JP2875552B2 - 非特異吸着排除の抗体測定方法及び測定試薬 - Google Patents
非特異吸着排除の抗体測定方法及び測定試薬Info
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は非特異吸着を排除した抗体の測定方法及び測
定試薬に関し、詳しくは固相と血清検体を接触せしめて
検体中の抗体を測定する方法および測定試薬において、
該接触に伴って起こる非特異吸着を排除して検出感度を
向上させた測定方法及び測定試薬に関する。
定試薬に関し、詳しくは固相と血清検体を接触せしめて
検体中の抗体を測定する方法および測定試薬において、
該接触に伴って起こる非特異吸着を排除して検出感度を
向上させた測定方法及び測定試薬に関する。
固相を用いる免疫学的測定において、固相に対する抗
体の非特異な吸着によって測定結果に誤差がもたらされ
ることはしばしば経験されるところであり、例えば、下
記文献１）〜４）がある。
体の非特異な吸着によって測定結果に誤差がもたらされ
ることはしばしば経験されるところであり、例えば、下
記文献１）〜４）がある。
１） E.J.Shillitoe:J.of Virological Methods,4,（1
982）241−248 （イー．ジェー．シリトー：ジェー．オブ ビロロジカ
ル メソッド,4,（1982）241−248） ２） 沢田高志等：臨床と研究,62巻１号（1985）311−
318頁 ３） 沢田高志等：臨床と研究,63巻11号（1986）3818
−3822頁 ４） 特公昭64−54356号公報 即ち、１）によれば長期保存した血清検体において、
また２）,3）によれば加熱非働化した血清検体におい
て、それぞれ検体中に変性あるいは凝集したIgG（変性
抗体と呼ぶ）が生成し、これが固相に非特異な吸着をし
て測定結果に誤差がもたらされることが記載されてい
る。１）ではカオリン添加の前処理により、また２）,
3）では性能のよいカップ洗浄機を使用したり、カット
オフ値を適正に設定することによりそれぞれ変性抗体の
非特異吸着による測定誤差を排除することができると述
べられている。一方４）によれば測定のために加えられ
る標識された抗体（標識抗体と呼ぶ）が固相に非特異な
吸着をして測定結果に誤差がもたらされることが記載さ
れており、pH8.0〜9.5の緩衝液中で固相に標識抗体を反
応させることにより標識抗体の非特異吸着による測定誤
差を抑制することができると述べられている。
982）241−248 （イー．ジェー．シリトー：ジェー．オブ ビロロジカ
ル メソッド,4,（1982）241−248） ２） 沢田高志等：臨床と研究,62巻１号（1985）311−
318頁 ３） 沢田高志等：臨床と研究,63巻11号（1986）3818
−3822頁 ４） 特公昭64−54356号公報 即ち、１）によれば長期保存した血清検体において、
また２）,3）によれば加熱非働化した血清検体におい
て、それぞれ検体中に変性あるいは凝集したIgG（変性
抗体と呼ぶ）が生成し、これが固相に非特異な吸着をし
て測定結果に誤差がもたらされることが記載されてい
る。１）ではカオリン添加の前処理により、また２）,
3）では性能のよいカップ洗浄機を使用したり、カット
オフ値を適正に設定することによりそれぞれ変性抗体の
非特異吸着による測定誤差を排除することができると述
べられている。一方４）によれば測定のために加えられ
る標識された抗体（標識抗体と呼ぶ）が固相に非特異な
吸着をして測定結果に誤差がもたらされることが記載さ
れており、pH8.0〜9.5の緩衝液中で固相に標識抗体を反
応させることにより標識抗体の非特異吸着による測定誤
差を抑制することができると述べられている。
さて、上記１）〜４）に提示されている変性抗体の非
特異吸着と標識抗体の非特異吸着とは共に固相に対する
抗体の吸着である点では同様のものとみられるが、実際
の測定操作の中では全く別の現象として処理される必要
がある。即ち、変性抗体と標識抗体とは物質として別異
であるほかに、前者の非特異吸着は固相法による測定に
おいて固相に検体血清が添加された時点での反応（第一
反応と呼ばれる）で起こり、後者の非特異吸着は第一反
応が完全に停止され引き続いて標識抗体が添加された時
点での反応（第二反応と呼ばる）で起こる。従って前者
の非特異吸着に対する排除処理は後者の非特異吸着に対
する抑制処理、例えば文献４）記載の技術とは別個の技
術であり、かつそれから容易に推考される技術でもな
い。変性抗体の非特異吸着の排除処理については文献
１）〜３）記載の技術があるが、これらよりもさらに簡
便かつ正確な技術が求められる。本発明はこれを課題と
してなされた。
特異吸着と標識抗体の非特異吸着とは共に固相に対する
抗体の吸着である点では同様のものとみられるが、実際
の測定操作の中では全く別の現象として処理される必要
がある。即ち、変性抗体と標識抗体とは物質として別異
であるほかに、前者の非特異吸着は固相法による測定に
おいて固相に検体血清が添加された時点での反応（第一
反応と呼ばれる）で起こり、後者の非特異吸着は第一反
応が完全に停止され引き続いて標識抗体が添加された時
点での反応（第二反応と呼ばる）で起こる。従って前者
の非特異吸着に対する排除処理は後者の非特異吸着に対
する抑制処理、例えば文献４）記載の技術とは別個の技
術であり、かつそれから容易に推考される技術でもな
い。変性抗体の非特異吸着の排除処理については文献
１）〜３）記載の技術があるが、これらよりもさらに簡
便かつ正確な技術が求められる。本発明はこれを課題と
してなされた。
本発明者らは上記の課題に対して種々の検討を行った
結果、固相に血清検体を添加するにあたり、該添加をpH
9〜10の条件下で行うことにより、変性抗体の固相への
非特異吸着を排除することができることを見出し、本発
明を完成した。
結果、固相に血清検体を添加するにあたり、該添加をpH
9〜10の条件下で行うことにより、変性抗体の固相への
非特異吸着を排除することができることを見出し、本発
明を完成した。
即ち、本発明は、固相に血清検体を添加して検体中の
抗体を測定する測定方法において、該添加をpH9〜10の
条件下で行うことを特徴とする測定方法を提供するもの
であり、更に本発明は、固相に血清検体を添加して検体
中の抗体を測定する測定試薬において、該添加の条件の
ためにpH9〜10の緩衝液が必須の構成成分となることを
特徴とする測定試薬をも提供するものである。
抗体を測定する測定方法において、該添加をpH9〜10の
条件下で行うことを特徴とする測定方法を提供するもの
であり、更に本発明は、固相に血清検体を添加して検体
中の抗体を測定する測定試薬において、該添加の条件の
ためにpH9〜10の緩衝液が必須の構成成分となることを
特徴とする測定試薬をも提供するものである。
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明の測定対象である抗体については特に限定され
るものではない。即ち、本発明は血清検体、特にヒト血
清検体に含まれる変性抗体の非特異吸着を問題としてと
りあげ、それに対する解決手段を提供するものであるか
ら、測定抗体自体はいかなる抗体であってもよい。
るものではない。即ち、本発明は血清検体、特にヒト血
清検体に含まれる変性抗体の非特異吸着を問題としてと
りあげ、それに対する解決手段を提供するものであるか
ら、測定抗体自体はいかなる抗体であってもよい。
検体は血清検体である。従って試料としては血清であ
り、あるいは血液であってもよい。
り、あるいは血液であってもよい。
固相はイムノアッセイ用のマイクロタイタープレート
のカップあるいはガラスビーズ等を用いればよい。固相
表面は常法により抗原をコートしておく。
のカップあるいはガラスビーズ等を用いればよい。固相
表面は常法により抗原をコートしておく。
本発明の測定方法および測定試薬は固相を使用する免
疫学的測定法を利用するものであり、例えば酵素免疫測
定法、放射免疫測定法、受身凝集法等を利用することが
できる。これらの方法における通常の手順自体はすでに
一般に公知であり、本発明に利用される。従って、例え
ば酵素免疫測定法を利用する場合について本発明測定方
法を説明すれば以下のごとくである。
疫学的測定法を利用するものであり、例えば酵素免疫測
定法、放射免疫測定法、受身凝集法等を利用することが
できる。これらの方法における通常の手順自体はすでに
一般に公知であり、本発明に利用される。従って、例え
ば酵素免疫測定法を利用する場合について本発明測定方
法を説明すれば以下のごとくである。
測定法で使用される成分は固相、抗原、検体血清、酵
素標識抗体、基質であり、他に緩衝液、希釈液、停止
液、標準抗体等が使用される。まず固相を抗原でコート
し、ここに検体血清をそのまま又は正常ウサギ血清で希
釈して添加し、よく洗浄後酵素標識抗体を添加し、よく
洗浄後基質を添加し、反応を停止後基質の分解量を測定
する。ここで、本発明の特徴は検体血清を添加するとき
にpH9〜10の条件下でこれが行われる点にある。該条件
のために酸またはアルカリを加えてpHを調整すればよい
が、通常は緩衝液の添加によってなされる。
素標識抗体、基質であり、他に緩衝液、希釈液、停止
液、標準抗体等が使用される。まず固相を抗原でコート
し、ここに検体血清をそのまま又は正常ウサギ血清で希
釈して添加し、よく洗浄後酵素標識抗体を添加し、よく
洗浄後基質を添加し、反応を停止後基質の分解量を測定
する。ここで、本発明の特徴は検体血清を添加するとき
にpH9〜10の条件下でこれが行われる点にある。該条件
のために酸またはアルカリを加えてpHを調整すればよい
が、通常は緩衝液の添加によってなされる。
本発明測定試薬は本発明測定方法を実施するためにの
み用意される試薬であるが、pH9〜10の緩衝液は必須の
成分であり、他にいくつかの使用成分を任意に選択して
加え、組み合わせてセットしたものでもよい。緩衝液の
種類はpH9〜10に緩衝能を持つものであればいずれであ
ってもよく、例えばリン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、
ホウ酸緩衝液等を使用することができる。緩衝液の濃度
は通常は0.05〜0.1M程度であるが、ケースに応じて決定
すればよい。また緩衝液を該緩衝液の成分固体の形で提
供し、同時に水を加えて溶解し所定の緩衝液とすること
は可能であり、これは実質的に本発明に含まれる。
み用意される試薬であるが、pH9〜10の緩衝液は必須の
成分であり、他にいくつかの使用成分を任意に選択して
加え、組み合わせてセットしたものでもよい。緩衝液の
種類はpH9〜10に緩衝能を持つものであればいずれであ
ってもよく、例えばリン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、
ホウ酸緩衝液等を使用することができる。緩衝液の濃度
は通常は0.05〜0.1M程度であるが、ケースに応じて決定
すればよい。また緩衝液を該緩衝液の成分固体の形で提
供し、同時に水を加えて溶解し所定の緩衝液とすること
は可能であり、これは実質的に本発明に含まれる。
後記実施例、実験例にみられるごとく本発明を成人Ｔ
細胞白血病ウィルス抗体（HTLV−Ｉ抗体）の測定に応用
したところ非常に良い結果を得ることができた。
細胞白血病ウィルス抗体（HTLV−Ｉ抗体）の測定に応用
したところ非常に良い結果を得ることができた。
本発明により、検体血清中、とりわけ長期保存した、
あるいは加熱非働化した検体血清中の変性抗体の非特異
吸着が排除される。従って本発明の作用は該排除による
検出感度の向上にある。
あるいは加熱非働化した検体血清中の変性抗体の非特異
吸着が排除される。従って本発明の作用は該排除による
検出感度の向上にある。
以下、実施例により本発明を更に詳細に説明するが、
本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１ HTLV−Ｉ抗原を0.05Mトリス塩酸緩衝液（pH8.0）にて
10μg/mlの濃度に調整し、マイクロタイターウェルに10
0μずつ分注し、４℃下に一晩放置する。ウェルを蒸
溜水で洗浄し、各ウェルに0.1Mホウ酸緩衝液でpH9.5に
調整した正常ウサギ血清を第１反応用溶液として100μ
ずつ加える。ここに検体血清20μずつ加え、37℃に
て60分間インキュベート（incubate）する（第１反
応）。ウェル内を0.01％ツイーン（Tween）20を含む生
理食塩水にて洗浄後、各ウェルにアルカリフォスファタ
ーゼ標識抗ヒトグロブリン抗体を100μずつ加え、37
℃にて60分間インキュベートする（第２反応）。ウェル
内を0.01％ツイーン20を含む生理食塩水にて洗浄後、各
ウェルに基質液（4mg/mlのｐ−ニトロフェニルフォスフ
ェート）を100μずつ加え、37℃にて30分間インキュ
ベートする（第３反応）。各ウェルに1N NaOH液を100μ
ずつ加えて反応を停止した後、反応液につき波長405n
mにおける吸光値を測定する。カットオフ値はOD 405nm
における吸光値で0.08とし、これ以上の吸光値を示した
時HTLV−Ｉ抗体陽性、これ未満の吸光値を示した時HTLV
−Ｉ抗体陰性と判定した。
10μg/mlの濃度に調整し、マイクロタイターウェルに10
0μずつ分注し、４℃下に一晩放置する。ウェルを蒸
溜水で洗浄し、各ウェルに0.1Mホウ酸緩衝液でpH9.5に
調整した正常ウサギ血清を第１反応用溶液として100μ
ずつ加える。ここに検体血清20μずつ加え、37℃に
て60分間インキュベート（incubate）する（第１反
応）。ウェル内を0.01％ツイーン（Tween）20を含む生
理食塩水にて洗浄後、各ウェルにアルカリフォスファタ
ーゼ標識抗ヒトグロブリン抗体を100μずつ加え、37
℃にて60分間インキュベートする（第２反応）。ウェル
内を0.01％ツイーン20を含む生理食塩水にて洗浄後、各
ウェルに基質液（4mg/mlのｐ−ニトロフェニルフォスフ
ェート）を100μずつ加え、37℃にて30分間インキュ
ベートする（第３反応）。各ウェルに1N NaOH液を100μ
ずつ加えて反応を停止した後、反応液につき波長405n
mにおける吸光値を測定する。カットオフ値はOD 405nm
における吸光値で0.08とし、これ以上の吸光値を示した
時HTLV−Ｉ抗体陽性、これ未満の吸光値を示した時HTLV
−Ｉ抗体陰性と判定した。
以下、実験例により本発明の効果を説明する。
実験例１ イ）試料 HTLV−Ｉ抗体陰性の２人の正常人の血清を、56℃にて
30分間加熱非働化することにより、非特異的反応を呈す
る様になった検体（非働化非特異検体1,2）と、HTLV−
Ｉ抗体陽性コントロールとして、HTLV−Ｉキャリアーの
血清を用いた。
30分間加熱非働化することにより、非特異的反応を呈す
る様になった検体（非働化非特異検体1,2）と、HTLV−
Ｉ抗体陽性コントロールとして、HTLV−Ｉキャリアーの
血清を用いた。
ロ）方法 上記イ）の試料につき、実施例１記載の方法によって
HTLV−Ｉに対する免疫学的反応性における陽否を判定し
た。ただし、実施例１記載における第１反応用溶液とし
て各々pH調整した下記（ａ）〜（ｃ）を使用した。
HTLV−Ｉに対する免疫学的反応性における陽否を判定し
た。ただし、実施例１記載における第１反応用溶液とし
て各々pH調整した下記（ａ）〜（ｃ）を使用した。
（ａ） 0.1Mリン酸緩衝化第１反応用溶液（pH6.5,7.0,
7.5に各々緩衝化した正常ウサギ血清） （ｂ） 0.05Mトリス塩酸緩衝化第１反応用溶液（pH8.
0,8.5に各々緩衝化した正常ウサギ血清） （ｃ） 0.1Mホウ酸緩衝化第１反応用溶液（pH9.0,9.5,
10.0に各々緩衝化した正常ウサギ血清） ハ）結果 結果を図１に示す。
7.5に各々緩衝化した正常ウサギ血清） （ｂ） 0.05Mトリス塩酸緩衝化第１反応用溶液（pH8.
0,8.5に各々緩衝化した正常ウサギ血清） （ｃ） 0.1Mホウ酸緩衝化第１反応用溶液（pH9.0,9.5,
10.0に各々緩衝化した正常ウサギ血清） ハ）結果 結果を図１に示す。
図１から明らかなように、非働化非特異検体は、第１
反応用溶液のpHが5.6〜8.5の時カットオフ値以上の吸光
値を示して陽性（偽陽性）と判定されたが、pH9.0〜10.
0の時にはカットオフ値以下の吸光値を示しており、陰
性と判定された。陽性コントロールは、各pHの第１反応
用溶液を用いてもカットオフ値以上の吸光値を示してお
り、陰性化することはなかった。これらの結果は、第１
反応用溶液のpHを9.0〜10.0に上昇させることにより、
非特異的な反応のみがより有効に除去されることを示す
ものである。
反応用溶液のpHが5.6〜8.5の時カットオフ値以上の吸光
値を示して陽性（偽陽性）と判定されたが、pH9.0〜10.
0の時にはカットオフ値以下の吸光値を示しており、陰
性と判定された。陽性コントロールは、各pHの第１反応
用溶液を用いてもカットオフ値以上の吸光値を示してお
り、陰性化することはなかった。これらの結果は、第１
反応用溶液のpHを9.0〜10.0に上昇させることにより、
非特異的な反応のみがより有効に除去されることを示す
ものである。
なお、本実験においては、pH9.0〜10.0の第１反応用
溶液としてホウ酸緩衝化第１反応用溶液を用いたが、グ
リシン水酸化ナトリウム緩衝化第１反応用溶液、ベロナ
ール塩酸緩衝化第１反応用溶液、炭酸重炭酸緩衝化第１
反応用溶液を用いた時も同様の結果を得た。
溶液としてホウ酸緩衝化第１反応用溶液を用いたが、グ
リシン水酸化ナトリウム緩衝化第１反応用溶液、ベロナ
ール塩酸緩衝化第１反応用溶液、炭酸重炭酸緩衝化第１
反応用溶液を用いた時も同様の結果を得た。
実験例２ イ）試料 HTLV−Ｉ抗体陰性の正常人の血清90検体と、HTLV−Ｉ
抗体陽性コントロールとして、HTLV−Ｉキャリアーの血
清を用いた。
抗体陽性コントロールとして、HTLV−Ｉキャリアーの血
清を用いた。
ロ）方法 上記イ）の試料につき、実施例１記載の方法によって
HTLV−Ｉに対する免疫学的反応性における陽否を判定し
た。ただし、実施例１記載における第１反応用溶液とし
て実験例１記載におけるpH8.0とpH9.5の第１反応用溶液
を使用した。
HTLV−Ｉに対する免疫学的反応性における陽否を判定し
た。ただし、実施例１記載における第１反応用溶液とし
て実験例１記載におけるpH8.0とpH9.5の第１反応用溶液
を使用した。
ハ）結果 結果を図２に示す。
図２から明らかなように、pH8.0の第１反応用溶液を
用いた時には、４検体（4.4％）がカットオフ値以上の
吸光値を示し陽性（偽陽性）と判定されたが、pH9.5の
第１反応用溶液を用いた時には全てカットオフ値以下の
吸光値を示し、非特異的な反応により偽陽性と判定され
る例はなかった。また陽性コントロールの吸光値はpH9.
5の第１反応用溶液を用いた時にpH8.0の第１反応用溶液
を用いた時よりもやや低い吸光値を示したが、大差はな
かった。
用いた時には、４検体（4.4％）がカットオフ値以上の
吸光値を示し陽性（偽陽性）と判定されたが、pH9.5の
第１反応用溶液を用いた時には全てカットオフ値以下の
吸光値を示し、非特異的な反応により偽陽性と判定され
る例はなかった。また陽性コントロールの吸光値はpH9.
5の第１反応用溶液を用いた時にpH8.0の第１反応用溶液
を用いた時よりもやや低い吸光値を示したが、大差はな
かった。
これらの結果は、正常人検体を用いた時においても、
pHを9.5に上昇させた第１反応用溶液を用いることによ
り、非特異反応を有効に除去できることを示すものであ
る。
pHを9.5に上昇させた第１反応用溶液を用いることによ
り、非特異反応を有効に除去できることを示すものであ
る。
図１は実験例１の結果を示すグラフ、図２は実験例２の
結果を示すグラフである。
結果を示すグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭63−301896（ＪＰ，Ａ) 特開 昭64−54356（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) G01N 33/531 G01N 33/574 ＢＩＯＳＩＳ ＰＲＥＶＩＥＷＳ
Claims (3)
- 【請求項１】固相に血清検体を添加して検体中の抗体を
測定する測定方法において、該添加をpH9〜10の条件下
で行い、検体中に変性あるいは凝集したIgG（変性抗
体）の非特異吸着を排除することを特徴とする測定方
法。 - 【請求項２】抗体が成人Ｔ細胞白血病ウィルス抗体（HT
LV−Ｉ抗体）である請求項１記載の測定方法。 - 【請求項３】固相に血清検体を添加して検体中の抗体を
測定する測定試薬において、該添加の条件のためにpH9
〜10の緩衝液が必須の構成成分となることを特徴とする
変性抗体の非特異吸着を排除した測定試薬。
Priority Applications (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1229753A JP2875552B2 (ja) | 1989-09-05 | 1989-09-05 | 非特異吸着排除の抗体測定方法及び測定試薬 |
| DK90116658.7T DK0416466T3 (da) | 1989-09-05 | 1990-08-30 | Ikke-specifik adsorptionsfri metode til assaybestemmelse af antistof samt assayreagens |
| DE69017562T DE69017562T2 (de) | 1989-09-05 | 1990-08-30 | Nichtspezifische adsorptionsfreie Methode zur Bestimmung eines Antikörpers und Bestimmungsreagentien. |
| EP90116658A EP0416466B1 (en) | 1989-09-05 | 1990-08-30 | Nonspecific adsorption-free method for assaying antibody and assay reagent |
| AT90116658T ATE119670T1 (de) | 1989-09-05 | 1990-08-30 | Nichtspezifische adsorptionsfreie methode zur bestimmung eines antikörpers und bestimmungsreagentien. |
| KR1019900013861A KR920007162B1 (ko) | 1989-09-05 | 1990-09-03 | 비특이 흡착을 배제하는 항체측정방법 및 측정시약 |
| NO903830A NO179468C (no) | 1989-09-05 | 1990-09-03 | Fremgangsmåte for å bestemme antistoff og assayreagenssett for dette |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1229753A JP2875552B2 (ja) | 1989-09-05 | 1989-09-05 | 非特異吸着排除の抗体測定方法及び測定試薬 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0392760A JPH0392760A (ja) | 1991-04-17 |
| JP2875552B2 true JP2875552B2 (ja) | 1999-03-31 |
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Family Applications (1)
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|---|---|---|---|
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|---|---|
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| JP (1) | JP2875552B2 (ja) |
| KR (1) | KR920007162B1 (ja) |
| AT (1) | ATE119670T1 (ja) |
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| DK (1) | DK0416466T3 (ja) |
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| US5124245A (en) * | 1989-02-09 | 1992-06-23 | Eastman Kodak Company | Wash composition, test kit and their use to determine a herpes simplex viral antigen |
-
1989
- 1989-09-05 JP JP1229753A patent/JP2875552B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1990
- 1990-08-30 AT AT90116658T patent/ATE119670T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-08-30 DE DE69017562T patent/DE69017562T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1990-08-30 EP EP90116658A patent/EP0416466B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-08-30 DK DK90116658.7T patent/DK0416466T3/da active
- 1990-09-03 KR KR1019900013861A patent/KR920007162B1/ko not_active Expired
- 1990-09-03 NO NO903830A patent/NO179468C/no not_active IP Right Cessation
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| Publication number | Publication date |
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| ATE119670T1 (de) | 1995-03-15 |
| EP0416466A1 (en) | 1991-03-13 |
| EP0416466B1 (en) | 1995-03-08 |
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| NO903830L (no) | 1991-03-06 |
| NO179468C (no) | 1996-10-09 |
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| NO903830D0 (no) | 1990-09-03 |
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