JPH0243947A - 免疫検定およびバイオアフイニテイ分離のための蛋白質固定化への疎水性基で誘導体化されたポリ（エチレンイミン）の応用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は疎水性基で誘導体化されたポリ（エチレンイミ
ン）によるプラスチック表面を予め活性化すること、特
に、パイオアフィニティ分離および免疫検定におけるこ
れらの予め活性化された表面を使用することに関する。

アフイニテイ分離は、ある分子が他の分子に対して有し
ているアフィニティを利用して分離を行なう方法である
。バイオアフィニティ分離は要素の一方が生物学的な興
味を有するものであるかまたは生物学的活性を有するよ
うなアフイニテイ分離として定義される。即ちバイオア
フィニティ分離は、結合対の要素の１つとして、蛋白質
または核酸のような、少なくとも１つの生物巨大分子を
包含している。バイオアフィニティ結合対の例は制定す
るものではないが、抗原−抗体、基質−酵素、エフェク
ター−酵素、阻害剤−酵素、相補的核酸鎖、結合蛋白質
−ビタミン、結合蛋白質−核酸、反応性染料−蛋白質お
よび反応性染料−核酸、ビオチン−アビジンおよび蛋白
Ａ實−工ｇＧヲ包含する。

バイオアフィニティ分離ハ、バイオアフィニティ結合対
の一方が、共有結合的にか、または非特異的吸着により
結合するパイオアフィーティ選択吸着剤上で行なわれる
。次にバイオアフィニティ結合対のもう一方は、それが
このバイオアフィニティ選択吸着剤と接触する際にその
相手と結合する。バイオアフィニティ結含対の要員らが
互いに結合した後に、バイオアフィニティ選択吸着剤と
接触しなかった万を、実験条件に応じた袖々の試薬で溶
離できる。

Ｗｅｅｔ８１のｒＭｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ
ｏｇｙＪ、Ｖｏｌ。

ＸＬＩＶ　ｉ　ｌｍｍ０１）１１１Ｚｅｄ　　Ｅｎｚｙ
ｍｅｓ、Ｃｈａｐｔｅｒ　　１０　。

１３４、Ｅｄ、に、Ｍｏ５ｂａｃｈ、Ａｃａｄｅｍｉｃ
　　Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ（１９７３）には、無機担体表面
を共有結合的に修飾する種々の方法が記載されている。

バイオアフィニティ結合対の一方が共有結合することが
好ましいが、固定化分子へ無関係な蛋白質が非特異的に
結合したり、共有結合した分子の結合特性が変化したり
、そして、分子の担体への非可逆的結合により稀少なま
たは高価な分子を回収できなくなるといった、いくつか
の欠点を有している。

ＭｅｓｓｉｎｇのｒＭｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏ
ｌｏｇｙ、　Ｍｏ１−。

ＸＬＩＶ　＋　Ｉｍｍｏｂｉｌｌｚｅｄ　Ｅｎｚｙｍｅ
ｓ　、　Ｃ’ｈａｐｔｅｒ　１１．１４９＋Ｅｄ、　Ｋ
、　Ｍｏ５ｂａｃｈ、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ
、　ＮＹ（１９７３）は、別の一般的な結合方法である
、バイオアフィニティ結合対の一方の担体への非特異的
吸着を記載している。この方法もまた、支持体へ分子を
結合させる力が弱いために担体上に非特異的に吸着され
た分子を保持できないという欠点を有している。別の問
題点は担体へ吸着された分子の結合特性の部分的変化で
ある。

表面を物理的または化学的（−誘導体化することにより
、プラスチック表面へ生物学的分子を固定化するその他
の方法が開発されている。

１９８７年４月１４日にＣ）ａｄｏｗ等に発行された米
国特許４，６５７，８７３号は、フェニルアラニンおよ
びリジンのアミノ酸よりなる両性ポリペプチドでプラス
チック表面をコーティングすることによるプラスチック
表面の予め活性化が開示されている。疎水性のフェニル
アラニン残基がプラスチック表面へのポリペプチドの吸
Ｎを可能（ユし、−万、親水性のりジン残基が、有機化
学的および生物学的物質の固定化に側用される。

Ｃ）ａｄ　ｏｗの方法の１つの問題的は、有利なポリペ
プチドが容易に入手できず、非常に高価なことである。

また、ポリペプチドは臨床試料中存在しえるプロテアー
セにより攻撃され易い。プラスチック表面（−コーティ
ングされたポリペプチド？プロテアーセが分解するか否
かは、表面のポリペプチドの三次構造に依存している。

ポリペプチドの意図しない分解が起こった場合、検定結
果には大きな誤りが含まれることになる。

同様に、（）ａｄｏｗ等の、ｒＪ、　Ｃ１１ｎ、　Ｃｈ
ｅｍ、　Ｃ１１ｎ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、ｊ　ｐ７８９〜７９７．　ｖｏｌ、　
２１　、　ｎｏ、　１２（１９８３）には、ポリｐｈｅ
−１ｙｓ　ｆポリスチレンボールへ吸着させ、次にグル
タルアルデヒドで活性化し、そして必要なリガンドの結
合を行なう方法が開示されている。この方法は米国特許
４．６５７，８７３号に関して前述した方法と同様の欠
点を有している。

１９８７年３月３１日にＬｅｎｔｆｅｒ等へ発行された
米国特許４，６５４，２９９号は、ビス−ジアゾニウム
化合物で予め活性化したポリスチレン表面への蛋白質の
固定化を開示している。この方法の主な欠点は、ビス−
ジアゾニウム化合物およびその前駆体であるベンジジン
が高い発癌性を宵することである。

１９８４年４月２４日にＦｏｓｔｅｒ等に発行された米
国特＃Ｔ−４，４４４，８７９号は、反応体との化学反
応に対し不活性な光透過性で水不溶性材料、および、反
応体と共有結合を形成できろような結合した化学基を有
する合成重合体樹脂の乾燥被膜を包ざする免役反応反応
体を固定化するための固相支持体を開示している。材料
の少なくとも一部が乾燥被膜でコーティングされる。

１９７７年１月４日にＢａｒｒｅｔｔｆ：　発行された
米国特許４．Ｃ１０１，５８３号は、生物学的物質？プ
ラスチック表面に共有結合させるためのプラスチック表
面のグルタルアルデヒドによる前処理を開示している。

グルタルアルデヒドは、脂肪族アミンまたはジアミンで
表面を予め処理するかまたは処理せずに、プラスチック
材料の内部表面上で直接重合させろ。

１９８１年７月２１日にＨｕｉｚｉｎｇａに発行された
米国特許４．２７９．７８７号は、式０ＨＣ−Ｘ−ＣＨ
ＯＣ式中Ｘはアルキレンまたはンクロアルキル基である
〕のアルデヒドで前処理することを包含する、水不溶性
で疎水性重合体物質の表面（：抗原活性物質を結合する
方法を開示している。

１９８２年１０月５日にＮａｋａｓｈｉｍａ　％　に発
行された米国特許４，３５２，８８４号は生物活性物質
を固定化するための疎水性アクリル重合体でコーティン
グされた担体を開示している。

１９８１年７月１４日にＨａｉｅｓ等に発行された米国
特♂ｆ４．２７８，６５１号は、受答体の支持体へ共有
結合を媒介するような少なくとも１つの官能基を宮む水
不溶性電合体を何する固体支持体を開示している。

欧州特許出願８．５１０９４１８．０号は、大分子を結
合するだめの組合体表面の化学修飾のためのブラスマ修
飾方法を開示している。

本発明は、比較的低価格で調製でき、入手が容易で、環
境に脅威を与えず、発癌性の無いような、疎水性基で誘
導体化した（　ｄｅｒｉｖａｔｉｚｅｄｗｉｔｈ　ａ　
ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ　ｇｒｏｕｐ）ポリ（エチレン
イミン）を使用した生物学的物質のプラスチック表面へ
の固定化のための１つの代替法を提供する。プラスチッ
ク表面の結合容ｆｆ１Ｕ実寅的に増加し、結合物質の生
物学的活性を著しく変化させず、そして、結合物質は脱
着１＝対して抵抗性を打する。

典型的には、本発明は疎水性基で誘導体化されたポリ（
エチレンイミン）で予め活性化されたプラスチック表面
に関する。本発明はさらに、このような表面の調製方法
、並びにこのような予め活性化された表向の免役検定お
よびバイオアフィニティ分離における使用に関する。

プラスチック担体表面は疎水性基で誘導体化されたポリ
（エチレンイミン）　（ＰＥＩ）のｍ＆でコーティング
される。ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン
およびアクリル樹脂の二うな桟々のプラスチックが、多
くの形態、例えば、力価評定用マイクロプレート、パド
ル、膜、試験管、ボールおよび格子のような形態で使用
できる。好ましいプラスチックＩｒｌ’Ａ“ホール、マ
イクロプレートおよびコーティング試験管の形態で使用
できるポリスチレンである。これらの固体支持体は不均
一免疫検定（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓｉｍｍｕｎｏ
ａｓｓａｙ　）およびバイオアフィニティ分離において
最も一般的に使用されている。

当業者の知る多くの疎水性基を用いてＰＥＩを誘導体化
できる。例えば、ベンゾイル基およびトシル基ン挙げる
ことができる。本発明の好ましい化合物ハトシル−ＰＥ
Ｉである。

ＰＥＩ　Ｕランダムに形成されるため、その構造は特定
の単菫体単位の均質な整列を有していない。このランダ
ムに配向した重合体を単一の化学式とすることは困難で
あるが、その調製は容易である。例えば、トシルＰＥＩ
はポリ（エチレンイミン）を水中で塩化トシルと反応さ
せ、透析によるか、またはセファデックス（５ｅｐｈａ
ｄｅｘ■）ゲルー過カラム上で精製することにより調製
できた。得られた生成／ａは水溶性で、極めて安定であ
り、そして、プロテアーセによる分′ｐｓを受は癲い。

この化合物をｙ４委するための費用は極めて低線である
。種々の疎水性基で誘導された多くのポリ（アルキルア
ミン）、例えばポリ（プロピルアミン）、ポリ（ブチル
アミン）等がプラスチック表面を予め活性化するために
適当であると理解されたい。

疎水性基で誘導体化されたＰｇＩによるプラスチック表
向のコーティングは希釈水溶液中で行なうことができる
。コーティングは数時間をかけて行なうことができ、ま
た、−夜で行なうこともできる。温度制限は無く、コー
ティングは室温または４°Ｃで行なりことができる。プ
ラスチック表面をコーティングするための好ましい条件
は、室温で一夜、０．１　Ｍ　！Ｊン酸塩緩衝液（ｐＨ
７、０）中、コーティング試薬（実施例３に記載のよう
な）１００マイクログラム／−を使用することである。

疎水性基で＃Ｓ導したポリ（エチレンイミン）でプラス
チック表面を予め活性化した後、バイオアフィニティ結
合対の一方を結合して、不均一免疫検定およびバイオア
フィニティ分＠＋＝使用する。下記は本発明に従って予
め活性化されたプラスチック表面への結合Ｃ：適するバ
イオアフィニティ結合対のいくつかを示すものであるが
、これらの例で全てというわけではない。その例は、抗
原−抗体、基實−酵素、エフェクター−酵素、阻害剤−
酵素、相補的核酸鎖、結合蛋白質−ビタミン、結合蛋白
質−核酸、反応性染料−蛋白質および反応性染料−核酸
、ビオチン−アビジンおよび蛋白質Ａ　−Ｉｇ（）であ
る。さらに、ポリリジンおよびポリエチレンイミンのよ
うな合成擬似結合蛋白質、または蛋白質Ａ、蛋白實Ｇ等
のような特異的結合の可能な他の１構造大分子も本発明
の範囲（ユ包宮される。実験方法に兄；じて結合対のど
ちらも固定化できる。

疎水性基で誘導体化したポリ（エチレンイミン）でコー
ティングしたプラスチック表面へのバイオアフィニティ
結合対の一方の結合は、当業者のよく知るホモニ官馳性
およびヘテロニ官能性の交叉結合試薬の何れのものを用
いても行なうことができる。例えば、グルタルアルデヒ
ド、エビクロロヒドリンおよヒドルエン−２，４−ジイ
ソシアネートが便用できる試薬のいくつかとして挙げら
れる。本発明の予め油性化した表向へのバイオアフィニ
ティ結合対の一方を結合するための好ましい方法は、室
温で２時間、固定化されるために選択された一方を予め
活性化されたプラスチック表面および５％グルタルアル
デヒドと反応させることである。

バイオアフィニティ結金対の要素は、疎水性へで誘導体
化されたポリ（エチレンイミン）へ直接結合でき、また
、担体分子に結合した後に疎水性へで誘導体化されたポ
リ（エチレンイミン）に結合することもできる。何れの
場合も、本発明の予め活性化したプラスチック表面Ｃ−
要素が固定化された後に、後記する実施例７および８に
示すようにして、これを多くの不均一免役検定様式並び
にパイオアフィニテイ分離に使用できる。

当然ながら、多くの変形が可能でありこれらに全て本発
明の範囲に含まれると理解されたい。

以下の実施例μ本発明を説明するものでありこれに制限
しない。

実施例　１ トシル−ポリ（エチレンイミン）（）シル−ＰＥＩ　）
の調製およびＮ製 ボ・す（エチレンイミン）（５０％水溶液、Ａｌｄｒｉ
ｃｈＣｈｅｍｉｃａｌ、　Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、　Ｗｉ
ｓｃｏｎｓｉｎ）　２グラムを蒸留水５０−に俗解した
。塩化トシル（０，１ＰＡｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃ
ａｌ、　Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、　Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）
および１８％水酸化カリウム２−をゆっくりＰＥ工ｌ′
ｇｇに添加し、これと同時に激しく混合した。

混合物を２時間室温で攪拌し、次に蒸留水で透析し、１
００ばに希釈した。

実施例　２ ベンゾイル−ポリ（アリールアミン塩酸塩１塩）（ベン
ゾイル−ＰＡＡＨ）の調製および精製ポリ（アリールア
ミン塩酸塩）（高分子量、Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉ
ｃａｌ、　Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、　Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ
）１グラムを蒸留水２Ｏ−に溶解し、田を６Ｎ水酸化ナ
トリウムで８，０に調整した。塩化ベンゾイル（Ａｌｄ
ｒｉｃｈ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ、　Ｍｉｌｖａｕｋｅｅ、
　Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ　）０、５　ｔＲｔを溶液に添加
し、得られた混合物を２時間室温で撹拌した。白色の安
息香酸沈殿を遠心分離により除去し、生成物を蒸留水で
透析した。

生成物の純度は、生成物１−をセファデックスＧ−１５
カラム（ＩＸ２０ｍ）を辿しリン酸塩緩衝食塩水（ＰＦ
ＩＳ　ｐＨ１３）で溶離することにより分析した。ベン
ゾイル基吸着および遊離アミノ基検定ン、合わせた溶離
画分について行なったところ、ベンゾイルポリ（アリー
ルアミン）の純度は９４ると推定された。

実施例　３ トシル−ＰＲＩでコーティングされたポリスチレンポー
ル上への蛋白買の固定化 Ａ、　　）シル−ＰＥＩのポリスチレンボール上への吸
着 強“ポリスチレンホール（Ｐ］ｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃ
ａｌＣｏｍｐｕｎｙ、　Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、　Ｗｉｓｃ
ｏｎｓｉｎ　６１１０５　）　１５個を０，１Ｍリン酸
塩緩衝液（…７．０　）　５０−で１回洗浄した。次に
ポールを、−夜、室温で、０．１　Ｍリン酸塩緩衝液（
ＰＩ（７，０）中１００μが一トシルーＰＥＩ（実施例
１で調製）１０−とともに混合した。僅かに混濁してい
た溶液は透明となり、トシル−ＰＥＩがポリスチレンボ
ールに吸看されたことが示された。ボール？リン酸塩緩
衝食塩水（ＰＢＳ　、　１０ｍＭリン酸塩稜衝液、１５
０ｍＭ塩化ナトリウム、ＰＨ７，０）　５　ｍｌで５回
洗浄し、直接使用するかまたは４℃で保存した。

Ｂ、クルタルアルデヒドによるトシル−ＰＥＩでコーテ
ィングされたポリスチレンボールの活性化 上記したようにして１４製したポリスチレンボール１５
個を２時間室温で、５％グルタルアルデヒド（Ｓｉ、ｇ
ｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ、　Ｓｔ、　
Ｌｏｕｉｓ。

Ｍｉｓｓｏｕｒｌ　６３１７Ｂより入手した２５％溶液
より希釈ン５ゴと混合した。活性化の後、ボール？蒸留
水１０−で６回洗浄した。

Ｃ０活性化ポリスチレンボール上への蛋白質の固定化 活性化ポリスチレンボール（実施例３Ｂ　）　１０個乞
、固定化するべき蛋白質の種類に応じて、蛋白質１０μ
Ｖ／−〜１００μ？／ゴを含有する１０吐リン酸塩緩衝
液（…７．　Ｏ）　５　ｍｌと一夜呈温で混合した。反
応の後、ホールを洗浄緩衝液（１０ｍＭトリス（ヒドロ
キシメチル）アミノエタン、０．１％　Ｔｗｅｅｎ■２
０．１５０　ｍＭ　ｊ、ｔｆ化ナナトリウムよび０．３
％りｏｏアセトイミド、ｍ９．０）１０ｍで３回、そし
てＰＥ８１０　ｍで２回洗浄した。免疫検定に側用する
ボールの未反応活性部位を室温で２時間ＰＥＳ中１巧／
−ウ／血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ、　Ｃｈｅｍｉｃａ
ｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ、　ｓｔ　、　Ｌｏｕｉｓ、　Ｍｉ
ｓｓｏｕｒｉ６３１７８）２．５Ｔｎｔでブロックした
。ブロック佼、ホールを洗浄緩衝１３Ｘ１０−で３回、
２よび、ＰＢＳ　１０ゴで２回洗浄し、ＰＥ８９４°Ｃ
で保存した。

実施例　４ 固定化蛋白質総量の評１１Ｉｌｉによる他の一般的固定
化方法とトシル−ＰＥＩ固定化法の比較 Ａ、抗アルカリホスファターゼ（抗−ＡＰ　）モノクロ
ーナル抗体のヨウ素化 Ｊａｃｋｓｏｎ　　工ｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ　　
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ａｖｏｎｄａｌｅ　、　Ｐ
Ａ　１９５１１　）より入手したマウス抗アルカリホス
ファターゼモノクローナル抗体６ｍｙ　ｗ、Ｓ、Ｈ，５
ｙｎｄｅｒ等の方法（ｒＪｏｕｒｎａｌ　ｏｆＢｉｏｌ
、　Ｃｈｅｍ、Ｊ　２５１．５６８０〜５６８５．１９
７３）に従い、１２５ニーポルトン−ハンター試薬（１
５３ｍｃｉ／−１２２２０Ｃ１／ｍｍｏｌｅ　％Ｄｕ　
Ｐａｎｔ、　Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ。

Ｄｅｌａｗａｒｅ　１９８９８　）で標識した。標識さ
れた蛋白質の比活性は約０．０１８μＣｉ／μｔであっ
た。

Ｂ、ポリスチレンボール上への１２５１−抗−ＡＰの固
定化 上記実施例４で調製した１００μｒ／ｍの１２ｂ１−抗
−ＡＰ２ｄＹ用いて下記の方法に従って籠“ポリスチレ
ンボール５個をコーティングした。

（１）未誘導のポリスチレンボール、アルキルアミンボ
ール、ヒドラジドボールおよびサンガー（Ｓａｎｇｅｒ
）試薬ボールをＰｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ
ｍｐａｎｙ　（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、　Ｗｉｓｃｏｎｓｉ
ｎ　６１１０５）より入手した。スクンニルアルキルア
ミンホールはアルキルアミンボール（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃ
ｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ。

Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、　Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ　６１１０５
　）および過剰の無水コハク酸より、Ｐｌｅｒｃｅ　Ｃ
ｈｅｍｉｃａｌ　ＣＯｍｐａｎｙの推奨する方法に従っ
て調製した（　ｐ　４８　Ｐｌｅｒｃｅｌ　９８６〜８
７　Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ａｎｄ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｃａ
ｔａｌｏｇ）。

この方法はこれらのスタシニル化されたアルキルアミン
ボールへ蛋白質を結合させる方法も示している。

（２）　　＋２５１−抗一好を、実施例６Ｃの方法に従
って、トンルーＰＥＩでコーティングされたポリスチレ
ンポールおよびベンゾイル−ＰＡＡＨでコーテイングさ
れたポリスチレンボールに結合した。

（３）　　１２５Ｉ−抗−ＡＰを、実施例６Ｃの方法に
従い、−夜室温で蛋白質溶液中ボールをインキュベート
して、ブロックすることにより、未誘導ポリスチレンボ
ールに吸着させた。

（４）　　Ｇａｄｏｗ等の米国特許４．６５ス８７５号
に記載の方法に従い、蛋白質をポリ（フェニルアラニン
−リジン）でコーティングされたポリスチレンボール（
−固定化した。

（５）　　Ｔ、　５ａｉｔｏ　（Ｃ１ｉｎｉｃａ　Ｃｈ
ｉｍｉｃａ　Ａｃｔａ、　１３３．６０１〜３１０，１
９８３）の方法に従って、蛋白質ヲトルエンー２．４−
ジイソシアネートでコーティングされたポリスチレンボ
ールに固定化した。

（３）　　カルボキシルメチルラテックスでコーティン
グされたポリスチレンポールは、室温で２時間、ポリス
チレンボール１０個を、カルボキシエチルメチルラテッ
クス（Ｓｅｒａｇｅｎ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ。

Ｉｎｃ、、　Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、　Ｉｎ　４６
２０３）５−とともにインキュベートすることにより調
製した。ＰＢ３で洗浄した後、１２５ニー標識蛋白質を
結合させるための水溶性カルボジイミドでこれ？活性化
した。

蛋白質のカップリングが終了した後、全ポールを、８０
ｍＭ塩化ナトリウム＋０．１％Ｔｗｅｅｎ■２０（ｐＨ
６，０）５−で４回、および０．１Ｍ塩化ナトリウム５
−で４回洗浄した。これらのボールを０、１　Ｍ塩化ナ
トリウム５−中で保存した。

Ｃ１固定化された蛋白質の総量の計算 ポリスチレンホール上に結合した蛋白質の総置は、ボー
／Ｌ”ｋ、Ｂｐｃｋｍａｎ　Ｃ）ａｍｍａ■８００計数
システム（Ｂｅ　Ｃｋｍ＆　ｎ　工ｎ　Ｓ　ｔｒ　ｕｍ
ｅｎ　ｔＳ　＋　Ｉ　ｎ　Ｃ、＋　Ｆｕ　１１　ｅ　ｒ
　ｊ　Ｏｎ　＋Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ　９２６５４　）
で計数することにより、測定した。ボール５個の平均計
数値乞用いて、０．０１８マイクロキユーリー／マイク
ロダラムの比活性に基づき、蛋白質量を計算した。結果
を表１に示す。

実施例　５ 櫨々の結合方法でポリスチレンボール上へ固定化された
酵素の活性 β−ガラクト７ダーゼ（ＥＩＡ等級、Ｂｏｅｈｒｉｎｇ
ｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ　ＧｍｂＨＢｉｏｃｈｅｍｉｃａ
西独より入手）′ｆｊｒ：実施汐１４Ｂ（１）〜４Ｂ（
３）の種々の手順に従って、種櫨の活性化ポリスチレン
ボール（：結合させた。

洗浄して未結合の酵素を除去した後、各ボールに酵素基
質（５０ｍＭＮ−２−ヒドロキシエチルビにラジンーＮ
′−２−エタンスルホン酸、ＨＥＰＥＳ　。

ｐＨ７，７中２　ｍＭ　ｏ−ニトロフェニル−ガラクト
ピラノシド）１ゴを添加し、１０分間６７℃でインキュ
ベートすることによりボール上の酵素活性を測定した。

０．１Ｍ炭酸ナトリウム緩衝液（聞１１．５）１ｍ／？
：添加することにより反応乞停止し、４０６ｎｍｆ二お
ける吸光度をヒユーレットパラカード８４５０ダイオー
ドアレイ分光光度計（Ｈｅｗ−１ｅｔｔ　Ｐａｃｋａｒ
ｄ、　Ｐａ１ｏＡｌｔ、ｏ、　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ　
９４５０４）で測定した。吸光度は結合蛋白質の活性と
正比例していた。結果は表１１＝示す。

実施例　６ 棟々の結合方法によりポリスチレンボール上へ結合した
総抗体活性 実施例４で調製した１２５ニー抗−好ポリスチレンボー
ルを本実験で用いた。２μ２／−アルカリホスファター
セ（ＥＩＡ等級、ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉ
ｍ　Ｃ）ｍｂＨＢｉｏｃｈｅｍｉｃａ西独より入手）２
ｄ乞各ホールに添加し、室温で１．５時間混合した。

ボールを、８０　ｍＭ　＠化ナトリウム＋０゜１％Ｔｗ
ｅｅｎ■２０（１）Ｈ６，０）５−で４回、および０．
１Ｍ塩化ナトリウム５−で４回洗浄した。ボール上に固
定化された抗体により捕獲されたＡＰｉｌ、ｃ、酵素基
質（１５ｍＭ　４−　ニドｃｘフェニルホスフェ−）（
ＰＮＰＰ）、１Ｍジェタノールアミン、および０．．５
　ｍＭ塩化マグネシウム、ｐＨ８，９）１−を添加し、
１分間、３７℃でインキュベートすることにより測定し
た。０．５Ｍｘテｖンジ７　ミ７４　ｔ！ｎｆｆ　（Ｅ
ＤＴＡｍ９．［１）１−を添加することにより反応を停
止し、実施例５に記載したＨＰ８４５０分元光度計分岐
光度計測定した。吸光度は酵素活性に正比例し、これは
固定化された抗体の活性に比例する。結果は表１に示す
。

実施例　７ 櫨々の結合方法によりホリスチレンボールに固定化され
た抗−ＨＣＣ）を用いたヒト繊毛性ゴナドトロピン（β
−ＨＣＧ）サンドインチ酵素免疫偵定マウス抗−ＨＣＧ
モノクローナル抗体（Ｈｙｂｒｉ−ｔｅｃｈ、　Ｉｎｃ
、、　Ｓａｎ　ＤｉｅｇＯ，Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ）　
Ｙ実施例４の方法に従って種々の活性化ポリスチレンボ
ールに固定化した。抗−ＨＣ（）アルカリホスファター
ゼ５０マイクロリツトルおよびＨＣ（）カリブレーター
１００マイクロリツトル（ともにｇ、　Ｉ。

ｄｕ　Ｐｏｎｔ　ｄｅ　Ｎｅｍｏｕｒｓ　＆　Ｃｏ、、
　Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ。

Ｄｅｒａｗａｒｅ　１９８９８ン乞抗−ＨＣＧコーティ
ングポールに添加し、試験管中に入れた。混合物を室温
で６０分間損励動装置上混合し、８０　ｍＭ塩化ナトリ
ウム＋０．１％ＴＷｅｅｎ　２０　（ＰＨ＜Ｓ、Ｄ　）
　２−でポ′−ルを３回洗浄した。実施例６のようにし
てｐニトロフェニルホスフェ−）＆實２００マイクロリ
ットルを添力ａし、４５分間３７℃でインキュベートし
た。終了試楽（５０ｍＭ　ＥＤＴＡ、…８９）１−を添
加することにより反応を終了させ、４０６ｎｍにおける
吸光反乞ＨＰ８４５０分元光度計により測定した。Ｏａ
ｔ　Ｕ／ｍｔの吸光度（バックグラウンド）Ｓ−よびＯ
ｍ／Ｕ／−と２００ｍ／Ｕ／−濃度の吸光度差を表１に
示す。パックグラウンド値が低く分離度が憂いことから
、良好な検定性能であると判断できる。

実施例　８ シクロスポリンの免疫酵素測定検定：吸着と結合をトシ
ルーＰＥＩコーティング試験管を介して行なった場合の
比較 Ａ、シクロスボリンコンジュゲートノ調製シクロスポリ
ンＣスクシンイミジルスクシネー　）　　　（Ｓａｎｄ
ｏｚ　　Ｌｔｄ、、　　Ｂａ５ｌｅ、　　　５ｗ１ｔｚ
ｅｒｌａｎｄ）　　’ｅ１　　：１０（Ｗ／Ｗ）の比で
ヒト血清アルブミン（Ｈ８Ａ）にコンジュゲートしＰＢ
８で透析した。

Ｂ、誘導体化されていないポリスチレン試験管へのコン
ジュゲートの吸着 上記段階人で調製したコンジュゲート全、−夜試験管中
で、室温で蛋白質溶液？インキヱベートすることにより
誘導体化されていないポリスチレン試験管の管壁へ吸着
させた。Ａ４Ａな溶液を実施例３Ｃに記載した洗浄緩衝
液で洗浄除去し、実施例３Ｃに記載の方法によりブロッ
クした。

Ｃ，）ンルーＰＥＩでコーティングされたポリスチレン
試験管へのコンジュゲートの結合上記段階Ａで調製した
コンジュゲートを実施例３Ｃの方法に従ってトシル−Ｐ
ＥＩでコーティングされた試験管（−結合した。トンル
ーＰＥＩでコーティングされた試験ｙｈ実施例３Ａおよ
び６Ｂにそれぞれ記載の方法によりＶ＠裏し、活性化し
た。

Ｄ、抗−シクロスポリ／−アルカリホスファターゼコン
ジュゲートの調製 モノクローナルシクロスポリン抗体（５ａｎｄｏｚ　。

Ｌｔｄ、、　Ｂａ５ｌｅ　５ｗ１ｔｚｅｒｌａｎｄ）　
６．４４　ｍｇを１５モル過ｆｉｌのスクシンイミジル
−４−（Ｎ−マレイミドメチル）−／り口ヘキサン−１
−カルボキ７レー　）　　　（Ｐｉｅｒｃｅ　　Ｃｈｅ
ｍｉｃａｌ　　Ｃｏｍｐａｎｙ、　　　Ｒｏｃｋｆｏｒ
ｄ。

１１１ｉｎｏｉｓ　６１１０５　）　ン用いて、呈温で
２時間、アルカリホスファター上９．８２１９＋＝結合
させ、シリカゲル上のゲルｐ過高性雇液体グロマトグラ
フイーにより精製した。

Ｅ、検足方法 蒸留水４００マイクロリツトル、全血試料またはシクロ
スポリン含有カリブレーター１ｏ。

マイクロリットル、および段階Ｂ記載の抗−シクロスボ
リンーアルカリホスファターセコンジュケ゛−）５００
マイクロリツトルを、段階ＢおよびＣで調製したコーテ
ィング６ｎだ試験管に入れた。ソクロスボリンカリブレ
ーメーはシクロスポリン乞−度Ｏ１０，５２よび１．０
マイクログラム／ゴで官有していた。混合物を６７℃で
１゜分間混合した。試験管を蒸留水５−で４回洗浄した
。

Ｆ、試験管に結合した＃累の定量 試験管に結合した酵素を以下の２つの異なる方法で測定
した。

（１）試験管内側足：第１の測定法は直接の免疫酵素測
定的定址に関与する。ＰＮＰＰ基質４−を試験管に入れ
、４分間２５℃で混合した。混合物’ａ−３Ｎの水酸化
ナトリウム４−中に注ぎ込むことにより反応を停止させ
た。吸光度はＨＰ　８４５０分元元反計を用いて４０６
　ｎｍの波長で測定した。

Ｑ）　遊離法：第２の測定方法は、段階Ａのシクロスポ
リンコンジュゲートｔそれが結合する試験管の表面から
分離することの可能な試薬である遊離試薬を冷加するこ
とを包含する。遊離試薬の添刀日の目的はシクロスポリ
ンコンジュゲートがどの程度強（試験管表面に結合して
いたかを測定するためである。遊離試薬（ＩＭレジエタ
ノールアミン中、０５％Ｔｗｅｅｎ　２０、ｐＨ９，０
）　１．１　ｄを試験Ｗに入れ、１０分間３７℃で混合
した。

次に、試薬１−乞試験管から取出して、　ＰＮＰＰ基質
３ｄｌ二添加した。この混合物乞４分間２５℃でインキ
ュベートした。３Ｎの水酸化ナトリウム４ｄで反応を停
止させた。）（Ｐ８４５Ｄ分光元度計乞用いて波長４０
６　ｎｍで吸光度を測定した。

（３）結果 表２ａは段階Ｆで論じた２つの定置法で測定された試験
管へ結合した酵素に対する吸光度値を示している。

表２ｂは／クロスボリンの各★度に対する比率（後記の
計算方法）の比収乞示しており、これによれば、トンル
ーＰＥ工予め活性化表面は蛋白質を強く結合し、遊離試
薬による攻撃も受けなかつたのに対し、予め活性化を行
なわなかった試験管表面へ単に吸着しただけの蛋白質は
遊離試薬により容易に除去されることが解る。

表２ｂに示した比は以下のよう（こして計算した。

吸″／ｌ、度比は遊離および試験管内の方法により測定
したコーティングされた試験管の吸光度に対して求めた
。即ち、シクロスポリン０マイクログラム／一端度に対
しては、遊離法により得た０、６８吸光度値を試験管内
法により得た０、６８吸光度値で割る。その比は１．０
である。

シクロスポリン０．１マイクログラム／ｍ漠度に対して
は、遊離法により得た０、４６吸光度値を試験管内法に
より得た０、６６吸光度値で割る。

その比は１１９である。

シクロスポリン０．５マイクログラム／−濃度に対して
は、遊ｌｌＩ法により得た０、３０吸光度値ＹＫＩｉＸ
管内法により得た０、　２９　ａ元度値で割る。

その比は１．０６である。

同様にしてトシル−ＰＥＩでコーティングされた試験管
を用いて行なった検定について比を求めた。０．０．１
および０．５マイクログラム／ゴ濃度における比はそれ
ぞれ、０，１２．０．１３および０．１４であった。

表２ｂで比較しているのはこれらの比である。

より高い比は、予め活性化しなかった試験管表面からは
如何にたやすくシクロスポリンコンジュゲートが遊離す
るかを反映している。

表　　　１ 蛋白質固定化方法の比較 無処理（吸Ｎ） トシル−ＰＥ１ １、ＯＱ、２０７　０．１４７　　５２７／４０５．２
　　　０．９９５　０．２５５　１０５７１５５アルキ
ルアミン９ ０．６４０ ０．０５４ ５２７／６２ Ｓａｒｌｇｅｒ ヒドラジン ６．５ ０．２０５　０．０５１　　１００／２０００．０１４
　０．００７　　１９７１５９−ト （カルポジイミド） 串（グルタルアルデヒド） 申申ベンツ゛イル−ＰＡＡＨおよびポリ（ｐｈｅ−１７
ｓ）は試験実施時には入手不可能であった。

表２ａ シクロスポリンの免疫酵素測定的検定 試験管コーティング方法の比較 シクロスポリン量 （４０６ｎｍにおける吸光度） 吸 吸 着 看 試験管内”　　０．６８ 遊離”　０．６８ ０．３６ ０．４６ ０．２９ ０．３０ 中刃法１ 中一方法　２ 表２ｂ 蛋白質固定化方法の比較 トシル−ＰＥＩ　ｆ二よる予め活性化ｖｓ予め活性化以
下に示す数値は予め活性化を行なわない表面からは如何
にたや丁く蛋白質が遊離するかを示している。比が大き
いほどたやすく蛋白質は除去されろ。比は実施例８Ｆ＜
３）に記載した方法に従って計算した。

０．０　μ９／ｒｄ　　　　　　　　Ｏ，１２ｖｓ、　
　　　　　１．０００．１　ｔｔ？／ｍｌ　　　　　　
　　Ｏ，１３ｖｓ、　　　　　　１．１９０．５　μｆ
ｔ／ｍｌ　　　　　　　　Ｏ，１４ｖｓ、　　　　　　
１．０＋以上、本発明の詳細な説明したが、本発明はさ
らに次の実施態様によってこれを要約して示「ことがで
きる。

１）疎水性基で誘導体化されたポリ（エチレンイミン）
の溶液または懸濁液で表面をコーティングすることを包
含する、バイオアフィニティ結合対の一方の固定化のた
めのプラスチック表面を予め活性化する方法。

２）疎水性基がトシル基である前項１記載のプラスチッ
ク表面を予め活性化する方法。

３）バイオアフィニティ結合対の構成員が、抗原−抗体
、基質−酵素、エフェクター−酵素、阻害剤−酵素、相
補的核酸鎖、結合蛋白質−ビタミン、結合蛋白質−核酸
、反応性染料−蛋白質および反応性染料−核酸、ビオチ
ン−アビジンおよび蛋白質Ａ、　−ＩｇＧよりなるσト
から選択される前項１記載のプラスチック表面を予め活
性化する方法。

４）プラスチック表面がポリスチレンである前項１記載
のプラスチック表面を予め活性化する方法。

５）疎水性基で誘導体化されたポリ（エチレンイミン）
のコーティングで予め活性化されたプラスチック表面。

３）疎水性基がトシル基である前項５記載の予め活性化
されたプラスチック表面。

７）プラスチックがポリスチレンである前項５記載の予
め活性化されたプラスチック表面。

８）下記工程 ａ）前項５記載の表面上に固定化された検知するべき物
質に特異的なバイオアフィニティ結合対物質の一方と試
料とを接触させること、および ｂ）その物質を検知または定被すること、を包含する、
ある物質を含有することが予測されるかまたは仰られて
いる試料中のその物質を検知または尾道するための検定
。

９）捕獲試薬および予め活性化されたプラスチック表面
乞グルタルアルデヒドと反応させることにより、プラス
チック表面に固定化されている物質をトシル−ポリ（エ
チレンイミン）のコーティングを有する予め活性化され
たプラスチック表面に共有結合的に結合させる、前項８
記載の検定。

１０）バイオアフィニティ結含対の構成員が、抗原−抗
体、基質−酵素、エフェクター−酵素、阻害剤−酵素、
相補的核酸鎖、結合蛋白質−ビタミン、結合蛋白質−核
酸、反応性染衿−蛋白質および反応性染料−核酸、ビオ
チン−アビジンおよび蛋白ｆｉ’Ａ−Ｉｇｏよりなる群
から選択される前項８記載の検定。

１１）検定がサンドインチ免疫検定である前項８記載の
検定。

１２）検定が逆すンドイッチ瑛定である前項８記載の検
定。

１３）疎水性基を有するポリ（エチレンイミン）誘導体
でコーティングされた基材物質上に固定化されたバイオ
アフィニティ結合対の一方を有するパイオアフィニティ
選択吸着材。

１４）疎水性基がト／ル基である前項１３記載の吸着剤
。

１５）バイオアフィニティ結合対の構成員が、抗原−抗
体、基質−酵素、エフェクター−酵素、阻害剤−＃索、
相補的核酸鎖、結合蛋白質−ビタミン、結合蛋白質−核
酸、反Ｌ６性染料−蛋白質および反応性染料−核酸、ビ
オチン−アビジンおよび蛋白質Ａ　−Ｉｇ（）よりなる
群から選択される前項１６記載の吸着剤。

１３）基材物質がポリスチレンである前項１３記載の吸
着剤。

１７）下記工程： ａ）バイオアフィニティ結合対の固定化された方がある
物質に特異性を有しているような前項１３記載のパイオ
アフィーティ選択吸着剤上にその物質を捕獲すること：
および、 ｂ）バイオアフィニティ結合対の構成員から捕獲された
物質を分離すること、 を包含する、バイオアフィニティ分離を行なう方法。

外２名

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）疎水性基で誘導体化されたポリ（エチレンイミン）
   の溶液または懸濁液で表面をコーティングすることを包
   含する、バイオアフィニティ結合対の一方の固定化のた
   めのプラスチック表面を予め活性化する方法。 ２）疎水性基で誘導体化されたポリ（エチレンイミン）
   のコーティングで予め活性化されたプラスチック表面。 ３）下記工程： ａ）請求項２記載の表面上に固定された検知するべき物
   質に特異的なバイオアフィニティ結合対物質の一方と試
   料とを接触させること、および ｂ）その物質を検知または定量すること、 を包含する、ある物質を含有することが予測されるかま
   たは知られている試料中のその物質を検知または定量す
   るための検定。 ４）疎水性基を有するポリ（エチレンイミン）誘導体で
   コーティングされた基材物質上に固定化されたバイオア
   フィニティ結合対の一方を有するバイオアフィニティ選
   択吸着材。５）下記工程： ａ）バイオアフィニティ結合対の固定化された方がある
   物質に特異性を有しているような請求項４記載のバイオ
   アフィニティ選択吸着剤上にその物質を捕獲すること：
   および、 ｂ）バイオアフィニティ結合対の構成員から捕獲された
   物質を分離すること、 を包含する、バイオアフィニテイ分離を行なう方法。