CN102038936B - Sirt1在制备上调珠蛋白基因表达及在制备治疗贫血药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及SIRT1在制备上调珠蛋白基因表达及在制备治疗贫血药物中的用途。特别地，所述药物是提纯的蛋白质类型的药物，其剂型可以是适于蛋白质药物应用的任何剂型。特别地，所述药物是能表达SIRTI蛋白的重组核酸构建体，其表达载体可以是任何适用于基因治疗用的表达载体。特别地，所述珠蛋白基因为γ珠蛋白或ε-珠蛋白，所述贫血为地中海贫血或镰状细胞贫血。特别地，所述地中海贫血为β-地贫。本发明为由于珠蛋白基因缺陷导致的贫血提供了一条有益的治疗途径。

Description

SIRT1在制备上调珠蛋白基因表达及在制备治疗贫血药物中的用途

技术领域

本发明涉及SIRT1在制备上调珠蛋白基因表达药物中的用途及在制备治疗贫血药物中的用途。特别地，本发明涉及SIRT1在制备治疗由于珠蛋白基因缺陷导致的贫血的药物中的用途。

背景技术

人的血红蛋白是一个四聚体，由两个α链和两个β链构成，负责体内的氧气运输。编码血红蛋白的基因为人类珠蛋白基因家族，分为α和β两个基因簇。人α-珠蛋白基因簇位于16号染色体近端粒区(16p13.3)，全长约40kb，包括胚胎型功能基因ζ，胎儿型和成年型功能基因α。人β-珠蛋白基因簇位于11号染色体p15.5区，全长约75kb，包括胚胎型功能基因ε，胎儿型功能基因γ，成年型功能基因δ和β。α珠蛋白基因簇在发育过程中经历一个基因表达转换：ζ→α，而β珠蛋白基因簇在发育过程中则要经历两个基因表达转换：ε→γ，γ→β。人的一生中，血红蛋白的发育途径可以分为三个阶段：胚胎、胎儿和成体。胚胎型血红蛋白四聚体主要为ζ₂ε₂；胎儿型血红蛋白四聚体主要为α₂γ₂；成人型血红蛋白四聚体主要为α₂β₂，约占表达量的97％，此外还有极少量的α₂δ₂，约占表达量的2％。

人珠蛋白基因表达具有红系组织特异性和发育阶段特异性。在发育过程的任何一个阶段，由于基因缺陷引起的一种或一种以上的珠蛋白珠蛋白基因表达降低或丧失，均会导致地中海贫血(Thalassemia)，简称地贫。地贫呈常染色体隐性遗传，是一种发病率高、危害严重的单基因遗传病，以慢性溶血性贫血为特征。该病广泛流行于地中海沿岸、中东至东南亚地区，在我国东南沿海和西南地区发病率较高，其中广西、广东、海南、云贵等地是高发区。重症型为致死性疾病，在高发区常对人口质量构成严重威胁。其中，α珠蛋白合成障碍性贫血为α地贫，β珠蛋白合成障碍性贫血为β-地贫。资料研究表明，β珠蛋白基因突变类型现已超过300种，这些突变涉及珠蛋白基因的外显子、内含子、5′非翻译区、3′非翻译区、多聚A信号、启动子、增强子及座位控制区，突变所造成的后果可以影响珠蛋白基因的转录、转录后加工、翻译，甚至翻译后产物的稳定性。

镰状细胞贫血是一种常染色体显性遗传血红蛋白病，由于一个错义突变，使得血红蛋白β链第6位氨基酸谷氨酸被缬氨酸所代替，形成了异常的血红蛋白S(HbS)，取代了正常血红蛋白，临床表现为慢性溶血性贫血、易感染和再发性疼痛危象以及慢性局部缺血导致的器官组织损害(Serjeant GR.Sickle cell disease，Lancet，1997，350：725-730)。镰状细胞贫血是发现最早，患病人数最多的一种血红蛋白分子病，其发病机制是在氧分压下降时，异常的HbS分子间相互作用，形成溶解度很低的多聚体，使红细胞扭曲成镰状细胞(镰变)。镰变的红细胞坚硬、变形性差，可受血管的机制破坏和单核巨噬系统吞噬而发生溶血；镰变的红细胞还可使血液粘滞性增加，血流缓慢，加之变形性差，易堵塞毛细血管引起局部缺氧和炎症反应，导致相应部位疼痛(刘焕琥、潘旭东，镰状细胞贫血及其血液动力学改变，中国卒中杂志，2008(3)：128-130)。

β-地贫和和镰状细胞贫血症是人类最常见的单基因遗传性疾病，均是由于编码β珠蛋白的基因突变造成的。目前，在临床上对于这类疾病尚无确切有效的治疗方法，主要以输血和同时使用除铁剂为主。但定期输血费用较高，一般家庭难以长期承受，同时长期输血易产生一些相应的并发症。骨髓与干细胞移植受到骨髓来源和配型的严格限制，且费用昂贵，很难普及。基因治疗是一个发展方向，但基因载体导入率低、导入基因沉默，以及基因载体生物安全性等一系列问题仍需进一步研究探索，用于临床尚待时日。

正常情况下，由胎儿型到成人型珠蛋白合成的发育开关于出生后12周内即已完成，随着γ珠蛋白基因表达的逐渐关闭，重型β-地贫和镰状细胞贫血的患者开始出现临床症状。而在刚出生的时候，β-地贫和镰状细胞贫血症的病人由于红细胞中含有胎儿型血红蛋白(human fetalhemoglobin，HbF)，因此未表现出相应的临床症状(StamatoyannopoulosG，et al.The molecular basis of blood diseases.3rd ed.Philadelphia：W.B.Saunders Publishing Co.；2001.p.135-82)。正常的成年人红细胞中只含有1％到3％的HbF，一些研究发现β珠蛋白基因簇调控区的突变导致成年人红细胞中γ珠蛋白基因表达上调，提高红细胞中HbF的含量，表现出缓和的临床症状；并且这些突变一旦被后代继承也会延续这种缓和的临床症状。β-地贫患者中，胎儿γ珠蛋白的表达补偿了成人β珠蛋白链的缺陷；镰状细胞贫血患者中，HbF的出现会降低HbS的有效浓度，胎儿γ珠蛋白链还通过形成异源链干扰HbS形成多聚体。临床研究显示诱导HbF表达量提高10％-20％(即基础表达量的3-5倍)即可有效缓解β-地贫和镰状细胞贫血患者的并发症(Noguchi CT，et al.Levels of fetalhaemoglobin necessary for the treatment of sickle cell disease.N Engl JMed 1988(318)：96-9；Olivieri NF.The beta-thalassemias.N Engl J Med1999(341)：99-109)。这些研究指明了治疗β-地贫和镰状细胞贫血的新方向，即在成人阶段重新激活红细胞中胎儿型γ珠蛋白基因的表达。

近年来，一些具有细胞毒性的药物在治疗β-地贫和镰状细胞贫血上取得了一定的效果。这些药物主要包括5-氮胞苷、羟基脲和丁酸盐类化合物，它们通过细胞毒性作用于细胞周期，引发红系的二次重建，诱导已关闭的胎儿型γ珠蛋白基因重新合成，从而缓解成人β珠蛋白的合成缺陷(Atweh GF，et al.Pharmacologic induction of fetal hemoglobin：raising the therapeutic bar in sickle cell disease.Curr Opin Hematol，2001(8)：123-30)。早期研究发现，5-氮胞苷可激活骨髓组织中γ-mRNA的转录，显著提高血红蛋白水平，长期接受5-氮胞苷治疗的患者甚至可以不用输血(Lowrey CH，et al.Briefreport：treatment with azacytidine ofpatinents with end2stag bate2thalassemia.N Engl J Med，1993，329(12)：845-848)。5-氮胞苷具有较强的毒性，主要是骨髓抑制和粒细胞减少，常并发感染；作为化疗药物，5-氮胞苷自身具有很高的诱变性，具有潜在的致癌作用，已基本停止使用。

羟基脲抑制二磷酸核糖核苷还原酶，具有S期特异性细胞毒性，临床上已广泛用于治疗慢性髓系白血病及其他骨髓增殖性疾病，是第一个通过美国食品药品监督管理局批准用于镰状细胞贫血治疗的药物。对于β-地贫的治疗，羟基脲在实验中显示了诱导HbF合成的能力，并改善了患者的临床症状，但是不同的患者敏感度不同，诱导HbF合成的能力差异较大，而且诱导HbF合成的最大效能是在产生了骨髓抑制毒性情况下实现的，因此长期使用该药物对人体的毒性仍令人担忧(Watanapokasin R，et al.Hydroxyurea responses and fetal hemoglobininduction in beta2thalassemia/HbE patients′peripheral blood erythroid cellculture，Ann Hematol，2006(85)：164-169)。

目前，对于丁酸盐类药物的研究较为广泛，丁酸盐是一种四碳的短链脂肪酸，主要有丁酸盐、苯丁酸盐等几类，具有相对较高的安全性，近来被应用于β-地贫的治疗，其根本机制也是促进HbF的生成，代偿成人β珠蛋白链生成不足导致的一系列红细胞损伤。有研究显示丁酸盐类药物，如丁酸钠可以在β-地贫和镰状细胞贫血患者(包括新生儿)中诱导HbF表达，红细胞离体培养及体内诱导实验均证明丁酸钠可选择性刺激胎儿型珠蛋白基因，促进生成HbF(Sher GD，et al.Extendedtherapy with intravenous arginine butyrate in patients withβ-hemoglobinopathies.N Engl J Med 1995(332)：1606-10；Atweh GF，et al.Sustained induction of fetal hemoglobin by pulse butyrate therapy in sicklecell disease.Blood 1999(93)：1790-7.)。作为一种广为人知的组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histone deacetylases inhibitor，HDACi)，丁酸钠的这种效应使人们把目光转向β珠蛋白基因簇的染色质构象，β-地贫和镰状细胞贫血患者对丁酸钠具有不同的反应很可能是由于β珠蛋白基因簇的染色质构象不同造成的。

组蛋白去乙酰化酶(HDACs)和组蛋白乙酰转移酶(histoneacetyltransferases，HATs)是两大类酶的超家族，它们在细胞中负责相反的酶促反应，相互平衡、相互制约，共同维持组蛋白乙酰化修饰状态，保持特定的染色质结构，调控基因的表达。HATs诱导组蛋白乙酰化，使染色质松散，暴露基因调节区域，有利于转录复合物的结合，促进基因表达；组蛋白去乙酰化酶(HDACs)则催化染色质的去乙酰化，使染色质紧密包装，甚至形成“异染色质”区域，导致基因沉默。珠蛋白发育阶段的转化需要不同的乙酰化修饰状态，在成人红细胞中HDACs对于沉默γ珠蛋白基因表达起一定作用(Forsberg EC，DownsKM，Christensen HM，Im H，Nuzzi PA，Bresnick EH.Developmentallydynamic histone acetylation pattern of a tissue specific chromatin domain.Proc Natl Acad Sci USA 2000(97)：14494-9.)。因此，HDAC抑制剂(HDACi)，对于转录沉默向激活的染色质状态转换起重要作用，有可能重新开启成人阶段已经沉默的γ珠蛋白基因的表达，诱导生成HbF。其他的丁酸盐类似物，例如苯基丁酸以及其他的短链脂肪酸和丁酸盐结构类似物也可以在人类红细胞中诱导HbF表达。这些化合物已经用于小型的β-地贫治疗临床实验(Cao H.Pharmacological induction of fetalhemoglobin synthesis using histone deacetylase inhibitors.Hematology2004(9)：223-33.)。由于半衰期较短，以及静脉注射的困难，丁酸钠等短链脂肪酸需要较高的浓度以保持药物活性，对于不同反应的病人需要使用不同的剂量，迄今使用的丁酸盐类药物的临床使用也未能取得稳定一致的效果，同种药物的诱导作用不能在多数患者中得到很好的重复定论，因此不是治疗β-地贫和镰状细胞贫血的最佳药物。研究者们已开始探索新的具有潜在的诱导HbF表达的HDACi药物，例如TSA(Trichostatin A)及其类似物等。但是这些化合物诱导HbF效果较弱，具有较高的毒性，因此对于治疗β-地贫和镰状细胞贫血的效果更是不得而知。因此，一种安全、有效的治疗性药物成为目前的迫切需要。

当HDACs成为治疗β-地贫和镰状细胞贫血新的希望时，一直备受瞩目。事实上，HDACs不是一种酶，而是一大类酶的超家族的总称，迄今为止已鉴定出许多不同物种的HDACs。人的HDACs根据与酵母HDACs的同源关系及系统发生的分析主要分为三类：I类HDACs，包括HDAC1、2、3、8，与酵母的Rpd3同源；II类HDACs，包括HDAC4、5、6、7、9、10，与酵母的Hda1同源；III类HDACs，也称为sirtunis，与酵母中的Sir2同源，包括SIRT1-7。已被广泛研究的用于治疗β-地贫和镰状细胞贫血的HDACi药物，如丁酸钠和TSA，只能抑制I类和II类HDACs，对于III类HDACs却不起作用。I类和II类HDACs是Zn²⁺依赖的酶，通过与抑制子的相互作用被募集到基因的启动子区，去乙酰化组蛋白，抑制转录；而III类HDACs与其他两类在结构上有明显不同，是NAD⁺依赖的，可以去乙酰化组蛋白，还可与多种非组蛋白相互作用并去乙酰化，在调控基因表达上发挥更精细的作用(Denu，J.M.Linkingchromatin function with metabolic networks：Sir2 family ofNAD⁺-dependent deacetylases.Trends Biochem Sci 2003(28)：41-48)。Sir2是一个从细菌到人类都广泛存在的NAD依赖的去乙酰化酶，这可能也反映了其功能在生命活动中的重要性。研究发现，酵母和线虫中限制能量摄入所诱导的长寿依赖于Sir2的活性，因此，Sir2被认为和长寿相关，受到了越来越广泛的关注。人SIRT1的生理功能迄今尚不清楚，但是根据与其相互作用的蛋白和整体动物基因敲除的结果可以推测可能与器官发育、代谢调节和抵抗应激等方面起重要作用(Leibiger IB，2006)。由于I类和II类HDACs的抑制剂对于β-地贫和镰状细胞贫血的治疗起到一定作用，SIRT1又与长寿以及多种生命过程密切相关，因此，如果能证实SIRT1在I类和II类HDACs中的作用，将会为治疗β-地贫和镰状细胞贫血找到新的切入点。

人髓系来源的白血病细胞系K562，已被广泛应用于研究红系分化、珠蛋白基因表达调控和血红蛋白病的治疗。本发明以此为模型，探索SIRT1在治疗β-地贫和镰状细胞贫血方面的作用。

发明内容

本发明需要解决的技术问题是探究SIRT1在调控珠蛋白表达中的作用并进一步探究SIRT1在由于珠蛋白基因缺陷导致的贫血的治疗中的用途。

因此，本发明的第一方面涉及SIRT1在制备上调哺乳动物包括人珠蛋白基因表达药物中的用途。特别地，所述药物是提纯的蛋白质类型的药物，所述药物的剂型为适于蛋白质药物应用的任何剂型，更特别地，所述剂型为注射剂。特别地，所述药物是表达SIRT1蛋白质的重组核酸构建体，且其中所述重组核酸构建体的表达载体是任何适用于基因治疗的病毒表达载体或非病毒表达载体，更特别地，所述病毒载体选自重组逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、单纯疱疹病毒载体或牛痘苗病毒载体，所述非病毒载体选自噬菌体载体或复制子载体。特别地，所述珠蛋白为γ珠蛋白或ε-珠蛋白。

本发明的第二方面涉及SIRT1在制备治疗由于珠蛋白基因缺陷导致的贫血的药物中的用途。特别地，所述药物是提纯的蛋白质类型的药物，所述药物的剂型为适于蛋白质药物应用的任何剂型，更特别地，所述剂型为注射剂。特别地，所述药物是表达SIRT1蛋白质的重组核酸构建体，且其中所述重组核酸构建体的表达载体是任何适用于基因治疗的病毒表达载体或非病毒表达载体，更特别地，所述病毒载体选自重组逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、单纯疱疹病毒载体或牛痘苗病毒载体，所述非病毒载体选自噬菌体载体或复制子载体。特别地，所述珠蛋白为γ珠蛋白或ε-珠蛋白。特别地，所述贫血为β-地贫或镰状细胞贫血。

换言之，本发明通过定量RT-PCR检测了SIRT1的激活剂白藜芦醇对K562细胞中ε-珠蛋白基因和γ-珠蛋白基因表达的影响，发现白藜芦醇上调了ε-珠蛋白基因和γ-珠蛋白基因的表达。本发明又用RT-PCR检测了SIRT1的抑制剂烟酰胺对K562细胞中ε-珠蛋白基因和γ-珠蛋白基因表达的影响，发现烟酰胺下调了ε-珠蛋白基因和γ-珠蛋白基因的表达。本发明继而通过在K562细胞中过表达SIRT1基因检测了SIRT1过表达后对ε-珠蛋白和γ-珠蛋白基因表达的影响，发现SIRT1的过表达上调了ε-珠蛋白基因和γ-珠蛋白基因的表达。本发明最后用RNA干扰的方法干扰了K562细胞中SIRT1的表达，利用定量RT-PCR检测了K562细胞中干扰SIRT1表达后对ε-珠蛋白和γ-珠蛋白基因表达的影响，发现SIRT1表达被干扰后，ε-珠蛋白和γ-珠蛋白基因表达被下调。上述实验结果表明SIRT1可上调ε-珠蛋白和γ-珠蛋白基因表达。由于在成人阶段重新激活红细胞中胎儿型γ珠蛋白基因的表达是现有发现的治疗由于珠蛋白基因缺陷导致的贫血的新方向，因此，本发明将为由于珠蛋白基因缺陷导致的贫血的治疗提供一条新的途径。

附图说明

图1：显示了定量RT-PCR检测SIRT1的激活剂白藜芦醇对K562细胞中ε-珠蛋白基因表达的影响。横坐标代表不同浓度的白藜芦醇：0μm、25μm和50μm，纵坐标代表ε-珠蛋白基因与内参基因GAPDH的相对表达水平。

图2：显示了定量RT-PCR检测SIRT1的激活剂白藜芦醇对K562细胞中γ-珠蛋白基因表达的影响。横坐标代表不同浓度的白藜芦醇：0μm、25μm和50μm，纵坐标代表γ-珠蛋白基因与内参基因GAPDH的相对表达水平。

图3：显示了定量RT-PCR检测SIRT1的抑制剂烟酰胺(10mmol/L)对K562细胞中ε-珠蛋白基因表达的影响。纵坐标代表ε-珠蛋白基因与内参基因GAPDH的相对表达水平。

图4：显示了定量RT-PCR检测抑制剂烟酰胺(10mmol/L)对K562细胞中γ-珠蛋白基因表达的影响。对照是未用烟酰胺处理的K562细胞，纵坐标代表γ-珠蛋白基因与内参基因GAPDH的相对表达水平。

图5：显示了定量RT-PCR检测K562细胞中SIRT1过表达的水平。对照为转染了pcDNA3.1空载体的K562细胞，纵坐标代表SIRT1基因与内参基因GAPDH的相对表达水平。

图6：显示了Western Blot检测K562细胞中SIRT1的过表达效率。GAPDH为内参基因，对照为转染了pcDNA3.1空载体的K562细胞。

图7：显示了定量RT-PCR检测K562细胞中SIRT1过表达后对ε-珠蛋白和γ-珠蛋白基因表达的影响。对照为转染了pcDNA3.1空载体的K562细胞，纵坐标代表珠蛋白基因与内参基因GAPDH的相对表达水平。

图8：显示了定量RT-PCR检测K562细胞中SIRT1干扰的效率。对照为干扰无关序列(GFP基因)的K562细胞，纵坐标代表SIRT1基因与内参基因GAPDH的相对表达水平。

图9：显示了Western Blot检测K562细胞中SIRT1的干扰效率。GAPDH为内参基因，对照为干扰无关序列(GFP基因)的K562细胞。

图10：显示了定量RT-PCR检测K562细胞中干扰SIRT1表达后对ε-珠蛋白和γ-珠蛋白基因表达的影响。对照为干扰无关序列(GFP基因)的K562细胞，纵坐标代表珠蛋白基因与内参基因GAPDH的相对表达水平。

具体实施方式

下面将通过下述非限制性实施例进一步说明本发明，本领域技术人员公知，在不背离本发明精神的情况下，可以对本发明做出许多修改，这样的修改也落入本发明的范围。

下述实验方法如无特别说明，均为常规方法，所使用的实验材料如无特别说明，均可容易地从商业公司获取。

实施例1 SIRT1的激活剂白藜芦醇可以促进ε-珠蛋白和γ-珠蛋白基因的表达

多酚类物质包括白藜芦醇(resveratrol，sigma公司，R5010)等可激活SIRT1的活性，白藜芦醇是目前发现的最强的SIRT1的激活剂(BorraMT，et al.Mechanism of human SIRT1 activation by resveratrol.Biol Chem，2005，280(17)：17187-17195)。白藜芦醇为粉末状固体，分子量为228.2g/mol，用DMSO作为溶剂配制成50mM的白藜芦醇保存液，并在超净台中用0.22μm滤膜过滤后分装，置于-20℃冰箱保存，用时稀释。

K562细胞复苏后传至3-7代，将含有1x10⁶K562细胞的培养基(10％FBS，RPMI 1640)2ml接种于3.5cm培养皿或六孔板中，分别加入1/1000的白藜芦醇(终浓度50μmol/L)，1/2000的白藜芦醇(终浓度25μmol/L)，作用于K562细胞48小时后，收细胞，加入1ml Trizol试剂(Invitrogen公司)，提取总RNA，紫外分光光度计测定RNA的浓度和纯度，1％琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。取2μg总RNA，按照M-MuLV反转录酶(购自NEB公司，M0253)的使用说明合成cDNA。反应结束后，加入30μl灭菌水使总体系扩增到50μl。以1μl稀释后的cDNA为模板，基因特异引物各为250pM，荧光染料为SYBR GREEN(Takara公司)，在IQ-5(Bio-Rad公司)实时定量PCR仪上进行扩增。引物序列如下：

表1 使用的引物序列

序列号SEQ IDNO：

引物名称

引物序列

引物长度(bp)

1	GAPDH-s	GGTCACCAGGGCTGCTTTTA	20
				2	GAPDH-a	GAGGGATCTCGCTCCTGGA	19
3	ε-globin-s	CAAGCCCGCCTTTGCTAA	18
				4	ε-globin-a	TTGCCAAAGTGAGTAGCCAGAA	22
5	γ-globin-s	GGCAACCTGTCCTCTGCCTC	20
				6	γ-globin-a	GAAATGGATTGCCAAAACGG	20
7	SIRT1-s	AGGATAGAGCCTCACATGCAA	21
				8	SIRT1-a	TCGAGGATCTGTGCCAATCATA	22

定量RT-PCR结果显示，用SIRT1的激活剂白藜芦醇处理K562细胞48小时后，ε-珠蛋白和γ-珠蛋白基因的表达均有上调(图1、图2)。用不同的浓度(0μm、25μm和50μm)的白藜芦醇处理K562细胞后，ε-珠蛋白和γ-珠蛋白基因的表达上调呈现剂量依赖性(图1、图2)。白藜芦醇激活K562细胞中SIRT1的酶活性后，可诱导ε-珠蛋白和γ-珠蛋白基因的表达上调，这些结果表明了SIRT1与ε-珠蛋白和γ-珠蛋白基因表达的正相关性。

实施例2SIRT1的抑制剂烟酰胺可以抑制ε-珠蛋白和γ-珠蛋白基因的表达

烟酰胺(Nicotinamide，NAM，sigma公司)是尼克酸的前体物，是VB₃的一种形式，在体内与核糖、磷酸、腺嘌呤形成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(辅酶I)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(辅酶II)，参与大量的生物反应。烟酰胺是SIRT1催化的脱乙酰基反应的一个产物，体内和体外研究证明，烟酰胺是人SIRT1活性的非竞争性的有效抑制剂，细胞内烟酰胺水平的波动可能直接调控体内SIRT1蛋白的活性(Bitterman KJ，et al.2002.Inhibition of silencing and accelerated aging by nicotinamide，aputative negative regulator of yeast Sir2 and human SIRT1.Bio.Chem.277(47)：45099-45107)。

烟酰胺为固体粉末，分子量为122g/mol，用PBS作为溶剂配制成1mol/L的烟酰胺保存液，并在超净台中用0.22μm滤膜过滤后分装，置于-20℃冰箱保存，用时稀释。K562细胞复苏后传至3-7代，将含有1x10⁶K562细胞的培养基(10％FBS，RPMI 1640)2ml接种于3.5cm培养皿或六孔板中，加入1/100的烟酰胺(终浓度10mmol/L)，作用于K562细胞48小时候后，收细胞，加入1ml Trizol试剂(Invitrogen公司)，提取总RNA，紫外分光光度计测定RNA的浓度和纯度，1％琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。按照前面所描述的方法合成cDNA，并进行定量PCR扩增。

定量RT-PCR结果显示，用SIRT1的抑制剂烟酰胺(10mmol/L)处理K562细胞48小时后，ε-珠蛋白和γ-珠蛋白基因的表达均下调(图3、图4)。这些结果表明，在K562细胞中用烟酰胺抑制SIRT1的酶活性后，可抑制ε-珠蛋白和γ-珠蛋白基因的表达，从反向证实了SIRT1与ε-珠蛋白和γ-珠蛋白基因表达的正相关性。

实施例3 SIRT1基因过表达可增强ε-珠蛋白和γ-珠蛋白基因的表达

在前面的实验中，分别用SIRT1的激活剂白藜芦醇和抑制剂烟酰胺从正反两个方面证实了，SIRT1与ε-珠蛋白和γ-珠蛋白基因表达的正相关性。白藜芦醇和烟酰胺是公认的SIRT1的激活剂和抑制剂，实验效果也非常显著，但是作为药物仍存在一些不确定因素。因此，进一步在K562细胞中利用SIRT1特异的表达质粒和干扰质粒，分别实现SIRT1基因的高表达和低表达，从而明确SIRT1与ε-珠蛋白和γ-珠蛋白基因表达的正相关性。

1、SIRT1过表达载体的构建和转染K562细胞

载体pcDNA3.1(invitrogen公司，V79020)用BamH1和Not1联合酶切，切胶回收载体片段；人野生型SIRT1 cDNA(NCBI，NM012238)也用BamH1和Not1联合酶切，切胶回收载体片段。按照SIRT1与载体的摩尔比约为3∶1，加入T4DNA连接酶16℃水域连接过夜后，转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，氨苄青霉素筛选重组克隆。待克隆长出后，挑取单菌落，振荡培养，小提质粒，鉴定阳性克隆，并进一步采用荧光序列自动分析确定。

将构建好的pcDNA3.1-SIRT1质粒大提，纯化后测定质粒浓度，用lipofectmin2000(Invitrogen公司)转染处于指数增长期的K562细胞，同时转染空载体pcDNA3.1作为对照。转染时取4μg pcDNA3.1-SIRT1质粒DNA，稀释到250μl opti-MEM培养基中，混匀后室温静置5分钟；同时取10μl转染试剂lipofectmin2000，稀释到250μl opti-MEM培养基中，混匀后室温静置5分钟。然后将上述两种稀释液充分混合后室温放置20分钟，加入培养在6孔板的K562细胞中。转然后细胞在二氧化碳培养箱中，37℃培养2天后加入G418筛选，未转入外源质粒的K562细胞被杀死，转入外源质粒的K562细胞可存活下来，约两周后得到重组的K562混合克隆。pcDNA3.1载体对照也按照同样方法筛选得到混合克隆。

2、定量RT-PCR检测SIRT1的过表达效率

待得到重组的K562混合克隆后，吸取1ml细胞，离心后弃上清，细胞沉淀中加入1ml Trizol试剂(Invitrogen公司)，按照操作说明提取总RNA，测定浓度后反转录为cDNA。然后，以cDNA为模板，以GAPDH为内参，检测SIRT1表达量的变化。定量PCR结果显示，在转染了SIRT1的K562混合克隆中，SIRT1的表达量明显上调，与对照(转染了pcDNA3.1空载体的K562细胞)相比，SIRT1的表达量约为对照的4倍(图5)。这说明，转入的外源SIRT1基因可以在K562细胞中有效表达，过表达效果明显。

3、Western Blot检测SIRT1的过表达效率

收集上述SIRT1过表达的K562细胞混合克隆，同时收集转染了pcDNA3.1空载体的K562细胞作为对照，分别离心后弃上清，用PBS溶液洗2次后，在细胞沉淀中加入约为沉淀体积5倍量的RIPA裂解液，冰上放置30分钟，4℃，10,000转离心30分钟，取上清，即为细胞总蛋白，分装后-70℃冻存备用。用BCA(Bicinchoninic Acid)试剂盒(Abnova公司)测定蛋白样品浓度。配制12％的分离胶，5％的浓缩胶，20μg蛋白样品加入上样缓冲液，混匀后在沸水中保温5分钟，取出上样，进行SDS-PAGE电泳。然后300mA电流转膜，牛奶封闭，杂一抗(Santa Cruz公司)和二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司)、显色、洗片显影。通过Western Blot检测SIRT1蛋白水平上表达量的变化情况，结果显示在蛋白水平上，SIRT1的表达量仍有明显上调(图6)，与定量RT-PCR结果相符，从而进一步证实了在所筛选到的K562混合克隆细胞中成功实现了SIRT1的过表达。

4、K562细胞中SIRT1过表达促进ε-珠蛋白和γ-珠蛋白基因的表达

K562细胞是人髓系来源的白血病细胞，主要表达人胚胎型和胎儿型珠蛋白基因，对于β珠蛋白基因簇的基因来说，在K562细胞中可以检测到的主要是ε-珠蛋白和γ-珠蛋白基因。分别收集SIRT1过表达的K562细胞混合克隆和转染了pcDNA3.1空载体的K562细胞，提取RNA，定量RT-PCR检测结果显示，SIRT1过表达的K562细胞混合克隆中，ε-珠蛋白和γ-珠蛋白mRNA水平与对照相比有明显增加，其中，ε-珠蛋白基因表达量约为对照的3倍，γ-珠蛋白基因表达量约为对照的2.5倍(图7)。这些结果表明，在K562细胞中特异性增强SIRT1基因表达后，β珠蛋白基因簇的胚胎型和胎儿型珠蛋白(ε-珠蛋白和γ-珠蛋白基因)表达上调，进一步显示出SIRT1与ε-珠蛋白和γ-珠蛋白基因表达的正相关性。

实施例4干扰SIRT1基因表达可抑制ε-珠蛋白和γ-珠蛋白基因的表达

1、SIRT1干扰载体的构建和转染K562细胞

为了进一步确定SIRT1对ε-珠蛋白和γ-珠蛋白基因表达的影响，我们用RNA干扰(RNAi)的方法抑制K562细胞中SIRT1的内源表达。SIRT1RNA干扰质粒按照已经建立的方法构建(Liu CM，et al.Retrovirus vector-mediated stable gene silencing in human cell.BiochemBiophys Res Commun 2004(313)：726-730)，SIRT1干扰的小RNA序列的模版为5’-GATGAAGTTGACCTCCTCA-3’(SEQ ID NO：9)，参考文献合成(Picard F，et al.Sirt1 promotes fat mobilization in whiteadipocytes by repressing PPAR-γ.Nature 2004(429)：771-776)，构建好的SIRT1 RNAi干扰序列被亚克隆到RNAi-Ready pSIREN-RetroQ载体(Clontech公司，632455)上。

将构建好的SIRT1干扰质粒转化大肠杆菌DH5α后，挑取单克隆，摇菌，大量提取纯化，测定质粒浓度。将复苏的293T细胞传至3-7代，待细胞处于指数增长期时接种6×10⁶293T细胞于100mm平皿中，融汇率达到80％时，用lipofectmin 2000将纯化好的SIRT1干扰质粒和逆转录病毒胞膜蛋白质粒(Clontech公司)共同转染293T细胞，转染后6小时，换上新鲜的培养液。继续培养24小时，收集病毒上清；然后分别于48小时和72小时再次收集病毒上清。将所收集的病毒上清混合，用0.22μm滤膜过滤，除去细胞及碎片，分装后于4℃保存，检测病毒滴度并转导K562细胞。

将3×10⁵的K562细胞接种于6孔板中，24小时后换新鲜培养液，并加入1ml病毒上清。细胞放入37℃的二氧化碳培养箱中继续培养，48小时后更换含有嘌呤霉素(puromycin，sigma公司)的培养基。在嘌呤霉素的筛选压力下，未转入SIRT1干扰质粒的K562细胞被杀死，约一周后得到干扰SIRT1表达的K562混合克隆细胞。再用同样的方法得到干扰GFP的K562混合克隆细胞，由于K562细胞中不含有GFP基因，因此干扰GFP的K562混合克隆细胞可以作为SIRT1干扰的对照。

2、定量RT-PCR检测SIRT1的干扰效率

待得到重组的K562混合克隆后，吸取1ml细胞，离心后弃上清，细胞沉淀中加入1ml Trizol试剂(Invitrogen公司)，按照操作说明提取总RNA，测定浓度后反转录为cDNA。然后，以cDNA为模板，以GAPDH为内参，检测SIRT1表达量的变化。定量PCR结果显示，在转染了SIRT1干扰质粒的K562混合克隆中，SIRT1的表达量明显降低，与对照(干扰GFP的K562细胞)相比，SIRT1的表达量下降了约70％(图8)。这说明，转入的外源SIRT1干扰质粒可以在K562细胞中有效表达，SIRT1干扰效果显著。

3、Western Blot检测SIRT1的干扰效率

收集上述干扰SIRT1表达的K562细胞混合克隆，同时收集干扰GFP的K562细胞作为对照，分别离心后弃上清，用PBS溶液洗2次后，在细胞沉淀中加入约为沉淀体积5倍量的RIPA裂解液，提取细胞总蛋白，并用BCA试剂盒测定蛋白样品浓度。通过Western Blot检测K562细胞中转入SIRT1干扰质粒后，SIRT1在蛋白水平上表达量的变化情况。结果显示，在蛋白水平上，SIRT1的表达被显著抑制(图9)，与定量RT-PCR结果相符，从而进一步证实了在所筛选到的K562混合克隆细胞中成功实现了对SIRT1的干扰。

4、K562细胞中干扰SIRT1基因表达可抑制ε-珠蛋白和γ-珠蛋白基因的表达

收集干扰SIRT1的K562细胞，同时收集干扰无关序列(GFP基因)的K562细胞作为对照，提取RNA，定量RT-PCR检测结果显示，SIRT1干扰的K562细胞混合克隆中，ε-珠蛋白和γ-珠蛋白mRNA水平与对照相比有明显降低，其中，ε-珠蛋白基因表达量约为对照的30％，γ-珠蛋白基因表达量约为对照的50％(图10)。这些结果表明，在K562细胞中特异性干扰SIRT1基因表达后，β珠蛋白基因簇的胚胎型和胎儿型珠蛋白(ε-珠蛋白和γ-珠蛋白基因)表达也随之下降，进一步显示出SIRT1与ε-珠蛋白和γ-珠蛋白基因表达的正相关性。

序列表

<110>中国医学科学院基础医学研究所

<120>SIRT1在制备上调珠蛋白基因表达及在制备治疗贫血药物中的用途

<130>890250CG

<160>9

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>GAPDH-s

<400>1

ggtcaccagg gctgctttta    20

<210>2

<211>19

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>GAPDH-a

<400>2

gagggatctc gctcctgga     19

<210>3

<211>18

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>ε-globin-s

<400>3

caagcccgcc tttgctaa      18

<210>4

<211>22

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>ε-globin-a

<400>4

ttgccaaagt gagtagccag aa 22

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>γ-globin-s

<400>5

ggcaacctgt cctctgcctc    20

<210>6

<211>20

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>γ-globin-a

<400>6

gaaatggatt gccaaaacgg    20

<210>7

<211>21

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>SIRT1-s

<400>7

aggatagagc ctcacatgca a  21

<210>8

<211>22

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>SIRT1-a

<400>8

tcgaggatct gtgccaatca ta 22

<210>9

<211>19

<212>DNA

<213>人工

<220>

<223>SIRT1干扰的小RNA序列的模版

<400>9

gatgaagttg acctcctca     19

Claims (9)

1.SIRT1在制备治疗由于珠蛋白基因缺陷导致的贫血的药物中的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其中所述药物是提纯的蛋白质类型的药物。

3.根据权利要求1所述的用途，其中所述药物的剂型为适于蛋白质药物应用的剂型。

4.根据权利要求1所述的用途，其中所述药物是表达SIRT1蛋白质的重组核酸构建体。

5.根据权利要求4所述的用途，其中所述重组核酸构建体的表达载体是适用于基因治疗的病毒表达载体或非病毒表达载体。

6.根据权利要求5所述的用途，其中所述病毒载体选自：重组逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、单纯疱疹病毒载体或牛痘苗病毒载体。

7.根据权利要求5所述的用途，其中所述非病毒载体选自：噬菌体载体或复制子载体。

8.根据权利要求1所述的用途，其中所述珠蛋白为γ珠蛋白或ε-珠蛋白。

9.根据权利要求1所述的用途，其特征在于所述贫血为β-地中海贫血或镰状细胞贫血。

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