группы бус, а в каждом единичном протоколе используют одну группу бус. Количество частиц группы 1 (несущих анти1дМ антитела), используемых в единичном протоколе для 1дМ, и мультиплексный протокол остается таким же. Аналогично, количество частиц группы 2 (несущих антиген НАУ), используемых в единичном протоколе для суммарных 1д, и в мультиплексном протоколе остается таким же.

A. Единичный протокол для выявления суммарных анти-НАУ 1д.

Стадия 1.

1. Следующее последовательно помещают в каждую реакционную кювету:

мкл образца или стандарта + 225 мкл разбавителей для стадии 1;

мкл иммунологически реактивных частиц группы 2 (НАУ антиген) + 250 мкл разбавителей для стадии 1.

2. После гомогенизации смесь инкубируют в течение 40 мин при 37°С.

3. Затем проводят стадии промывания: упомянутый ранее п.3 примера 1.

Стадия 2.

4. 50 мкл раствора конъюгата 1 (биотинилированный антиген НАУ, т.е. Ад НАУ биотин) помещают в каждую реакционную кювету.

5. После гомогенизации смесь инкубируют в течение 15 мин при 37°С.

6. Затем проводят стадии промывания: упомянутый ранее п.3.

Стадия 3.

7. 50 мкл конъюгата 2 (стрептавидин-фикоэритрин, т.е. 81гер1а-РЕ) помещают в каждую реакционную кювету.

8. После гомогенизации смесь инкубируют в течение 15 мин при 37°С.

9. Затем проводят стадии промывания: упомянутый ранее п.3.

10. Частицы каждой реакционной кюветы ресуспендируют добавлением к ним 35 мкл промывочного раствора путем встряхивания.

11. Суспензию частиц каждой реакционной кюветы извлекают с помощью проточного цитометра.

12. Суспензию частиц каждой кюветы считывают, используя два лазерных луча.

13. Результаты считываний непосредственно обрабатывают с помощью проточного цитометра и регистрируют в относительных единицах интенсивности флуоресценции (единицы ΒΕΙ).

14. Для интерпретации результатов для каждой стандартной точки (или образца) соотношение рассчитывают относительно значения величины отсечки. Относительно суммарных анти-НАУ 1д величина отсечки соответствует величине ΒΕΙ стандартной точки при 20 мМЕ/мл, считающейся величиной отсечки защитной величины.

Соотношение образцов рассчитывают следующим образом:

среднее* сигнала ΚΕΙ образца Соотношение образцов ==

Величина отсечки

Образцы, соотношение которых превышает 1, признают положительными, образцы, для которых соотношения ниже 1, признают отрицательными.

* все исследования образцов, полученных от человека, проводят дважды (в виде двух повторов), и используемые результаты ΒΕΙ исходят от среднего этих двух повторов.

B. Единичный протокол для выявления анти-НАУ 1дМ.

Стадия 1.

1. Следующее последовательно помещают в каждую реакционную кювету:

мкл образца или стандарта + 225 мкл разбавителей для стадии 1;

- 12 017206 мкл иммунологически реактивных частиц группы 1 (анти-1дМ антитела) + 250 мкл разбавителей для стадии 1.

Все остальные стадии (2-13) единичного протокола для 1дМ строго идентичны стадиям 2-13 единичного протокола для суммарных 1д.

14. Для расчета соотношения образцов в отношении НАУ 1дМ величина отсечки представляет собой среднее ΚΡΊ отрицательных образцов + 12 стандартных отклонений.

Соотношение образцов рассчитывают, следовательно, следующим образом:

среднее* сигнала ΚΪΊ образца

Соотношение образцов

Величина отсечки

Образцы, соотношение которых превышает 1, признают положительными, образцы, для которых соотношения ниже 1, признают отрицательными.

* все исследования образцов, полученных от человека, проводят дважды (в виде двух повторов), и используемые результаты ΚΡΊ исходят от среднего этих двух повторов.

С. Мультиплексный протокол в соответствии с настоящим изобретением (одновременное выявление суммарных 1д против НАУ и 1дМ).

Стадия 1.

1. Следующее последовательно помещают в каждую реакционную кювету:

мкл образца или стандарта + 225 мкл разбавителей для стадии 1;

мкл иммунологически реактивных частиц (50:50 смесь частиц групп 1 и 2) + 250 мкл разбавителей для стадии 1.

Все другие стадии (2-14) мультиплексного протокола строго идентичны стадиям 2-14 единичных протоколов для суммарных 1д и 1дМ.

Полученные результаты.

1. Диапазоны значений измеряемой величины.

1.1. Стандартный диапазон суммарных анти-НАУ 1д, исследуемых с помощью единичного сэндвича.

Результаты, полученные со стандартным диапазоном (от 0 до 640 мМЕ/мл), выполняемые с помощью единичного сэндвича, показали, что сэндвич-формат для суммарных 1д является гораздо более чувствительным, чем формат иммуносорбции 1дС из примера 1 (см. табл. 2 и фиг. 4).

Таблица 2 Сравнение стандартного диапазона суммарных анти-НАУ 1д, исследуемых с помощью формата единичной иммуносорбции !§С (пример 1) и с помощью единичного сэндвич-формата для суммарных 1д (пример 2)

Формат единичной иммуносорбции 1дС (пример 1)	Единичный сэндвич формат для суммарных 1д (пример 2)
Стандарт (мМЕ/мл)	ΚΕΙ	соотношение	ΚΕΙ	соотношение
0	19	0,79	; 53	0,32
10	22	0,92	115	0,70
20	. 24	1,00	165^	1,00
40	29	1,21	307	1,86
80	41	1,71	604	3,66
160	60	2,50	820	4,97
320	89	3,71	1403	8,50
€40	133	5,54	2994	18,15

1.2. Стандартный диапазон суммарных анти-НАУ 1д, исследованных с помощью мультиплексного способа.

Результаты, полученные со стандартным диапазоном, выполненные с помощью сэндвича в соответствии с мультиплексным протоколом по настоящему изобретению, представлены в табл. 3 и на фиг. 5.

- 13 017206

Таблица 3

Сравнение стандартных диапазонов суммарных 1д с помощью единичного сэндвич-формата и с помощью мультиплексного формата

Единичный сэндвич формат для суммарных.Σσ	Мультиплексный сэндвич формат для суммарных 1д
Стандарт (мМЕ/мл)	Κ.ΓΙ	Соотношение	ΚΕΙ	Соотношение
0	53	0,32	53	0,35
10	115	0,70	112	0,75
20	165 ·	1,00	'150	1,00
40	307	1,86 .	’ * 2бо‘	1,73
30	604	3,66	449	2,99
160	820	4,97	852	5,68
320	1403	8,50	1372	9,15
640	2994	18,15	2353	15,69

Отмечается, что чувствительность мультиплексного сэндвич-формата для суммарных 1д остается неизменной относительно чувствительности, полученной с единичным сэндвич-форматом.

2. Образцы.

2.1. Исследование образцов для суммарных анти-НАУ 1д с помощью единичного сэндвича и мультиплексного сэндвича.

Результаты, полученные с образцами от человека для суммарных анти-НАУ 1д, приведены в табл. 4. Таблица 4 Сравнение исследования образцов на суммарные анти-НАУ 1д посредством единичного сэндвичформата и посредством мультиплексного формата в соответствии с настоящим изобретением

	Единичный.сэндвич формат для суммарных 1д‘	Мультиплексный сэндвич формат для суммарных 1д
ΚΕΙ	Соотношение	ЯГ1 ;	Соотношение
Величина отсечки стандарт при 20 мМЕ/мл	ΚΕΊ	165	1,00	150 ,	1,00
Образцы,
отрицательные отношении НАУ	в 1дС и	39	0,24	46 1	0,30
НАУ 1дМ Среднее (п=30)					ί
Образцы,		1	1767	10,71 ‘	2208 ;	14,72
положител ь ные	в	2	2576	15,61	4106	27,37
отношении НАУ		3	1793	10,87	1382	9,21
1дС и		4	2172	13,16	3829	25,53
отрицательные	в	5	1732	;о,5о	2763	18,42
отношении НАУ		6	2229	13,51	3344	22,29
1дМ (п=26)		7	2051	12,43	3245 ‘	21,63
		8	2755	16,70	4612 |	30,75
		9	1755	10,63	2503	16,69
		10	3479	21,08	4898	32,65
		11	2601	15,76	3429 ;	22,86
		12	2338	14,17	4014	26,76
		13	3008	18,23	4362 ί	29,08
		14	3296	19,98	4034	26,89
		15	2447	14,83	2468 ί	16,45
		16	1676	10,16	1809 ;	12,06
		17	714	4,32	622	4,15
		18	2325	14,09	4392 '	29,28
		19	1385	8,39	1300 ’	8,67
		20	2871	17,40	3668	24,45

- 14 017206

21	2565
22	2315.
23	. 2998
24	1904
25	2250
26	1853

Очень хорошее различие отмечается между отрицательными образцами (п=30) и положительными образцами (п=26) в сэндвич-исследовании суммарных анти-НАУ 1д независимо от того, проводилось ли оно посредством единичного формата или посредством мультиплексного в соответствии с настоящим изобретением.

Следовательно, эти результаты показывают, что чувствительность выявления суммарных антиНАУ 1д не снижается в мультиплексном способе в соответствии с настоящим изобретением.

Все положительные образцы действительно найдены положительными способом по настоящему изобретению, который, таким образом, дает возможность также получать хорошую клиническую чувст вительность.

2.2. Исследование образцов на анти-НАУ 1дМ посредством единичного и мультиплексного формата иммуносорбции.

Результаты, полученные с образцами от человека в отношении анти-НАУ 1дМ, представлены в табл. 5.

Таблица 5

Сравнение исследования образцов на анти-НАУ 1дМ посредством единичного формата иммуносорбции и мультиплексного формата иммуносорбции в соответствии с настоящим изобретением

	Единичный формат иммуносорбции 1дМ	Мультиплексный формат иммуносорбции 1дМ
ΚΕΙ соотношение	КЕ*1 соотношение
Величина отсечки среднее отрицательных	655 1 1,00	653 ' 1,00

1дС и отрицательные по НАУ 1дМ Среднее (п=26)	72 ; ί ΐ	0,17	89 : 1	0,14
	1	9978 '	15,23	8605	13,18
	2	12090 !	18,46	12389	18,97
	3	17619 ‘	26,90	16789 ,	25,71
	4	13037 :	19,90	14024	21,48
Образцы, 1	5	8923 1 !	13,62	8658 !	13,26
положительные	6	20325	31,03	17150	26,26
по НАУ 1дМ и	7	15444	23,58	13629	20,87
отрицательные ·	8	15047 ,	22,97	13561	20,77
по НАУ ГдС ’	9	20611 ,	31,47	19929	30,52
(п=15) .	10	15374 ,	23,47	14068 ,	21,54
	11	16774 ί	25,$1	20497	31,39
	12	19430 ;	29,66	18986 :	29,08
	13	9501 ί	14,51	13334	20,42
	14	16785	25,63	16113	24,68
	15	12647 '	19,31	16708 '	25,59

Очень хорошее различие отмечается между образцами, отрицательными по анти-НАУ 1дМ (п=30+26), и образцами, положительными по анти-НАУ 1дМ (п=15) в исследовании анти-НАУ 1дМ посредством иммуносорбции, независимо от того, проводилось ли оно посредством единичного формата или посредством мультиплексного в соответствии с настоящим изобретением.

Эти результаты показывают, что чувствительность выявления 1дМ с помощью иммуносорбции не снижается объединением с сэндвич-анализом в мультиплексном способе по настоящему изобретению.

- 15 017206

Все положительные образцы действительно найдены положительными с помощью способа по настоящему изобретению, который, таким образом, также делает возможным получать хорошую клиническую чувствительность.

Пример 3. Способ выявления в соответствии с настоящим изобретением, применяемый для выявления суммарных 1д и 1дМ против НВс.

Мультиплексный способ выявления по настоящему изобретению также был использован для исследования суммарных 1д и 1дМ против НВс. Этот способ проиллюстрирован на фиг. 3 и описан ниже.

Материалы и методы.

Материалы.

Используемые материалы эквивалентны материалам примера 2, за исключением частиц, биотинилированного конъюгата 1 и тестируемых образцов.

1. Твердая фаза.

Используют две различные группы суперпарамагнитных частиц Ьиттех™ (Ьиттех Согр., Аикйп, Техак, Ипйей 81а1ек).

Группа 1: козье поликлональное антитело против 1дМ человека (Βίο-Кай, Магпек 1а Социейе), иммобилизованное при концентрации 10 мкг/мг частиц.

Группа 2: рекомбинантный антиген НВ (Уйодеп, ^а1ейо^п, МА, Ипйей ЗиПек), иммобилизованный при концентрации 10 мкг/мл частиц.

2. Конъюгат 1.

Рекомбинантный антиген НВс (Вюкй, Вагсе1опа, 8раш), меченный биотином (Р1егсе, Косккотй, 1Ь, Ипйей 81а1ек).

3. Образцы.

Исследуемые образцы, полученные от человека, представляют собой образцы плазмы или сыворотки, которые являются положительными или отрицательными в отношении суммарных иммуноглобулинов против НВс и/или 1дМ против НВс. Эти образцы поступают из внутренних библиотек образцов из образцов, продаваемых компаниями:

АВО Рйаттасеийсак - 7930 Ацопк Ийуе, 8ийе А, 8ап И1едо, СА 92126, Ипйей 81а1ек;

РтотейИх - 10 Соттегсе ^ау, Иойоп, МА 02766, Ипйей 81а1ек;

2ер1оте1пх Сотрогайоп - 872 Мат δί., Вийа1о, ΝΥ 14202, Ипйей 81а1е8.

Исследуемые образцы, полученные от человека, могут быть подразделены на:

образцов, отрицательных по суммарным иммуноглобулинам против НВс и 1дМ против НВс (двойные отрицательные);

образцов, положительных по суммарным иммуноглобулинам против НВс и отрицательных по анти-НВс 1дМ;

образцов, положительных по анти-НВс 1дМ и отрицательных по суммарным иммуноглобулинам против НВс.

Методы.

Протоколы исследования.

Используемые протоколы идентичны протоколам А, В и С, описанным выше в примере 2, за исключением используемого объема образцов, используемого на стадии 1, который составляет 5 + 250 мкл разбавителя для стадии 1.

Другие стадии являются идентичными, в том числе стадия интерпретации. Для исследования суммарных анти-НВс 1д и анти-НВс 1дМ величина отсечки представляет собой среднее ΚΡΊ отрицательных образцов + 12 стандартных отклонений.

Вычисленное соотношение образцов относительно величины отсечки таким образом представляет собой следующее:

среднее* сигнала ΚΡΙ образца

Соотношение образцов =

Величина отсечки

Образцы, соотношение которых превышает 1, признают положительными, образцы, для которых соотношения ниже 1, признают отрицательными.

* все исследования образцов, полученных от человека, проводят дважды (в виде двух повторов), и используемые результаты ΚΡΊ исходят от среднего этих двух повторов.

- 16 017206

Полученные результаты.

Таблица 6 Сравнение исследования образцов на суммарные анти-НВс 1д посредством единичного сэндвич-формата и посредством мультиплексного формата в соответствии с настоящим изобретением

	Единичный СЭНДВИЧ формат для суммарных 1д	Мультипл е ксный сэндвич формат для суммарных 1д
ΚΕΙ	Соотношение	ΚΒΊ	Соотношение
Величина отсечки
среднее отрицательных +	202	1,00	231	1,00
12 8ϋ			'1 ' '
Образцы, отрицательные
по суммарным НВс	1д и
		52	0,25	54	0,26
НВс 1дМ
Среднее (п=10)
Образцы,	1	1035	^5,12	1027	4,44
положительные по	: 2	2151	10,63	2225	9,61
суммарным НВс 1д	: з	1161	5,74	1334 :	5,76
и отрицательные	4	1577	7,79	1596 |	6,90
по НВс 1дМ	1 : 5	2345	11,59	2134 ;	9,22
(п=20)	6	3499	17,29	3238	13,99
	7	1672	8,26	1316 ί	5,69
	' 8	492	2,43	375	1,62
	: э	.3892	·. 19,24	2435	10,52
	. 10	1565	7,74	1228 ’	5,31

1 11	682	3,37	1042	4,	50
12	1198	' 5,92	1705 :	7,	37
13	630	3,11	1408	6,	08
14	1188	5,87	2291 ,	9,	90
15	2318	11,46	3311 .	14	,31
16	2402	11,87	3550	15	,34
! 17	3887	19,21	3888	16	,80
18	2020	9,98	2414	10	,43
19	1039	5,13	1720	7,	43
1 20 ..... ......................................................................................................................................................................................ι.	1334	6,59	1700 .	7	34

Очень хорошее различие отмечается между отрицательными образцами (п=10) и положительными образцами (п=20) в сэндвич-исследовании суммарных анти-НВс 1д, независимо от того, проводилось ли оно посредством единичного формата, или посредством мультиплексного формата в соответствии с настоящим изобретением.

Таким образом, эти результаты показывают, что чувствительность выявления суммарных анти-НВс 1д не снижается в мультиплексном способе по настоящему изобретению.

Все положительные образцы действительно найдены положительными с помощью способа по настоящему изобретению, который, следовательно, дает возможность также получать хорошую клиническую чувствительность.

- 17 017206

Таблица 7

Сравнение исследования образцов на анти-НВс 1дМ посредством единичного формата иммуносорбции и посредством мультиплексного формата иммуносорбции в соответствии с настоящим изобретением

	Единичный формат иммуносорбции 1дМ	Мультиплексный формат иммуносорбции 1дМ
ΚΡΙ	Соотношение	ΗΓΙ	Соотношение
В©личина отсечки среднее отрицательных + 12 3ϋ	321	1,00	431	1,00

	1	3852 1	12,01	3239 '	7,52
	2	3687 :	11,50	3275 :	7,60
Образцы,
	! 3	2273 ;	7,09	1549	3,60
положительные
	4	1697 '	'5,29	1501	3,49
по НВс 1дМ и	1			1
	5	2333	7,27	1570	3,64
отрицательные		(
	6	1302 '	4,06	1058	2,46
по суммарным
	1 7	5462 ί	17,03	5813	13,50
НВс 1д	1			1
	1 8	2595 '	8,09	3110	7,22
(п=10 >
	9	1515 !	4,72	1857	4,31
	То	1128 .	3,52	1132 '	2,63

Очень хорошее различие отмечается между образцами, отрицательными в отношении анти-НВс 1дМ (п=10+10), и образцами, положительными в отношении анти-НВс 1дМ (п=10) в анализе иммуносорбции анти-НВс 1дМ, независимо от того, проводится ли посредством единичного формата или посредством мультиплексного формата в соответствии с настоящим изобретением.

Таким образом, эти результаты показывают, что чувствительность выявления 1дМ посредством иммуносорбции не снижается путем объединения с сэндвич-анализом в мультиплексном способе в соответствии с настоящим изобретением.

Все положительные образцы действительно найдены положительными с помощью способа по настоящему изобретению, который, следовательно, дает возможность также получать хорошую клиниче скую чувствительность.

Пример 4. Способ выявления по изобретению, применяемый для выявления суммарных 1д и 1дМ против сифилиса.

Мультиплексный способ выявления по настоящему изобретению также был использован для исследования суммарных 1д против Тгеропета раШНит и 1дМ против Тгеропета раШНит, Тгеропета раШНит, являющейся инфекционным бактериальным агентом, вызывающим сифилис. Этот способ проиллюстрирован на фиг. 6 и описан ниже.

Материалы и методы.

Материалы.

Используемые материалы эквивалентны материалам примеров 2 и 3, за исключением частиц, биотинилированного конъюгата 1 и тестируемых образцов.

1. Твердая фаза.

Используют две различные группы суперпарамагнитных частиц Ьцттех™ (Ьцттех Согр., АикЕп, Техак, ИпйеН 31а1е5).

Группа 1: мышиное моноклональное антитело против 1дМ человека (Ну1ез1, Рш1аиН), иммобилизованное при концентрации 2,5 мкг/мг частиц.

Группа 2: рекомбинантные антигены ТрЫ17 и ТрЫ47 Тгеропета раШНит (Ыете Магке! ЬаЬогаШпек ЫН, КепГогН, Епд1апН), иммобилизованные соответственно при концентрации 5 мкг/мг и 1,25 мкг/мг час тиц.

- 18 017206

2. Конъюгат 1.

Рекомбинантные антигены ТрЫ17 и ТрЫ47 (Иете Магке! ЬаЬогаФпек Ыб, КепГогб, Епд1апб), меченные биотином (Иегсе, КоскГогб, 1Ь, Ипйеб 81а1ек).

3. Образцы.

Исследуемые образцы, полученные от человека, представляют собой образцы плазмы или сыворотки, которые положительны или отрицательны по суммарным иммуноглобулинам против Тгеропета ра111бит и/или 1дМ против Тгеропета раШбит.

Эти образцы получают из внутренних библиотек образцов.

Е1аЬ11Ккетеп1 Ргапса1к би 8апд (ЕР8) [РгепсЕ Ь1ооб Ьапк] - 83 гие бек А1рек, 94150 Кипд1к, Ргапсе, или из образцов, продаваемых компаниями:

РготебИх - 10 Соттегсе Vау, Иойоп, МА 02766, Ипйеб 81а1ек;

8егаСаге Ь1Ге 8с1епсе - 375 Vекΐ 81гее(, '№ек1 Впбдетеа1ег, МА 02379, Ипйеб 81а1ек.

Исследуемые образцы, полученные от человека, могут быть подразделены на:

образцов, отрицательных в отношении суммарных иммуноглобулинов против Тгеропета ра111бит и 1дМ против Тгеропета раШбит (двойные отрицательные);

образца, положительных в отношении суммарных иммуноглобулинов против Тгеропета раШбит и отрицательных в отношении 1дМ против Тгеропета раШбит (образцы 1, 2, 3);

образца, положительных в отношении 1дМ против Тгеропета раШбит и отрицательных в отношении суммарных иммуноглобулинов против Тгеропета раШбит (образцы 4, 5, 6, 7).

Методы.

Протоколы исследования.

Используемые протоколы идентичны протоколам А, В и С, описанным выше в примере 2, за исключением объемов на стадии 1, которые составляют 100 мкл для образца и 100 мкл для бус, и на стадии 2, который составляет 100 мкл раствора конъюгата 1 (биотинилированные антигены Тгеропета раШбит).

Другие стадии идентичны, в том числе стадия интерпретации.

Интерпретация результатов.

Для исследования суммарных 1д против Тгеропета раШбит и 1дМ против Тгеропета раШбит величина отсечки составляет среднее значение КИ отрицательных образцов, деленное на 0,3.

Вычисленное соотношение образцов относительно величины отсечки таким образом представляет собой следующее:

среднее* сигнала ΒΓΙ образца Соотношение образцов =

Величина отсечки

Образцы, соотношение которых превышает или равно 1, признают положительными, образцы, для которых соотношения меньше 1, признают отрицательными.

* все исследования образцов, полученных от человека, проводят в трех повторах, и используемые результаты КИ исходят от среднего этих трех повторов.

Полученные результаты:

Таблица 8 Сравнение исследования образцов на суммарные 1д против Тгеропета раШбит посредством единичного сэндвич-формата и посредством мультиплексного формата в соответствии с настоящим изобретением

	Единичный сэндвич формат для , суммарных 1д	Муль типлек сный сэндвич формат для суммарных 1д
ΚΓΙ	Соотношение	КП	Соотношение
Величина отсечки
среднее отрицательных/0,3		80	1,00	80	1,00
Образцы, отрицательные в отношении 1дС против		; ·
Тгеропета раШбит отрицательные в	и	24	0,30	24	0,30
отношении 1дМ против
Тгеропета раШдит Среднее (п=35)
Образцы,		750	9,38	8ΊΊ	10,96
положительные в
отношении 1дС против 1 Тгеропета ‘ раШбит и ' отрицательные в ' отношении 1дМ ΐ	2	2064	, . 25,80 ί Г к- . . · ’ 130,89	2417	: зо,21 1
против ·, Тгеропета раШдигч (п=3)	3	10471	13000	: 162,50 1

- 19 017206

Очень хорошее различие отмечается между отрицательными образцами (п=35) и положительными образцами (п=3) в сэндвич-анализе суммарных 1д против Тгеропета раШйит, независимо от того, проводится ли посредством единичного формата или мультиплексного формата в соответствии с настоящим изобретением.

Таким образом, эти результаты показывают, что чувствительность выявления суммарных 1д против Тгеропета раШйит не снижается в мультиплексном способе по настоящему изобретению.

Все положительные образцы действительно найдены положительными с помощью способа по настоящему изобретению, который, таким образом, дает возможность также получить хорошую клиническую чувствительность.

Таблица 9 Сравнение исследования образцов на 1дМ против Тгеропета раШйит с помощью единичного формата иммуносорбции и с помощью мультиплексного формата иммуносорбции в соответствии с настоящим изобретением

	Единичный формат иммуносорбции 1дМ	Мультиплексный формат иммуносорбции 1дМ
ΒΓΙ	Соотношение	ΚΓΙ	Соотношение
Величина отсечки
среднее отрицательных/0,3			150	1,00	152	1,00
Образцы, отрицательные в отношении 1дС против
Тгеропета раШ^ит	и		45	0,30	46	0,30
1дМ против Тгеропета
ра1Н(1иш Среднее (п=35)
		1	38	0,25	38	0,25
Образцы,
положительные в
отношении 1дб		2	51	. '0,34	58	0,38
против Тгеропета раШ^ит и				Ό-5 1
отрицательные в отношении 1дМ против Тгеропета раШдит (п=3)		3	38	0,25	41	0,27
Образцы,		4	286	1,91	241	1,59
положительные в
отношении 1дМ против Тгеропета		5	185	1,23	192	1,26
раНМцт и отрицательные в		6	996	6,64	884	5,82
отношении
(суммарных) 1дС против Тгеропета ра1Ис1ит (п=4)		7	293.	1,95	324	2,13

Очень хорошее различие отмечается между образцами, отрицательными в отношении 1дМ против Тгеропета раШйит (п=35+3), и образцами, положительными в отношении 1дМ против Тгеропета ра1Ιίάιιιη (п=3) в исследовании 1дМ против Тгеропета раШйит посредством иммуносорбции, независимо проводилось ли посредством единичного формата или мультиплексного формата в соответствии с настоящим изобретением.

Таким образом, эти результаты показывают, что чувствительность выявления 1дМ посредством иммуносорбции не снижается путем объединения с сэндвич-исследованием в мультиплексном способе по настоящему изобретению.

Все положительные образцы действительно найдены положительными с помощью способа по настоящему изобретению, который, таким образом, делает возможным также получить хорошую клиническую чувствительность.

В заключение, результаты, полученные в примерах 2, 3 и 4, используя мультиплексный способ по настоящему изобретению, который объединяет выявление 1дМ посредством иммуносорбции и выявление суммарных 1д посредством сэндвич-анализа, отчетливо демонстрируют, что способ по настоящему изобретению дает возможность осуществлять чувствительное выявление и дифференцирование антител класса суммарных 1д или 1дС и 1дМ, направленных против одного и того же микроорганизма. Специалисты в данной области на основании этого без труда сделают вывод, что этот способ мультиплексного выявления 1дС и 1дМ по настоящему изобретению действительно представляет собой способ общего применения, который может быть адаптирован для многих микроорганизмов, для которых это имеет большое значение с диагностической точки зрения для выявления суммарных 1д и 1дМ.

- 20 017206

Более того, способ по настоящему изобретению может быть без труда автоматизирован посредством использования автоматического устройства, например, такого как ВюР1ех 2200 от Вю-Каб, который позволяет осуществлять протоколы исследования одновременно и быстро в одном сосуде и считывать сигналы на одной стадии.

Claims (18)

1. Способ ίη νίΙΐΌ диагностического выявления инфицирования микроорганизмом, предусматривающий одновременное выявление ί) иммуноглобулинов О или суммарных иммуноглобулинов, направленных против указанного микроорганизма, и ίί) иммуноглобулинов М, направленных против указанного микроорганизма, присутствующих в биологическом образце, указанный способ включает следующие стадии:

a) размещение биологического образца в одном аналитическом сосуде в присутствии частиц, несущих по меньшей мере один специфический детектируемый физический параметр и принадлежащих по меньшей мере двум различным группам, одной из групп, несущей иммобилизованное антитело против 1дМ, для того, чтобы захватывать иммуноглобулины М, направленные против указанного микроорганизма, и другой группе, несущей иммобилизованный антиген, полученный из указанного микроорганизма, для того, чтобы захватить иммуноглобулины О или суммарные иммуноглобулины, направленные против указанных микроорганизмов;

b) инкубирование смеси в условиях, которые дают возможность образования иммунологических комплексов, с одной стороны, между иммобилизованным анти-1дМ антителом и антителами 1дМ и, с другой стороны, между иммобилизованным антигеном, полученным из указанного микроорганизма, и 1дО или суммарными иммуноглобулинами, на каждой группе частиц;

c) выведение иммуноглобулинов, которые не связались с частицами;

ά) инкубирование смеси, полученной после выведения не связавшихся иммуноглобулинов, как указано в стадии с), по меньшей мере с одним меченым конъюгатом, указанный по меньшей мере один конъюгат состоит исключительно из выявляющего антигена, полученного из указанного микроорганизма, для того, чтобы определить иммунокомплексы между иммобилизованным антигеном, полученным из указанного микроорганизма, и 1дО или общими иммуноглобулинами;

е) выведение выявляющего антигена, не связавшегося с иммунными комплексами со стадии Ь);

Г) одновременное выявление с помощью детектора, способного дифференцировать две группы частиц, упомянутых выше, иммунных комплексов со стадии ά) на каждой частице, посредством чего обнаруживается присутствие или отсутствие иммуноглобулинов О или суммарных иммуноглобулинов и/или иммуноглобулинов М, направленных против указанного микроорганизма.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что антиген, полученный из микроорганизма, выбран из группы, состоящей из лизата указанного микроорганизма, одного из его природных антигенов, который был полуочищен или очищен, рекомбинантного белка, его фрагмента и синтетического пептида.

3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что группы указанных частиц отличаются одна от другой посредством флуорохромов, выявляемых подходящим детектором.

4. Способ по любому из пп.1-3, в котором подходящим детектором является проточный цитометр.

5. Способ по любому из пп.1-4, в котором выявляющий антиген несет биотин, который обнаруживается добавлением меченого авидина или меченого стрептавидина.

6. Способ по любому из пп.1-5, в котором биологический образец представляет собой плазму или сыворотку.

7. Способ по любому из пп.1-6, в котором биологический образец получен от человека.

8. Способ по любому из пп.1-7, отличающийся тем, что указанный микроорганизм выбран из группы, состоящей из вирусов, бактерий и одноклеточных паразитов.

9. Способ по п.8, отличающийся тем, что указанный микроорганизм выбран из группы, состоящей из вирусов гепатита человека.

10. Способ по п.9, отличающийся тем, что указанный микроорганизм выбран из группы, состоящей из вируса гепатита А человека (НАУ) и вируса гепатита В человека (НВУ).

11. Способ по п.10, отличающийся тем, что указанный микроорганизм представляет собой вирус гепатита А человека (НАУ) и что получают нижний предел определения для суммарных иммуноглобулинов против НАУ приблизительно 20 мМЕ/мл.

12. Способ по п.8, отличающийся тем, что указанный микроорганизм представляет собой Тгеропета ра1Шит.

13. Способ по любому из пп.1-12, в котором частицы представляют собой суперпарамагнитные частицы.

14. Набор реагентов для проведения способа выявления по любому из пп.1-13, содержащий частицы, несущие по меньшей мере один специфический детектируемый физический параметр и принадлежащие по меньшей мере двум различным группам, одной из групп, несущей иммобилизованное антитело против 1дМ, и другой группе, несущей иммобилизованный антиген, полученный из выявляемого микро

- 21 017206 организма.

15. Набор по п.14, отличающийся тем, что указанный микроорганизм выбран из группы, состоящей из вирусов, бактерий и одноклеточных паразитов.

16. Набор по п.15, отличающийся тем, что указанный микроорганизм выбран из группы, состоящей из вирусов гепатита человека.

17. Набор по п.16, отличающийся тем, что указанный микроорганизм выбран из группы, состоящей из вируса гепатита А человека (НАУ) и вируса гепатита В человека (НВУ).

18. Набор по п.15, отличающийся тем, что указанный микроорганизм представляет собой Тгеропета раШбит.