RU2015124041A - Оптимизированная экспрессионная кассета для экспрессии полипептида с высоким выходом - Google Patents

Claims (67)

1. Экспрессионная кассета, подходящая для экспрессии представляющего интерес полипептида, содержащая:

a) промотор

b) полинуклеотидную последовательность 5'-UTR, где указанную полинуклеотидную последовательность 5'-UTR выбирают из группы, состоящей из:

i) полинуклеотидной последовательности 5'-UTR, содержащей следующую последовательность

ii) полинуклеотидной последовательности 5'-UTR, содержащей следующую последовательность

iii) полинуклеотидной последовательности 5'-UTR, содержащей следующую последовательность

iv) полинуклеотидной последовательности 5'-UTR, содержащей следующую последовательность

v) полинуклеотидной последовательности 5'-UTR, содержащей следующую последовательность

vi) полинуклеотидной последовательности 5'-UTR, содержащей следующую последовательность

vii) полинуклеотидной последовательности 5'-UTR, содержащей следующую последовательность

viii) полинуклеотидной последовательности 5'-UTR, содержащей последовательность, которая по меньшей мере на 85%, предпочтительно, по меньшей мере на 90% идентична последовательности, приведенной в SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6 или SEQ ID NO 7;

c) полинуклеотид, кодирующий секреторную лидерную последовательность hCD33; и

d) полинуклеотид, кодирующий представляющий интерес полипептид или инсерционный сайт для вставки полинуклеотида, кодирующего представляющий интерес полипептид.

2. Экспрессионная кассета по п. 1, где секреторная лидерная последовательность hCD33 состоит из последовательности MPLLLLLPLLWAGALA (SEQ ID NO 12).

3. Экспрессионная кассета по п. 1 или 2, где указанная экспрессионная кассета дополнительно содержит

e) последовательность 3'-UTR и/или

f) полиА-сигнал.

4. Экспрессионная кассета по п. 1 или 2, имеющая одну или несколько из следующих характеристик:

i) полинуклеотид, кодирующий представляющий интерес полипептид, кодирует в качестве представляющего интерес полипептида две или несколько субъединиц или доменов димерного или мультимерного белка, где по меньшей мере один IRES-элемент расположен между кодирующими областями отдельных субъединиц или доменов, и каждой кодирующей области предшествует секреторная лидерная последовательность hCD33;

ii) полинуклеотид, кодирующий представляющий интерес полипептид, кодирует в качестве представляющего интерес полипептида субъединицу или домен димерного или мультимерного белка;

iii) полинуклеотид, кодирующий представляющий интерес полипептид, кодирует в качестве представляющего интерес полипептида тяжелую или легкую цепь молекулы антитела или их функциональный фрагмент или производное;

iv) полинуклеотидная последовательность 5'-UTR содержит или состоит из SEQ ID NO 3, и полинуклеотид, кодирующий представляющий интерес полипептид, кодирует в качестве представляющего интерес полипептида легкую цепь молекулы антитела или ее функциональный фрагмент или производное;

v) полинуклеотидная последовательность 5'-UTR содержит или состоит из SEQ ID NO 1 или SEQ ID NO 4, и полинуклеотид, кодирующий представляющий интерес полипептид, кодирует в качестве представляющего интерес полипептида тяжелую цепь молекулы антитела или ее функциональный фрагмент или производное;

vi) полинуклеотидная последовательность 5'-UTR содержит или состоит из SEQ ID NO 5, и полинуклеотид, кодирующий представляющий интерес полипептид, кодирует в качестве представляющего интерес полипептида легкую цепь молекулы антитела или ее функциональный фрагмент или производное;

vii) полинуклеотидная последовательность 5'-UTR содержит или состоит из SEQ ID NO 6 или SEQ ID NO 7, и полинуклеотид, кодирующий представляющий интерес полипептид, кодирует в качестве представляющего интерес полипептида тяжелую цепь молекулы антитела или ее функциональный фрагмент или производное;

viii) экспрессионная кассета является моноцистронной экспрессионной кассетой;

ix) промотором, содержащимся в экспрессионной кассете, является промотор CMV человека, который выбирают из группы, состоящей из:

аа) промотора, содержащего следующую последовательность

или ее функционального фрагмента, который функционирует как промотор;

bb) промотора, содержащего последовательность, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности, приведенной в SEQ ID NO 8, или ее функциональному фрагменту, который функционирует в качестве промотора.

5. Экспрессионный вектор для экспрессии представляющего интерес полипептида, содержащий по меньшей мере одну экспрессионную кассету по одному или нескольким из пп. 1-4.

6. Экспрессионный вектор по п. 5, дополнительно содержащей один или несколько из следующих элементов:

a) по меньшей мере одну экспрессионную кассету, содержащую полинуклеотид, кодирующий селективный маркер;

b) по меньшей мере одну вторую экспрессионную кассету для экспрессии представляющего интерес полипептида.

7. Экспрессионный вектор по п. 6, содержащий по меньшей мере две экспрессионные кассеты, где каждая экспрессионная кассета содержит полинуклеотид, кодирующий представляющий интерес полипептид, причем полинуклеотид, содержащийся в одной экспрессионной кассете, кодирует тяжелую цепь молекулы иммуноглобулина или ее функциональный фрагмент или производное, а полинуклеотид, содержащийся в другой экспрессионной кассете, кодирует легкую цепь молекулы иммуноглобулина или ее функциональный фрагмент или производное.

8. Экспрессионный вектор по п. 7, где полинуклеотидная последовательность 5'-UTR из экспрессионной кассеты, кодирующей тяжелую цепь молекулы иммуноглобулина или ее функциональный фрагмент или производное, содержит или состоит из SEQ ID NO 1 или SEQ ID NO 4, и где полинуклеотидная последовательность 5'-UTR из экспрессионной кассеты, кодирующей легкую цепь молекулы иммуноглобулина или ее функциональный фрагмент или производное, содержит или состоит из SEQ ID NO 3.

9. Эукариотическая клетка-хозяин, содержащая по меньшей мере одну экспрессионную кассету по одному или нескольким из пп. 1-4 и/или по меньшей мере один экспрессионный вектор по одному или нескольким из пп. 5-8.

10. Клетка-хозяин по п. 9, где клетка-хозяин выбрана из группы, состоящей из клеток грызунов, клеток приматов и клеток человека, и где указанная клетка-хозяин, предпочтительно, является клеткой СНО.

11. Способ получения клетки-хозяина по п. 9 или 10, где экспрессионный вектор по одному или нескольким из пп. 5-8 вводится в эукариотическую клетку-хозяина.

12. Способ получения представляющего интерес полипептида, причем указанный способ включает культивирование клеток-хозяев по п. 9 или 10 в клеточной культуре при условиях, позволяющих экспрессию указанного представляющего интерес полипептида.

13. Способ по п. 12, где указанный представляющий интерес полипептид секретируется в клеточную культуральную среду и выделяется из клеточной культуральной среды, и выделенный полипептид, необязательно, дополнительно обрабатывают.

14. Способ по п. 12 или 13, где указанный полипептид представляет собой молекулу иммуноглобулина или ее фрагмент.

15. Применение последовательности 5'-UTR в комбинации с секреторной лидерной последовательностью hCD33 в экспрессионной кассете для экспрессии представляющего интерес полипептида с высоким выходом с указанной экспрессионной кассеты, где полинуклеотидную последовательность 5'-UTR выбирают из группы, состоящей из:

i) полинуклеотидной последовательности 5'-UTR, содержащей следующую последовательность

ii) полинуклеотидной последовательности 5'-UTR, содержащей следующую последовательность

iii) полинуклеотидной последовательности 5'-UTR, содержащей следующую последовательность

iv) полинуклеотидной последовательности 5'-UTR, содержащей следующую последовательность

v) полинуклеотидной последовательности 5'-UTR, содержащей следующую последовательность

vi) полинуклеотидной последовательности 5'-UTR, содержащей следующую последовательность

vii) полинуклеотидной последовательности 5'-UTR, содержащей следующую последовательность

viii) полинуклеотидной последовательности 5'-UTR, содержащей последовательность, которая по меньшей мере на 85%, предпочтительно, по меньшей мере на 90% идентична последовательности, приведенной в SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6 или SEQ ID NO 7.