CN112933215B - Sirt1在制备卵巢功能保护药物方面中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种SIRT1在制备卵巢功能保护药物方面中的应用，属于肿瘤生育保护技术领域。具体的是采用基因治疗手段对受试哺乳动物体的卵巢原位注射一定剂量的AdV‑SIRT1，并检测SIRT1的过表达水平。通过对损伤部位进行修复以实现对卵巢功能重建的目的。因此，AdV‑SIRT1重组载体及其药物制剂可以在不影响抗癌效果情况下保护卵巢功能，其作为新型药物在修复卵巢损伤和/或对抗延缓卵巢衰老和/或改善卵巢储备功能和/或重建卵巢功能等方面发挥重要作用。

Description

SIRT1在制备卵巢功能保护药物方面中的应用
技术领域
本发明涉及SIRT1在卵巢功能保护药物方面的应用，属于肿瘤生育保护技术领域，具体地涉及一种SIRT1在制备卵巢功能保护药物方面中的应用。
背景技术
卵巢功能和生育能力是影响女性生存质量的重要因素。现有影响女性卵巢功能的因素有：年龄、遗传、免疫、医源性、感染性、环境、行为学、社会心理等多种因素。其中化疗导致的医源性卵巢损伤在临床常见且急需得到改善。
化疗可导致卵巢功能受损，其引起的生殖内分泌紊乱可表现为闭经、不孕、围绝经期症状及心理障碍等，且化疗对卵泡损耗和卵巢功能的损伤是不可逆的，研究发现化疗或者全身放疗所致的女性卵巢早衰和不可逆转的不孕发生率高达80～100％，严重影响患者的身心健康。
因此，探寻化疗同时保护卵巢功能、减少卵巢损伤以及后期补救治疗的措施显得尤为重要。针对化疗引起的卵泡损伤、卵泡池耗竭加速、卵巢储备下降等问题，各地学者已开展多项研究。目前主要的生育功能保护措施如下。1、胚胎冷冻保存，其优点是技术较完善成熟、成功率较高；缺点是卵母细胞刺激和成熟需要4～6周，会导致化疗延迟，故可能不适合需要紧急化疗的患者，且需要男性伴侣或精子捐赠者，卵巢激素刺激不适合雌激素受体阳性的女性乳腺癌患者。2、成熟卵母细胞冷冻保存，其优点是不需要精子供体；缺点是目前成功率低于胚胎使用，同样会延迟化疗可能不适合浸润性癌，激素刺激可能不适合乳腺癌。3、卵巢组织冷冻保存和再植入，成功率尚不明确，优点是化疗时间无需延迟，可用于卵母细胞刺激延迟不恰当的患者；缺点是目前尚处试验阶段，可能导致继发恶性肿瘤。
SIRT1是Frye等于1999年在人体内首次发现，其定位于人染色体10q21.3，基因长约为33.72kb，结构具备很高的保守性。SIRT1的cDNA开放阅读框长约2，4kb，包含9个外显子和8个内含子，可以编码747个氨基酸约81.7kDa相对分子量的蛋白质。SIRT1的基本组成结构：主要由Rossmann折叠构成的一个保守性较高的大结构域：由一个锌带和一个螺旋结构组成的保守性较低的小结构域。底物结合在大小结构域之间形成的一个空隙中发生催化反应。SIRT1的特殊结构决定了它的生物学功能，包括参与基因转录、DNA复制、DNA损伤修复和代谢调控等一系列的细胞活动。
文献“SIRT1在卵巢衰老方面的研究进展”中记载了合成的特异性烟酰胺腺甘酸二核苷酸-依赖性去乙酰化酶-1(SIRT1)激活剂SRT1720可通过激活SIRT1抑制MTOR信号通路，从而抑制始基卵泡募集、卵泡成熟和闭锁，改善高脂饮食诱导肥胖小鼠的卵泡储备，从而延长小鼠卵巢寿命。这是申请人团队写的SIRT1在卵巢功能保护方面的综述，为探究干预该基因进而保护卵巢储备和功能提供理论支持。
文献“感染过表达Sirtuin1腺病毒对卵巢颗粒细胞的影响”中记载了外培养人卵巢原代颗粒细胞及KGN细胞系，感染过表达长寿蛋白-1(Sirtuin1)的腺病毒(Sirtuinl过表达重组腺病毒Sirtuinl-Adv购自生工生物工程有限公司)后，使用real-time PCR比较Foxo1、AMPK、AKT1、Pi3k、Caspase9相对表达水平，及自噬相关基因Atg5、mfn2、LC3B的相对表达水平。发现人卵巢颗粒细胞及传代KGN细胞系感染腺病毒过表达Sirtuin1后，Sirtuin1表达水平升高，Foxo1、AMPK、AKT1、Pi3k、Caspase9mRNA表达水平均同向降低。
虽然上述2篇文献涉及构建AdV-SIRT1重组载体及探究了其对小鼠卵巢及人卵巢的影响，但均是体外实验，未进行体内研究。且未对化疗药物诱导的小鼠卵巢损伤模型进行卵巢原位注射以探究其对卵巢的保护作用。
文献“SIRT1与化疗性卵巢功能早衰的相关性及研究进展”中描述了卵巢功能老化或衰竭涉及内在细胞自身衰老和外在环境应激诱发的衰老。化疗性卵巢损伤与年龄有关，随着年龄增加，卵巢功能损伤发生率逐渐增加。随着慢性炎症和衰老时氧化应激的发生，SIRT1水平和活性降低，SIRT1通过NAD+依赖的NDA修复酶PARP-1调节，氧化应激通过清除NAD+可能引起炎症、应激反应和细胞损伤。在卵巢，氧化应激损伤的增加导致卵母细胞破坏和卵巢功能下降。卵泡是卵巢的基本单元，颗粒细胞是维持卵巢功能的必要条件，研究发现Sirtuin在维持卵巢功能中起重要作用。Di Emidio G等研究发现，SIRT1可能通过调节氧化还原状态参与卵母细胞的成熟，同时MaR等发现老化的猪卵母细胞内SIRT1表达量明显减少，SIRT1可以抵抗猪卵母细胞衰老引起的氧化应激。王娜等发现饮食能量限制可抑制mTOR，激活SIRT1信号，从而抑制原始卵泡的激活，以及卵泡的发育与消耗，增加卵巢卵泡的储备量，以此延长卵巢寿命。故推测SIRT1信号通路可以调节卵泡生长发育。SIRT1转基因小鼠其性成熟延迟，而SIRT1基因缺陷小鼠不能生育，另有研究发现，SIRT1基因缺陷老鼠卵泡发育正常，仍不能有发情周期和排卵，可能与SIRT1缺陷导致激素内分泌缺陷所致，说明SIRT1能调控哺乳动物生殖系统的生殖和内分泌功能，进一步提示了SIRT1可能在延缓卵巢衰老中起关键作用，故我们推测SIRT1亦可在改善化疗性卵巢功能损伤中起重要作用。
然而上述文献只是推测SIRT1可能在改善化疗性卵巢功能损伤中起重要作用，并未做实质性探索，SIRT1在卵巢保护中的作用仍然未知。
基因治疗是一种针对基因缺陷或基因表达异常疾病的新型治疗，且通过将外源性基因导入细胞，纠正或补偿基因缺陷或基因表达异常引起疾病的新型治疗手段。现如今基因治疗不仅在癌症领域中有了长足的发展，也在罕见病方向尤其是单基因病与罕见性遗传病开展了较为广泛的临床研究，但在非单基因缺失非肿瘤性疾病领域的研究中尚且局限，且无针对化疗所致卵巢损伤的报道。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明公开了一种SIRT1在制备卵巢功能保护药物方面中的应用。具体是将腺病毒载体通过卵巢原位注射实现卵巢中基因上调，通过对损伤部位进行修复以实现对卵巢功能重建的目的。因此，AdV-SIRT1重组载体及其药物制剂可以在不影响抗癌效果情况下保护卵巢功能，其作为新型药物在修复卵巢损伤和/或对抗延缓卵巢衰老和/或改善卵巢储备功能和/或重建卵巢功能等方面发挥重要作用。
为实现上述目的，本发明公开了SIRT1在制备卵巢功能保护药物方面中的应用，所述卵巢功能保护包括修复卵巢损伤和/或对抗延缓卵巢衰老和/或改善卵巢储备功能和/或重建卵巢功能。
进一步地，所述卵巢功能保护为修复卵巢损伤。
进一步地，所述卵巢损伤包括年龄增长带来的卵巢损伤、因遗传或免疫功能缺陷或环境造成的卵巢损伤、医源性卵巢损伤或病理性卵巢损伤中的任意一种。
进一步地，所述药物是表达SIRT1蛋白质的重组核酸构建体，所述重组核酸构建体的表达载体是任何适用于基因治疗的表达载体，所述表达载体包括病毒载体或非病毒载体。
进一步地，所述病毒载体为腺病毒载体。
进一步地，所述药物的剂型为注射型。
进一步地，具体包括采用基因治疗手段对受试哺乳动物体的卵巢原位注射一定剂量的AdV-SIRT1，并检测SIRT1的过表达水平。
进一步地，所述受试哺乳动物体包括对照组及实验组，所述实验组为化疗性卵巢损伤实验组；所述对照组为生理盐水干预组。
进一步地，所述AdV-SIRT1的构建过程如下：
1)构建受试哺乳动物体的pENTER载体：将受试哺乳动物体的SIRT1基因片段通过PCR方式构建到穿梭载体pENTER上；
2)获取一定滴度的腺病毒：将步骤1)构建好的pENTER载体通过lipo2000转染体系转染至含有腺病毒骨架载体pAD-FH的HEK293细胞中，筛选并收集重组成功的阳性细胞，裂解细胞，收集病毒上清液，浓缩纯化，得到一定滴度的腺病毒；
3)腺病毒纯化：采用碘克沙醇密度梯度超速离心法对步骤2)的腺病毒进行纯化；
4)腺病毒滴度测定：所述腺病毒滴度为6.5×10E10 PFU/mL。
进一步地，所述受试哺乳动物体包括但不限于大鼠、小鼠、非人灵长类、人、犬、猫、马、牛、绵羊、猪、山羊，且优选小鼠。
此外，本发明还公开了一种卵巢功能保护药物，它包括AdV-SIRT1为主要原料及必不可少的药物载体。
有益效果：
1、本发明公开了将腺病毒载体通过卵巢原位注射进受试哺乳动物体实现卵巢中基因上调，通过对损伤部位进行修复以实现对卵巢功能重建的目的。其中，卵巢原位注射方法微创，手术切口较小且对小鼠生存没有明显影响，避免了尾静脉注射或腹腔注射方法中基因表达缺乏靶向性的缺点，同时也避免了腺病毒基因组不整合进入宿主细胞基因组，造成对其他器官的亲噬性，如噬肝性造成的肝毒性。
2、本发明设计的AdV-SIRT1重组载体及其药物制剂可以在不影响抗癌效果情况下保护卵巢功能，其作为新型药物在修复卵巢损伤和/或对抗延缓卵巢衰老和/或改善卵巢储备功能和/或重建卵巢功能等方面发挥重要作用。
附图说明
图1为阿霉素对小鼠卵巢造成的纤维化损伤和SIRT1蛋白质水平检测结果测试图；
图2为AdV-SIRT1原位注射进小鼠卵巢后的mRNA和蛋白质水平检测结果图；
图3为AdV-SIRT1原位注射进小鼠卵巢后的卵泡数、激素分泌情况、发情周期及卵巢储备功能测试图；其中，3A为采用HE染色，3B为实验组与对照组的卵泡数，3C为实验组与对照组的发情周期百分数，3D为实验组与对照组的雌二醇含量，3E为实验组与对照组的黄体酮含量，3F为实验组与对照组的卵巢储备功能。
具体实施方式
目前，因为年龄、遗传、免疫、医源性、病理性、环境、行为学、社会心理等多种因素可能造成哺乳动物体卵巢损伤和/或卵巢衰老，如何解决该技术问题实现对卵巢功能保护是本领域技术人员需要解决的技术问题。
术语的定义和使用
化疗：是化学药物治疗的简称，通过使用化学治疗药物杀灭癌细胞达到治疗目的。在临床上化疗药物也有不同的种类，根据其作用机制不同，可以分为烷化剂，抗代谢类，抗生素类，抗肿瘤药物，植物类抗肿瘤药物，激素类抗肿瘤药物，以及杂类的药物等。大部分患者需要联合使用两种以上的化疗药物治疗的，也包括口服化疗药物以及静脉用药等，另外，部分患者也可以采取介入的方式通过动脉灌注药物。
卵巢损伤：本发明主要指因为年龄、遗传、免疫、医源性、病理性、环境、行为学、社会心理等多种因素造成的损伤，具体的损伤结果包括肿瘤癌症、炎症、闭经、不孕、围绝经期症状等。
化疗相关卵巢损伤：本发明主要指因为药物化疗破坏卵泡及卵巢组织，引起卵巢功能损伤，不同程度出现月经紊乱、不孕，甚至出现卵巢早衰。其中，环磷酰胺等烷化剂对处于有丝分裂活跃的大卵泡有毒性，增加始基卵泡募集，对始基卵泡产生延迟损伤，导致卵巢原始卵泡和初级卵泡减少、卵巢纤维化、卵巢髓质破坏和卵巢体积缩小，最终使卵巢功能衰竭。抗癌药物可抑制颗粒细胞的功能，通过降低FSH、LH受体数目，引起卵巢功能低下或卵巢早衰。顺铂等化疗药物除抑制颗粒细胞外还诱导其凋亡，颗粒细胞的凋亡直接影响着卵泡的发育，从而导致卵泡发育异常、不排卵，甚至不孕。
卵巢衰老：主要包括因为DNA和表观遗传学修饰改变、端粒缩短和端粒酶活性下降、卵巢微环境的改变、氧化损伤产物的累积、卵巢细胞的凋亡和衰老、血管因素等引起的患者卵巢早衰现象。
改善或提高卵巢储备功能：本发明的卵巢储备功能指代卵巢皮质区中的原始卵泡发育成为可受精的卵母细胞的能力，目前临床上评估卵巢储备功能的指标主要有年龄、基础内分泌激素、细胞因子、基础窦卵泡数(AFC)等。
重建卵巢功能：让患者卵巢恢复正常生理功能，如正常的经期或者正常的生育能力。
药物载体：是指能改变药物进入人体的方式和在体内的分布、控制药物的释放速度并将药物输送到靶向器官的体系，具体如微囊与微球、纳米粒、脂质体等。
阿霉素：缩写为DOX，抗生素类药物，分子式为C27H29NO11，其抗瘤谱较广，适用于急性白血病(淋巴细胞性和粒细胞性)、恶性淋巴瘤、乳腺癌、支气管肺癌(未分化小细胞性和非小细胞性)、卵巢癌、软组织肉瘤、成骨肉瘤、横纹肌肉瘤、尤文肉瘤、母细胞瘤、神经母细胞瘤、膀胱癌、甲状腺癌、前列腺癌、头颈部鳞癌、睾丸癌、胃癌、肝癌等。
本发明主要研究了因化疗导致的卵巢损伤后对卵巢进行修复的策略。当前修复受损卵巢、保护卵巢生育功能的措施均为有创操作且适用范围有限，这些措施有的会耽误化疗，有的成功率低，有的可能导致继发性的癌症；同时，主要目的是保留生育能力的治疗方法，不太可能用于长期维持或者是重建卵巢功能。
具体技术方案如下：
本发明公开了SIRT1在制备卵巢功能保护药物方面中的应用，所述卵巢功能保护包括修复卵巢损伤和/或对抗延缓卵巢衰老和/或改善卵巢储备功能和/或重建卵巢功能。
进一步地，所述卵巢功能保护为对抗延缓卵巢衰老。
进一步地，所述卵巢功能保护为改善卵巢储备功能。
进一步地，所述卵巢功能保护为重建卵巢功能。
进一步地，所述卵巢功能保护为修复卵巢损伤。
进一步地，所述卵巢损伤包括年龄增长带来的卵巢损伤、因遗传或免疫功能缺陷或环境造成的卵巢损伤、医源性卵巢损伤或病理性卵巢损伤中的任意一种。
进一步地，所述药物是表达SIRT1蛋白质的重组核酸构建体，所述重组核酸构建体的表达载体是任何适用于基因治疗的表达载体，所述表达载体包括病毒载体或非病毒载体。
进一步地，所述病毒载体为腺病毒载体。
进一步地，所述药物的剂型为注射型。
进一步地，具体包括采用基因治疗手段对受试哺乳动物体的卵巢原位注射一定剂量的AdV-SIRT1，并检测SIRT1的过表达水平。
进一步地，所述受试哺乳动物体包括对照组及实验组，所述实验组为化疗性卵巢损伤实验组。本发明优选采用阿霉素对受试哺乳动物体的卵巢造成纤维化损伤。且所述对照组为生理盐水干预组。
进一步地，所述受试哺乳动物体包括但不限于大鼠、小鼠、非人灵长类、人、犬、猫、马、牛、绵羊、猪、山羊，且优选小鼠。
与此同时，本发明设计的AdV-SIRT1为采用如下重组载体方式获得：
1、在GenBank网站获得并分析小鼠SIRT1基因转录本编码区序列(NM_019812.3，2214bp)，设计PCR引物，序列如下表1：
表1引物序列列表
引物序列(5’-3’)
上游引物(F) TGATTGGCACCGATCCTCG
下游引物(R) CCACAGCGTCATATCATCCAG
将目的基因SIRT1基因片段通过PCR方式构建到穿梭载体pENTER上；其多克隆位点包括Asisl和Mlul；
2、将构建好的pENTER载体通过lipo2000转染体系转染至含有腺病毒骨架载体pAD-FH的HEK293细胞中，2个载体在细胞内发生同源重组，将目的基因片段重组至腺病毒骨架载体；同源重组后，通过amp抗性筛选到重组成功的阳性细胞，即含有插入目的基因序列的腺病毒骨架载体的细胞，骨架载体通过包装细胞293的辅助下，完成病毒包被，并释放出细胞；收集细胞并进行裂解细胞，收集病毒上清液，进行浓缩纯化，获得达到一定滴度的腺病毒；
3、利用碘克沙醇密度梯度超速离心法进行腺病毒纯化，首先预制碘克沙醇密度梯度层；在碘克沙醇密度梯度层上方加入腺病毒粗液；18℃，268000g下离心2.5小时；吸取40％碘克沙醇层的腺病毒，使用50K超滤浓缩离心管进行超滤，4000g，10℃，离心约1h；后将腺病毒液重悬于PBS中；
4、腺病毒滴度测定：取96孔板1块，每孔加入293T细胞10^4个，加液量200μL，置于培养箱24h，待测病毒用DMEM全培养基稀释至1～10^-8浓度。弃掉96孔板中原油的培养基，将稀释好的病毒依次加入空中，每孔200μL，每个浓度做两个复孔，同时设培养基对照(不含腺病毒)。再置于37℃、5％CO2条件下继续培养36h。用荧光显微镜对荧光阳性细胞进行计数，数出最后两孔的荧光细胞数，计算2个重复孔内的总数之和并计算出平均数，假设为A(倒数第二孔的荧光细胞平均数)和B(倒数第一孔的荧光细胞平均数)，具体如表2所示；
表2荧光细胞数列表
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
A 10μl 10<sup>0</sup> 10<sup>-1</sup> 10<sup>-2</sup> 10<sup>-3</sup> 10<sup>-4</sup> 10<sup>-5</sup> 10<sup>-6</sup> 10<sup>-7</sup> 10<sup>-8</sup>
B 10μl 10<sup>0</sup> 10<sup>-1</sup> 10<sup>-2</sup> 10<sup>-3</sup> 10<sup>-4</sup> 10<sup>-5</sup> 10<sup>-6</sup> 10<sup>-7</sup> 10<sup>-8</sup>
利用公式计算病毒滴度(BT＝PFU/mL,transducing units)：
Figure BDA0002970040140000101
按照上述公式计算扩增所得腺病毒滴度约为6.5×10E10PFU/mL。
5.测序验证：验证SIRT1是否已经插入pADM-FH的骨架载体中，将提取的重组载体送北京擎科新业生物技术有限公司进行测序。
此外，本发明还公开了一种卵巢功能保护药物，它包括AdV-SIRT1为主要原料及必不可少的药物载体。同时，该卵巢功能保护药物可制成冲剂、粉剂、膏剂、丸剂、口服液、注射液或胶囊中任意一种，本发明优选注射液。
为更好的解释本发明公开的技术方案，以下结合具体实施例进行详细说明。
实施例卵巢原位注射过表达实验
实验动物及材料：
1、实验动物：小鼠；来源、种系、品系：北京维通利华生物科技公司、近交系、C57BL/6。
育龄：8周大小。
2、实验材料：
水合氯醛：上海凌峰化学试剂有限公司；AdV-GFP：含绿色荧光蛋白基因的对照腺病毒；本发明优选其滴度为1.0×10E10PFU/mL；
体视显微镜：Olympus,型号：SZ61；
显微注射针：上海高鸽工贸有限公司10μL(尖头)型号：A124019。
步骤一、小鼠的麻醉：手术前小鼠禁食12小时，小鼠称重后，用1mL注射器吸取200μL的4％水合氯醛，对小鼠进行腹腔注射。然后将小鼠背部朝上放在无菌纱布垫上，四肢拉伸并固定在木板上，将小鼠绑定；
步骤二、暴露手术视野：用剃毛刀将小鼠背部剃毛，切口位于左右卵巢上方，在切口点处用75％酒精消毒，用镊子提起小该处鼠背部皮肤，用剪刀在背内侧和卵巢脂肪垫的正上方位置做一小切口，并相继剪开腹膜壁，将无菌盐水纱布垫放在切口附近，找到卵巢脂肪垫，轻轻将其向外拉，放于纱布上；
步骤三、插入显微注射针：在体视显微镜下，将酒精消毒后的显微注射针(30gauge,G)轻柔地插入卵巢囊的输卵管弯曲处，可见到针头在卵巢囊下；
步骤四、注射：吸取4～5μL制备好的AdV-SIRT1注入卵巢囊内作为实验组，AdV-GFP作为对照组。缓慢注射完毕，后迅速取出针头以封闭穿刺点，动作轻柔，不要撕裂卵巢囊。如果注射得当，应当可看到卵巢囊有轻微的扩张；
步骤五、实验结果探讨：将卵巢还纳回始解剖位置，利用可吸收缝合线缝合腹膜壁，肌层和皮肤；缝合后在手术切口处用碘伏消毒。将手术后的小鼠放置在加热垫上以避免体温过低可让小鼠休息复苏，加速恢复。监测小鼠的呼吸频率和舒适度以及可以自主移动的能力来评判术后的恢复效果。具体是在手术1周后，分别取实验组和对照组的卵巢，在体视显微镜下分离卵巢周围脂肪组织，一方面提取组织总RNA和蛋白质，利用qPCR和WB检测SIRT1的过表达水平，另一方面对卵巢进行冰冻切片免疫荧光和石蜡切片的免疫组化检测。
步骤六、重复上述操作，并在卵巢原位注射病毒后约2周左右对对照组和实验组均给予腹腔注射阿霉素(10mg/kg)造成卵巢损伤模型。具体操作如下述文献中记载；
1、Ben-Aharon,I.,et al.,Doxorubicin-induced ovariantoxicity.Reproductive biology and endocrinology:RB&E,2010.8:p.20.
2、Bar-Joseph,H.,et al.,In vivo bioimaging as a novel strategy todetect doxorubicin-induced damage to gonadal blood vessels.PloS one,2011.6(9):p.e23492.
其中，图1为阿霉素对小鼠卵巢所造成的纤维化损伤和SIRT1蛋白质水平检测结果，结合图1可知，阿霉素诱导的卵巢损伤包括纤维化程度增加，且SIRT1在mRNA和蛋白表达水平中下降。
结合图2可知，实验组小鼠相较于对照组，卵巢中SIRT1的mRNA和蛋白质水平有了较大程度提高。
结合图3可知，实验组小鼠相较于对照组，雌激素水平和AMH水平提高，卵泡计数发现闭锁卵泡数目下降，动情周期规律比例增加。这直接证实了将腺病毒载体通过卵巢原位注射进受试哺乳动物体中，卵泡内分泌功能和储备功能得到恢复，从而实现了对卵巢功能重建的目的。
综上所示，本发明将腺病毒载体通过卵巢原位注射实现卵巢中基因上调，通过对损伤部位进行修复以实现对卵巢功能重建的目的。因此，AdV-SIRT1重组载体及其药物制剂可以在不影响抗癌效果情况下保护卵巢功能，其作为新型药物在修复卵巢损伤和/或对抗延缓卵巢衰老和/或改善卵巢储备功能和/或重建卵巢功能等方面发挥重要作用。

Claims (3)

1.SIRT1在制备卵巢功能保护药物方面中的应用，其特征在于，
所述卵巢功能保护为对经阿霉素诱导的受试哺乳动物体的卵巢功能纤维化进行修复；
具体包括对受试哺乳动物体的卵巢原位注射一定剂量的Adv-SIRT1，并检测SIRT1的过表达水平；
所述Adv-SIRT1的构建过程如下：
1）构建受试哺乳动物体的pENTER载体：将受试哺乳动物体的SIRT1基因片段通过PCR方式构建到穿梭载体pENTER上；
2）获取一定滴度的腺病毒：将步骤1）构建好的pENTER载体通过lipo2000转染体系转染至含有腺病毒骨架载体pAD-FH的HEK293细胞中，筛选并收集重组成功的阳性细胞，裂解细胞，收集病毒上清液，浓缩纯化，得到一定滴度的腺病毒；
3）腺病毒纯化：采用碘克沙醇密度梯度超速离心法对步骤2）的腺病毒进行纯化；
4）腺病毒滴度测定：所述腺病毒滴度为6.5×10E10 PFU/mL。
2.根据权利要求1所述SIRT1在制备卵巢功能保护药物方面中的应用，其特征在于，所述药物的剂型为注射型。
3.根据权利要求1或2所述SIRT1在制备卵巢功能保护药物方面中的应用，其特征在于，所述受试哺乳动物体包括对照组及实验组，所述实验组为化疗性卵巢损伤实验组；所述对照组为生理盐水干预组。
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